Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus

Riepilogo

Descritto è una metodologia per quantificare l'espressione di 96 geni e 18 proteine di superficie da singole cellule ex vivo, che consenta l'identificazione di differenzialmente espressi geni e proteine in cellule infettate da virus rispetto a cellule non infette. Applichiamo l'approccio allo studio SIV-infettati CD4⁺ T cellule isolate da macachi rhesus.

Abstract

Analisi unicellulare è uno strumento importante per la dissezione popolazioni eterogenee delle cellule. L'identificazione e l'isolamento di cellule rare può essere difficile. Per superare questa sfida, una combinazione di metodologia indicizzati citometria a flusso e reazione a catena della polimerasi quantitativa multiplex di alto-rendimento (qPCR) è stato sviluppato. L'obiettivo era di identificare e caratterizzare il virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV)-cellule presenti all'interno di macachi rhesus infette. Attraverso la quantificazione della proteina di superficie ordinando fluorescenza-attivato delle cellule (FACS) e mRNA di qPCR, cellule infettate da virus sono identificate da espressione genica virale, che è combinata con misure di gene e la proteina di host per creare un profilo multidimensionale . Chiamiamo l'approccio, valutazione singola cellula Proteo-trascrizionale mirati o tSCEPTRE. Per eseguire il metodo, cellule vitali sono macchiate con anticorpi fluorescenti specifiche per gli indicatori di superficie utilizzati per l'isolamento di FACS di un sottoinsieme delle cellule e/o analisi fenotipica a valle. Singole celle vengono ordinate seguita dall'immediata Lisi, multisala trascrizione inversa (RT), pre-amplificazione di PCR e qPCR elevato throughput di fino a 96 trascrizioni. FACS misure sono registrate al momento dell'ordinamento e successivamente collegate a dati di espressione genica di ben posizionato per creare una proteina combinata e profilo trascrizionale. Per studiare la SIV-infettati direttamente cellule ex vivo, le cellule sono state identificate tramite rilevazione di qPCR di più specie di RNA virale. La combinazione di trascrizioni virali e la quantità di ciascuno forniscono un quadro per classificare le cellule in diversi stadi del ciclo di vita virale (ad es., produttivo contro non-produttiva). Inoltre, tSCEPTRE delle cellule SIV⁺ erano rispetto ai non infetti cellule isolate dallo stesso campione per valutare host differenzialmente espressi geni e proteine. L'analisi ha rivelato precedentemente incompreso eterogeneità di espressione RNA virale tra cellule infette come pure in vivo regolazione genica post-trascrizionale mediata SIV con cella singola ad alta risoluzione. Il metodo tSCEPTRE è rilevante per l'analisi di qualsiasi popolazione delle cellule suscettibili di identificazione dall'espressione della proteina di superficie marker(s), geni di host o agente patogeno o loro combinazioni.

Introduzione

Molti agenti patogeni intracellulari si basano su macchina cellula ospite per replicare, spesso targeting molto specifiche sottopopolazioni di cellule dell'ospite per massimizzare le loro possibilità di propagazione o alterare la biologia delle cellule ospite. Di conseguenza, i processi biologici delle cellule sono comunemente perturbati, con conseguenze deleterie per la salute generale dell'ospite. Comprensione delle interazioni tra virus e cellule dell'ospite in cui si replicano chiariranno i meccanismi di malattia che possono essere di aiuto nello sviluppo di terapie migliori e le strategie per prevenire l'infezione. Diretti strumenti analitici che permettono lo studio delle interazioni ospite-patogeno sono essenziali verso questo fine. Cella singola analisi fornisce l'unico mezzo per attribuire inequivocabilmente un fenotipo cellulare ad un particolare genotipo o infezione di stato¹. Ad esempio, infezioni da patogeni inducono frequentemente modifiche dirette e indirette in cellule ospiti. Pertanto, distinguendo le cellule infettate dalle loro controparti non infetti è necessario attributo host cella modifiche o infezione diretta o effetti secondari, come generalizzata infiammazione. Inoltre, per molti agenti patogeni, come SIV e virus di immunodeficenza umana (HIV), infezione delle cellule ospite procede attraverso fasi multiple, come presto, tardi, o latente, ognuno dei quali può essere caratterizzato da distinte gene e della proteina espressione profili^{2 , 3 , 4 , 5}. analisi di massa di miscele di cella non riuscirà a catturare questa eterogeneità⁶. Al contrario, altamente multiplexed analisi unicellulare in grado di quantificare l'espressione di entrambi virale e geni ospitanti offrono un mezzo per risolvere specifici di infezione cellulare perturbazioni, comprese le varianti attraverso fasi di infezione. Ulteriormente, analizzando fisiologicamente interazioni ospite-patogeno in impostazioni rilevanti è fondamentale per l'identificazione di eventi che si verificano negli organismi infetti. Così, metodi che possono essere applicati direttamente ex vivo sono probabilmente migliori cattura in vivo i processi.

