Un metodo semplificato ed efficiente per isolare i Keratinocytes umani primari dal tessuto pelle adulta

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per isolare in modo efficiente i keratinocytes umani primari dai tessuti di pelle adulta. Questo metodo semplifica la procedura convenzionale utilizzando il Y-27632 di inibitore di roccia nel mezzo di inoculazione per separare spontaneamente le cellule epidermiche da cellule dermiche.

Abstract

Keratinocytes umani primari isolato dai tessuti di pelle fresca e loro espansione in vitro sono stati ampiamente utilizzati per ricerche di laboratorio e per applicazioni cliniche. Il metodo di isolamento convenzionale di cheratinociti umani comporta una procedura di digestione enzimatica sequenziale in due fasi, che ha dimostrata di essere inefficiente nel generare cellule primarie da tessuti adulti a causa del tasso di recupero cellulare basso e riduttrice delle cellule vitalità. Recentemente abbiamo segnalato un metodo avanzato per isolare le cellule progenitrici epidermica primaria umana dai tessuti della pelle che utilizza l'inibitore della chinasi Rho Y-27632 nel mezzo. Confrontato con il protocollo tradizionale, questo nuovo metodo è più semplice, più facile e meno dispendio di tempo e aumenta il rendimento delle cellule staminali epiteliali e migliora le caratteristiche di cellule staminali. Inoltre, la nuova metodologia non richiede la separazione dell'epidermide dal derma e, di conseguenza, è adatta per isolare le cellule da diversi tipi di tessuti dell'adulto. Questo nuovo metodo di isolamento supera le carenze principali dei metodi convenzionali ed è più adatto a produrre un numero elevato di cellule epidermiche con elevata potenza per laboratorio e per applicazioni cliniche. Qui, descriviamo il nuovo metodo in dettaglio.

Introduzione

L'obiettivo era quello di sviluppare un protocollo semplice ed efficace per isolare i keratinocytes umani primari (HKCs) da tessuti adulti, soprattutto per applicazioni cliniche. Cellule staminali epidermiche cutanee, localizzate nello strato basale della pelle, possiedono un alto potenziale di proliferare e differenziare e fornire cheratinociti per mantenere le funzioni della pelle^{1,2,3, 4}. HKCs isolato dalla pelle tessuti sono ampiamente utilizzati per pelle tessuto ingegneria e rigenerazione scopi, soprattutto nella riparazione della pelle danneggiata e nella terapia genica per applicazioni cliniche^5,6. La questione chiave per le applicazioni basate su HKC è efficacemente isolare ed espandere i grandi numeri di HKCs con alto potenziale in vitro^7,8. Anche se vari gruppi di ricerca hanno sviluppato metodi per produrre colture di staminali-simili HKCs, questi metodi sono a volte lungo e complicato per eseguire ed avere altre limitazioni, come cella bassa resa ed essere limitato dal tipo di esemplare della pelle usato⁹. Per esempio, il metodo tradizionale per isolare HKCs dai tessuti della pelle comporta una digestione enzimatica in due fasi con una separazione dell'epidermide dal derma⁶. Tale metodo di solito funziona bene per tessuti neonatale, ma diventa molto difficile quando utilizzato per isolare le cellule da tessuti adulti.

Y-27632, un inibitore della chinasi di proteina Rho-collegata (ROCK), è stato segnalato per migliorare significativamente l'efficienza della cellula staminale epidermica isolamento e Colonia crescita^10,11,12. In uno studio precedente, abbiamo scoperto che Y-27632 facilita la crescita clonale delle cellule epidermiche, ma riduce il rendimento delle cellule dermiche differenzialmente controllando l'espressione di molecole di adesione¹³. Inoltre abbiamo stabilito un nuovo medium condizionato di inoculazione, chiamato G-medio, che sostiene la crescita e la resa delle cellule epidermiche primarie. Dalla combinazione di G-medio con Y-27632, questo metodo novello può separare spontaneamente le cellule epidermiche e cutanee dopo digestione degli enzimi, eliminando in tal modo il passaggio di epidermide-derma separazione^13,14. Basato su rapporti precedenti, ora descriviamo la procedura dettagliata di questo nuovo metodo per isolare HKCs dal tessuto pelle adulta.

Protocollo

Tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono state gestite secondo le direttive del Comitato di etica di ricerca umana dell'istituzione (NO.2015120401, Data: 12 maggio 2015).

1. preparati

1. Tessuti di pelle addominale adulto fresca raccogliere scartati dalla chirurgia plastica presso l'ospedale in un tubo da 50 mL con 10 mL di Dulbecco ghiacciata s modified medium di Eagle (DMEM). I campioni possono essere conservati a 4 ° C fino a 72 ore senza alterare significativamente l'attuabilità delle cellule.
2. Preparare i reagenti e il terreno di coltura come descritto di seguito.
   1. Aggiungere 1 mL di penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 mg/L) a 50 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) per preparare la soluzione di lavaggio.
   2. Preparare due serie di soluzioni di digestione degli enzimi: (1) preparare 50 mL di dispase (2,5 mg/mL in DMEM) e 50 mL di tipo I collagenasi (2,5 mg/mL in DMEM) separatamente per il metodo convenzionale; e (2) preparare 50 mL di una miscela di dispase e collagenasi di tipo I (sciogliere 125 mg di polvere di dispase e 125 mg di tipo polvere di collagenasi in 50 mL di DMEM) per il nuovo metodo.
      Nota: Tutte le soluzioni di enzima dovrebbero essere filtrate con un filtro da 0,22 µm e mantenute at4 ° C.
   3. Preparare le soluzioni di digestione per entrambi i metodi: 0.05% tripsina e 0,25% tripsina commercialmente sono stati acquistati. Preparare un 10mg/mL dnasi ho soluzione sciogliendo 50 mg di dnasi io polvere in 5 mL di PBS, filtrare con un colino da 0,22 µm e conservare a-20 ° C.
   4. Preparare 500 mL di medium per neutralizzare la digestione enzimatica: medium DMEM supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina.
   5. Preparare 500 mL di terreno di inoculazione (fattore di crescita-contenenti medio, chiamato G-medio): DMEM/F12 (3:1) mezzo contenente 1% di penicillina/streptomicina, 40 µ g/mL fungizone, 40 ng/mL fattore di crescita fibroblastico 2 (FGF2), 20 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), e Supplemento del 2% B27.
   6. Pretrattare coltura cellulare di 100 