SIV e HIV CD4 di destinazione⁺ T cellule, in cui essi neutralizzare fattori antivirali "restrizione" ospite e downregulate antigene che presenta molecole per stabilire l'infezione produttiva ed evitare la sorveglianza immune^{7,8, 9,10,11}. Senza trattamento, l'infezione si traduce in perdita massiccia di CD4 cellule⁺ T, in ultima analisi si conclude con acquistata di immunodeficenza (AIDS) la sindrome¹². L'impostazione della terapia antiretrovirale, serbatoi latente infettate delle cellule persistono per decenni, che propone una formidabile barriera alle strategie curative. Comprendere le proprietà delle cellule in vivo HIV/SIV-infettati ha il potenziale per rivelare caratteristiche della cellula ospite strumentale nella patogenesi e persistenza. Tuttavia, questo è stato molto impegnativo, soprattutto dovuto le evacuazioni delle cellule infettate e mancanza di reagenti in grado di identificare prontamente. Cellule che trascrivono RNA virale, sono valutati per essere presente al 0,01 – 1% di CD4⁺ T cellule nel sangue e tessuto linfoide^13,14,15. Sotto terapia soppressiva, cellule latente infettate sono anche meno frequenti al 10^-3-10^{-7 16,17,18}. Colorazione delle proteine virali saggi che lavorano bene per studiare in vitro infezioni, ad esempio per Gag intracellulare, sono non ottimale a causa di una colorazione di fondo di 0,01 – 0,1%, simile o maggiore della frequenza di cellule infettate^{13, 14}. Marcatura di superficie per la proteina Env usando gli anticorpi monoclonali SIV/HIV Env-specifici ben caratterizzati inoltre ha dimostrato di essere difficile, probabilmente per motivi analoghi. Recentemente, nuovi strumenti mirano a migliorare la rilevazione di cellule esprimenti Gag da uno che incorporano dosaggi specifici per bavaglio RNA o utilizzando alternativo imaging technologies^14,15,19. Tuttavia, tali approcci rimangono limitati nel numero di misurazioni quantitative eseguite su ciascuna cella.

Qui, descriviamo la metodologia che (1) identifica singole cellule infettate da virus direttamente ex vivo di qPCR quantitativa sensibile e specifico gene virale e (2) quantifica l'espressione di proteine di superficie fino a 18 e 96 geni per ogni infettati (e delle cellule non infette). Questa metodologia combina la misurazione di cella singola proteina di superficie di FACS seguita da lisi cellulare immediato e analisi di espressione genica utilizzando multiplexed qPCR mirata sull'apparato Biomark. La tecnologia del circuito integrato fluidico (IFC) consente di multiplex quantificazione di 96 geni da 96 campioni contemporaneamente, compiuta da una matrice di 9.216 alloggiamenti in cui vengono eseguite le reazioni individuali qPCR. L'ordinamento di cellule vive FACS registra ad alto contenuto proteico abbondanza misure mentre conservando l'intero trascrittoma per analisi eseguita immediatamente a valle. Per identificare le cellule infettate da virus, specifici saggi per alternativamente impiombate e unspliced virali RNA (vRNA) sono inclusi nell'analisi qPCR, insieme a un pannello di analisi definite dall'utente per un totale di fino a 96 geni, il numero massimo di analisi attualmente alloggiati in l'IFC. L'espressione genica e proteica informazioni raccolte per ogni cella sono collegate da ben posizionato. Precedentemente abbiamo segnalato i risultati di questa analisi altrove²⁰. Qui, forniamo più dettagliate linee guida metodologiche, nonché ulteriormente descrittivo fenotipizzazione di SIV-infettati CD4⁺ T cellule.

Questo approccio, che chiamiamo tSCEPTRE, può essere applicato per le sospensioni di qualsiasi popolazione di cellule vitali reattivo agli anticorpi fluorescente identificati e che esprimono un transcriptome compatibile con saggi qPCR disponibili. Ad esempio, può essere utilizzato per la caratterizzazione genica differenziale ed espressione della proteina in cellule rare o cellule non facilmente distinguibili dai marcatori di proteina di superficie. La preparazione del campione si basa su uno standard di protocollo utilizzando anticorpi commerciali di colorazione. Citometri con cella singola funzionalità di ordinamento sono anche disponibili in commercio, ma biosicurezza ulteriori precauzioni sono necessarie per l'elaborazione di cellule vive infettive. Registrare il profilo di espressione di proteina delle cellule di singolo – per ogni cella di posizione ben, qui indicato come indicizzato l'ordinamento, è una caratteristica comune di FACS commercialmente disponibile software di ordinamento. Analisi computazionale di geni differenzialmente espressi ospitanti tra popolazioni cellulari di interesse non è descritto qui, ma vengono forniti riferimenti ai metodi precedentemente pubblicati.

Protocollo

Nota: Lo schema di flusso di lavoro protocollo è illustrato nella Figura 1. Si compone di tre fasi principali: FACS, RT e pre-amplificazione del cDNA e qPCR per fino a 96 geni contemporaneamente. Due versioni del protocollo, ordinamento celle in diluizioni di limitazione e l'ordinamento di singole cellule, sono descritti più dettagliatamente nei passaggi 5 e 6, rispettivamente. Queste strategie di affrontare questioni di ricerca differenti ma seguono procedure simili.

1. prerequisiti o previa analisi

1. Convalidare tutte le analisi di espressione genica per essere utilizzato come precedentemente descritto⁶.
   Nota: Questo passaggio è fatto bene in anticipo rispetto alla data di esperimento. Convalida tutte le analisi, commerciale e personalizzato, è necessario per garantire l'amplificazione efficiente e lineare di RNA rilevante fino al livello di singola cellula. Molti saggi commercialmente disponibili e personalizzati non soddisfano queste specifiche. Elaborazione e adattamento delle curve automatizzato per qualificazione simultanea delle analisi di espressione di geni fino a 96 sono disponibili in File di codifica supplementare 1 – 5, ma dosaggi individuali possono essere qualificati utilizzando R² e pendenza del fit lineare. Trame di qualificazione rappresentativo test riusciti e non riusciti sono mostrati nella Figura 2.
2. Sviluppare un pannello di cytometric di flusso degli anticorpi a macchiare gli indicatori di superficie delle cellule di interesse.
   1. Titolare gli anticorpi macchiando un esempio pertinente, ad esempio, rhesus cellule mononucleari sangue periferico (PBMCs), con ogni anticorpo. Iniziare con 20 µ l di anticorpo per ogni test in 100 µ l reazione di colorazione e creare otto diluizioni seriali. Identificare la concentrazione ottima che presenta la massima intensità di colorazione pur mantenendo una netta separazione tra le popolazioni di negative e positive.
   2. Valutare la macchiatura combinato su campioni di cellule supplementari utilizzando la miscela di tutti gli anticorpi alla concentrazione ottima determinata al punto 1.2.1. Assicurarsi che la colorazione sia simile a quello osservato per le macchie dell'anticorpo specifico. Se la colorazione è meno di quanto si osserva quando qualsiasi anticorpo è stato usato in isolamento, prendere in considerazione l'alternativo fluorocromi coniugati per sostituire tali anticorpi.

2. Gene Expression Assay preparazione

1. Espressione genica combinare 96 saggi in un RNasi/dnasi-libero tubo 1 – 15 mL (dimensioni possono variare con il numero di piastre di sorta). Il pannello di analisi utilizzato in questo studio è specificato nella tabella 1 e tabella 2. Il materiale risultante è denominato il "Mix di dosaggio". Aggiungere ogni dosaggio a una concentrazione finale di 180 nM di primer forward e reverse. Aggiungere DNA sospensione Buffer per ottenere la diluizione appropriata del Mix Assay.
   Nota: Per scopi pratici, scorte di dosaggio personalizzato (generati dall'utente) possono essere preparate a 18 µM per essere coerente con la concentrazione di saggi di commercialmente disponibile "x 20" gene expression qPCR (Tabella materiali). 18 mix µM di primer forward e reverse personalizzato per ogni gene sono costituiti da soluzioni di riserva nel Buffer di sospensione di DNA. Le analisi disponibili in commercio (Tabella materiali) includono anche sonde, ma sonde non sono necessari per RT o pre-amplificazione del cDNA e può quindi essere omesso per analisi personalizzate. Si raccomanda di includere uno o più geni housekeeping per utilizzano nel controllo di qualità per valutare l'efficienza di cernita, il recupero delle cellule e la sintesi del cDNA. Uso degli iniettori casuali per generare cDNA non è stata determinata, ma dovrebbe essere meno efficiente che gli iniettori di gene-specific.
2. Preparare il 2 x piastra di test da utilizzare nel passaggio 7.1 (multisala qPCR). Per ogni matrice di 96x96 chip anticipato, pipettare 6 µ l di ogni dosaggio in ogni area bene di una piastra PCR a 96 pozzetti. Ad esempio, per 5 fiches, 30 µ l di ogni dosaggio occuperà un singolo pozzo della piastra a 96 pozzetti. Se si utilizza 96 saggi, ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti conterrà un saggio. Sigillare la piastra con guarnizione adesiva.
   Nota: Idealmente, punti 2.1 e 2.2 vengono eseguite contemporaneamente, per evitare più cicli di congelamento-scongelamento per le analisi di espressione genica. Tutti i geni all'interno della placca del dosaggio devono essere anche stato presenti nel Mix Assay (punto 2.1). Sia il mix di dosaggio e la piastra di dosaggio possono essere memorizzati a-20 ° C o 4 ° C per uso a breve o lungo, rispettivamente.

3. superficie macchia cellule vitali

Nota: Colorazione intracellulare, permeabilizzazione e fissazione non sono compatibili con questo metodo come compromettono la RNA.

1. Preparare i campioni di compensazione con l'aggiunta di ogni anticorpo elencato nella Tabella materiali a 40 µ l di perle di compensazione a concentrazione 2,5 volte superiore rispetto a quella utilizzata per la macchiatura delle cellule. Incubare per 20 minuti a 25 ° C al riparo dalla luce. Aggiungere 3 mL di PBS per le perline e centrifugare a 500 x g per 3 min a 25 ° C. Aspirare il PBS e risospendere le sfere in ~ 300 µ l di PBS.
2. Preparare il classificatore celle cytometric di flusso per l'elaborazione del campione: acquisire tubi di compensazione, creare la matrice di incremento retributivo e applicare la matrice per i file di acquisizione per i campioni sperimentali.
3. Preparare il mix master di anticorpo fluorescente cocktail unendo il volume appropriato di ciascun anticorpo come specificato in di Tabella materiali, in un tubo di 1,5 mL ambra per tutti i campioni essere macchiato. Vortex e centrifugare il cocktail a 21.000 x g per 2 minuti a 25 ° C a pellet l'anticorpo aggrega.
   Nota: Gli anticorpi usati qui sono elencati nella Tabella materiali.
4. Scongelare le cellule crioconservate in bagnomaria a 37 ° C per 2 min. aggiungere 0,5 – 2 mL della sospensione delle cellule a 12 mL di PBS in una provetta da 15 mL, centrifugare a 500 g per 3 min a 25 ° C e aspirare il PBS. Risospendere in 3 mL di PBS e trasferirlo in una provetta di polistirene da 5 mL. Centrifugare come sopra e aspirare il PBS, lasciando ~ 20 µ l PBS residuo.
   Nota: La temperatura di colorazione può essere adattata a temperature più calde o più fredde come necessario per applicazioni specifiche modificando la titolazione di anticorpi macchiatura condizioni di conseguenza (Vedi punto 1.2).
5. Risospendere fino a 2 x 10⁷ lavato le cellule a 80 µ l di anticorpo cocktail e incubare per 20 minuti a 25 ° C al riparo dalla luce. Per campioni superiori a 2 x 10⁷ cellule, aumentare il volume di reazione di macchiatura di conseguenza per mantenere < 2 x 10⁷ cellule/100 µ l.
6. Lavare le cellule con l'aggiunta di 3 mL di PBS, centrifugazione a 500 x g per 3 min e aspirare il supernatante.
7. Accuratamente e risospendere le cellule in 300 – 500 µ l di PBS e filtro pipettando attraverso un cappuccio filtro cella di 35 µm in nylon. Mantenere le cellule sul ghiaccio e al riparo dalla luce fino a quando l'ordinamento.

4. preparare piastre di raccolta di cellulari, sorta di FACS eseguire e generare cDNA

1. Combinare i componenti della miscela di reazione di RT-preamplificatore (tabella 3) pipettando in una singola provetta sterile privo di RNAsi e dnasi.
   Nota: Questo passaggio può essere eseguito prima o durante la colorazione nel passaggio 3. L'enzima RT può essere omessa qui per determinare il contributo del modello del DNA da qPCR segnale.
2. Utilizzare una pipetta multicanale per dispensare 10 µ l di miscela di reazione di RT-preamplificatore nel numero desiderato di piastre da 96 pozzetti PCR sorta insieme. Sigillare le piastre con pellicola adesiva e posizionare le piastre su blocchi pre-refrigerati 96 pozzetti in alluminio.
3. Stabilire la cella ordinamento gating schema sul citometro a flusso con l'acquisizione di dati da circa 20.000 cellule del campione macchiato. Assicurarsi che la matrice di compensazione viene applicata ai dati raccolti. Cancelli di disegnare e definire l'albero gating che identifica la popolazione cellulare di interesse per essere isolato per analisi dell'espressione genica.
   Nota: Il gating albero utilizzato per la raccolta di potenziali SIV vRNA⁺ celle è illustrato nella Figura 3.
4. Immettere le impostazioni dello strumento appropriato per specificare il numero e il sottoinsieme delle celle vengano ordinati in ciascun pozzetto. Ulteriori istruzioni dettagliate per l'ordinamento o una serie di diluizioni di cella di limitazione o di singole cellule sono fornite nei passaggi 5 e 6, rispettivamente.
5. FACS ordinare le celle in preparati piastre da 96 pozzetti PCR collezione. Rimuovere il sigillo adesivo prima dell'ordinamento e sostituire con un sigillo fresco seguendo l'ordinamento.
   Nota: Tenere le piastre su blocchi di alluminio pre-refrigerati in ogni momento, anche durante l'ordinamento.
6. Immediatamente dopo l'ordinamento, vortex e centrifugare la collezione piastra a 2.000 x g per 1 min a 4 ° C.
7. Thermocycle la piastra in una macchina PCR con un coperchio preriscaldato usando le seguenti condizioni: 50 ° C per 15 min (RT), 95 ° C per 2 min, seguiti da 18 cicli di 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 4 min (pre-amplificazione).
8. Diluire il cDNA 1:5 trasferendo 5 μL di cDNA in 20 µ l di tampone di sospensione di DNA in una nuova piastra per PCR a 96 pozzetti. CDNA diluito può essere conservato a 4 ° C o -20 ° C a tempo indeterminato a questo punto. Il cDNA è ora pronto per essere utilizzato come modello per qPCR (passaggi 5.2, 7,4).
   Nota: Questa diluizione assicura che i primer presenti nella reazione di RT-preamplificatore non contribuiscono alla qPCR a valle.

5. variazione a: FACS ordinamento celle in una serie di diluizioni limitando per determinare la frequenza di vRNA⁺ cellule o eseguire il controllo di qualità sperimentale

Nota: Prima di eseguire una sorta di cella singola, potrebbe essere utile per determinare la frequenza delle cellule di interesse, ordinando le cellule in diluizioni seriali a replicare. Questo passaggio fornisce anche di preziosa qualità controllo per ordinamento efficienza, lisi cellulare, recupero di RNA e sintesi di cDNA, come descritto al punto 5.3. Previa determinazione della frequenza delle cellule vRNA⁺ consente una stima più accurata del numero di singole cellule che devono essere ordinati per ottenere sufficiente dimensione del campione per analisi di espressione genica delle cellule opportunamente alimentato vRNA⁺ .

1. FACS ordinare le celle in piastre a 96 pozzetti preparate come passaggi 4.1 – 4.2 e raccogliere 1 – 1.000 cellule per pozzetto in più repliche.
   Nota: Il numero di pozzetti replicare ad ogni diluizione delle cellule è in genere associato inversamente con la concentrazione di cellule per pozzetto. Quando la frequenza di cellula infettata è ben di sotto di 1%, diluizioni di cella dovrebbero concentrarsi su 100 – 1.000 cellule per pozzetto. Un esempio di mappatura per piastra sorta è fornito nella Figura 1, in alto a sinistra. Superiore a 1.000 cellule per pozzetto deve essere evitato a causa del conseguente aumento del volume di reazione e l'interferenza con la sintesi del cDNA a valle e quantificazione.
2. Combinare i reagenti qPCR in una soluzione di mix master in tabella 4. Per un volume di reazione di 25 µ l, 22,5 µ l di master mix è combinato con 2,5 µ l di modello di cDNA diluito dal punto 3.9. Eseguire la qPCR utilizzando condizioni standard in bicicletta (ad es., 94 ° C per 5 min, seguiti da 40 cicli di 94 ° C per 15 s e 60 ° C per 1 min).
   Nota: Reazioni di qPCR Singleplex utilizzando uno strumento convenzionale qPCR in tempo reale sono raccomandate come un'analisi economica preliminare di uno o pochi saggi per dimostrare efficiente cella ordinamento, recupero di RNA e sintesi del cDNA. Può essere utilizzato anche per calcolare la frequenza delle cellule vRNA⁺ . Le reazioni di qPCR multiplex utilizzando il Biomark sono in genere più appropriate per analisi unicellulare su larga scala.
3. Per il controllo qualità, trama Et valori (Et = −_max Ct Ct) contro i numeri delle cellule ordinati per pozzetto su una scala di₁₀ registro e applicare un'analisi di regressione lineare.
   Nota: Replica coerente, pendio di regressione lineare di 3.3 (± 0,3) e R² > 0,9 sono indicativi di un esperimento efficiente. Esempi di ordinamento ottima e non ottimale, esperimenti di RT-preamplificatore sono mostrati in Figura 4.
4. Per determinare la frequenza delle cellule vRNA⁺ , tracciare numeri di cell ordinati per pozzetto su asse x (scala logaritmica₁₀ ) e la frazione di pozzetti positivi per vRNA ad ogni diluizione cellulare sull'asse y. Per un esempio, vedere la Figura 1 (inferiore sinistro, distribuzione di Poisson). Applicare un modello di regressione lineare per i dati per determinare il numero di celle che porto una cella positiva in media, corrispondenti a 63,2% di pozzetti positivi (0,632 sull'asse y)²¹. Questo numero di diluizione delle cellule (intercetta asse x) convertendoli in frequenza espressa in percentuale. Ad esempio, una cella di vRNA⁺ a 48 celle equivale a una frequenza di 2.1%.

6. variazione b: cellule di FACS sorta per cella singola analisi

1. Seguire procedura 4.1 – 4.8 e specificare una cella ordinata al bene utilizzando funzionalità di ordinamento indice del citometro a flusso creare singoli file di FCS per ogni cella ordinati, mappato da ben posizionato.
   Nota: Se il numero di piastre di raccolta sorta supera il numero di thermocyclers disponibili, escursioni in bicicletta può essere interrotto dopo la fase di inattivazione della trascrittasi inversa (95 ° C per 2 min) e cDNA può essere conservato a 4 ° C fino al thermocyclers sono disponibili. In questo caso, iniziare la pre-amplificazione al primo ciclo di 95 ° C per 15 s.
2. Facoltativo: Creare cDNA "piscine" composto da cDNA da lotti definiti dall'utente di singole cellule a schermo per le cellule rare di interesse usando il cDNA non diluito residuo. Trasferire 2 µ l di non diluito unicellulare preamplificato cDNA mediante pipetta multicanale in una nuova piastra a 96 pozzetti. Ripetere di pipettaggio 2 µ l di cDNA da tutte le altre singole cellule di un pool designato nello stesso. Piscine di cDNA per geni di interesse (ad es., vRNA) per determinare quelli che contengono cellule positive utilizzando qPCR convenzionale a schermo. Poiché pool richiede solo una piccola aliquota di cDNA da ogni cella, il restante ~ 8 µ l di cDNA è ancora disponibile per l'analisi di singole cellule.
   Nota: Strategie di Pooling sono raccomandate prima di eseguire l'analisi di espressione genica di cella singola nel tentativo di ridurre il numero di singole cellule interrogato da risorse multisala qPCR. È adatto a situazioni in cui le celle di interesse (ad es., SIV mRNA +) possono essere identificate da un'analisi di qPCR preliminare single-plex. Strategie di alto-rendimento semplice di creare pool di cDNA includono 2 µ l di cDNA non diluito da una piastra di raccolta sorta (cioè, 12 tutte le celle nella riga A) righe o colonne (vale a dire 8 tutte le celle nella colonna 1), la combinazione in un singolo pozzo in una nuova piastra. Per determinare la migliore strategia di pool, considerare la frequenza prevista di celle di interesse dal punto 5.4. Ad esempio, se il 10% delle cellule dovrebbero essere positivi, piscine comprende da sei campioni di cDNA unicellulare frequentemente sarà negative e celle rappresentate in quella piscina possono quindi essere escluse dalle analisi unicellulare a valle.

7. multiplex qPCR sulla piattaforma Biomark

Nota: Questa sezione può seguire versione A o B sopra descritto. Nello studio descritto nel presente documento, è stato applicato esclusivamente all'analisi di singole cellule.

1. Preparare la piastra di analisi qPCR di pipettaggio 4 µ l di ogni dosaggio da 2 x piastra di dosaggio (preparata al punto 2.2) in una nuova piastra PCR a 96 pozzetti contenente 4 µ l di dosaggio reagenti in ciascun pozzetto di carico. Mantenere la piastra di dosaggio a 4 ° C.
   Nota: La piastra di dosaggio è stabile a 4 ° C fino a una settimana e a-20 ° C per un mese. Così, può essere utile preparare materiale sufficiente per diversi chip e conservare in modo appropriato.
2. Versare i liquidi della linea di controllo dalle siringhe di adescamento nelle valvole di due aspirazione del chip. Rimuovere la plastica protettiva da sotto la piastra. Posizionare il chip su un controller IFC con il lato dentellato nella posizione A1. Dal menu principale, selezionare lo script di "Prime". Eseguire lo script.
3. Preparare la miscela di reazione in tempo reale con 50 µ l di reagente con 500 µ l di PCR Master Mix (Tabella materiali) per ogni chip microfluidici di carico del campione. Pipettare 4,4 µ l in ogni pozzetto di una piastra di PCR 96 pozzetti, d'ora in poi indicata come il "piatto del campione".
4. Pipettare 3,6 µ l del cDNA diluito 1:5 da passo 4.8 nel piatto del campione contenente la miscela di reazione in tempo reale.
   Nota: Se un down di PCR-selezione è stata effettuata per schermo per rari (ad es., vRNA⁺) cellule per l'analisi a valle come descritto al punto 6.2, includere solo le celle rappresentate nelle piscine positive.
5. A seguito del completamento di priming di chip, caricare le insenature di chip di erogazione 5 µ l dalla piastra di dosaggio nella corrispondente anche sul lato dentellato (analisi) del chip e 5 µ l dal piatto del campione nella corrispondente anche sul lato opposto (esempio) del chip. Inserire il chip nel controller IFC ed eseguire lo script "Caricare mix".
6. Trasferimento il chip per la piattaforma Biomark per eseguire la qPCR multiplex. Procedere con la messa in funzione e la programmazione di qPCR seguendo le istruzioni dettagliate fornite dal software analisi di PCR in tempo reale e utilizza il protocollo di espressione di Gene (GE) 96.96 Standard v. 1 con 40 cicli di PCR. Salvare il file di ChipRun in una cartella designata.
   Nota: Diversi chip può essere eseguito al giorno e di più giorni.
7. Analizzare i dati di qPCR.
   1. Aprire il Software di analisi PCR in tempo reale. Aprire il file "ChipRun.bml" dal "File | Menu Apri".
   2. Individuare "Chip Explorer" e "Chip Run Riassunto" nell'angolo superiore sinistro della finestra del software. Identificare i tre componenti del Chip eseguire Riassunto: visualizzazioni di analisi, installazione di esempio e rilevatore di installazione.
   3. Fare clic su "Setup rivelatore". In "Task", fare clic su "Nuovo" e selezionare tipo di contenitore "piatto SBS" e formato contenitore "SBS96". Accanto alla "Mappatura", fare clic sul... pulsante e selezionare "M96-test-SBS96.dsp".
      1. Facoltativo: Assegnare ogni rivelatore (analisi) di un numero o un nome nella sezione "nome" di ciascun pozzetto facendo doppio clic sul 1^st bene. Spostare il prossimo bene premendo "F2".
   4. Fare clic su "Installazione di esempio". In "Task" accanto a "Mapping", fare clic sul... pulsante e selezionare "M96-campione-SBS96.dsp".
   5. Fare clic su "Visualizzazioni di analisi". In "Attività" nella scheda "qPCR", selezionare "Correzione della linea di base per lineare (derivato)" e "Metodo di soglia Ct per utente (rivelatori)". Nella scheda "Ct soglie", controllare la "Initialize con box Auto". Fare clic sul pulsante "Analizza" sopra.
   6. Nel quadrante superiore di destro di "Analisi visite", fare clic sulla seconda scheda "Tabella dei risultati". Dal menu a discesa, selezionare "Visualizzazione mappa di calore". Verrà visualizzata la mappa di calore con dati.
      1. Facoltativo: Per garantire fluorescenza ROX uniforme attraverso il chip, selezionare "Visualizza immagine" invece di "Calore mappa vista" dallo stesso menu. Nel secondo dalla finestra a destra sopra la mappa di calore, selezionare "ROX". Nel primo da finestra di destra, selezionare uno dei cicli di 1 – 40. Fare clic sul quarto dalla finestra a destra per passare alla visualizzazione in bianco e nero di fluorescenza di ROX. L'immagine apparirà che informa splatters, particelle, o difetti sul chip. Se l'uniformità ROX grossolanamente è oscurata, eseguire nuovamente il chip.
   7. Sotto la mappa di calore, fare clic su "Log grafico" e "Soglia". Modificare le soglie di Ct manualmente per ogni rivelatore cliccando su saggi (colonne della mappa calore) e trascinando la soglia come necessario si intersecano le curve di amplificazione nella fase esponenziale. Al termine, fare clic su "Analizza".
8. Esportare i dati di qPCR come file CSV. Importare i dati in un foglio di calcolo o software di analisi statistica (ad esempio, JMP) e mappare i risultati dalle posizioni del campione e l'analisi sul chip. Organizzare le cellule in gruppi basati sull'espressione di geni virali, creando una nuova colonna e utilizzando una formula condizionale. Sotto "Analizza", selezionare "Fit Y di X" e tracciare l'espressione genica contro il gruppo. Applicare l'analisi statistica.
   Nota: Rappresentanza cella singola espressione quantitativa delle quattro specie di SIV RNA è raffigurato nelle piazzole bivariate in Figura 5A. Espressione genica quantitativa ospite in cellule SIV RNA⁺ è mostrato in figura 5B.
9. Estrarre i valori dell'espressione quantitativa della proteina dai dati di cella singola FACS.
   1. Aprire il FCS file dal FACS ordinamento (punto 6.1) corrispondente alla piastra a 96 pozzetti utilizzando FlowJo versione 9. Con il nome di file evidenziato, selezionare "piattaforma | Evento numero porta | Creare indicizzata sorta gates". Singole celle appariranno visualizzate da riga.
   2. Evidenziare tutte le 96 celle (non righe) e selezionare "area di lavoro | Esportare | Selezionare tutto compensato fluors". In "Tipo di dati", selezionare "file FCS", fare clic su "Esporta" e selezionare una cartella designata.
   3. Trascinare i nuovi file. FCS per le singole celle in una nuova area di lavoro FlowJo. Evidenziare tutte le celle, fare clic su "Aggiungere statistiche" (il pulsante "Σ" in alto a sinistra) "| Dire | Tutti i parametri di fluor".
   4. Aprire "Table Editor" facendo il quarto pulsante da sinistra in alto a sinistra. Evidenziare tutti i neon della prima cella e trascinarli nella finestra dell'editor di tabella. Nella finestra dell'editor di tabella, fare clic sul pulsante stesso nella parte superiore "Crea e visualizza tabella". Questo creerà una tabella di 96 celle e un parametro numerico per ogni fluor.
   5. Copiare l'output in un software di database (ad esempio, MS Excel, JMP), o copia/incolla o facendo clic su "Salva e avvia applicazione" (quarto da pulsante sinistro sopra la tabella).
      Nota: Questa procedura è specifica per FlowJo versione 9. FlowJo versione 10 utilizza una procedura diversa per importare dati indicizzati. Indicizzata flusso dati possono anche essere copiato/incollato in JMP direttamente dai file CSV creato dal Classificatore celle.
10. Unire i dati di cella singola FACS e qPCR dati per il numero di targa e ben posizionate. Eseguire analisi grafiche e statistiche sul gene unicellulare combinato (qPCR) e dati di espressione (FACS) della proteina.
    Nota: Esempi di singole cellule combinato qPCR e FACS dati sono mostrati in Figura 6 (host di profili di espressione della proteina di superficie per le cellule di macaco rhesus SIV-infettati, impiombato vRNA⁺ ), Figura 7 (CD4 espressione genica contro superficie CD4 espressione della proteina in cellule di macaco rhesus impiombato vRNA⁺ ) e precedentemente pubblicato²⁰. Per identificare differenzialmente espressi geni in popolazioni di cellule di interesse, analisi unicellulare metodi descritti in precedenza sono consigliati^20,22,23,24, che rappresentano il la proporzione di cellule positive per un gene così come il valore dell'espressione genica di continuo.

Risultati

Il flusso di lavoro per l'intero protocollo è descritto in Figura 1. Si compone di due variazioni definite dal numero di celle filtrate: o diluizione limitante o come singole cellule, come descritto nel testo. Nella Figura 2vengono illustrati esempi di analisi di qualificazione primer-sonda su 2 volte diluizioni seriali di RNA. La strategia di gating per identificare potenziali cellule SIV⁺ è illustrata nella

Discussione

Il protocollo descritto qui, chiamato tSCEPTRE, integra la quantificazione di cella singola proteina di superficie mediante citometria a flusso multiparametrica con espressione quantitativa del mRNA unicellulare di altamente Multiplex RT-qPCR. L'Unione di queste due tecnologie consente ad alto contenuto istantanee della combinata trascrizionale e profilo proteico delle singole cellule in un formato ad alta velocità. Usiamo il metodo per identificare le celle precedentemente sfuggente infettate con SIV in vivoe ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD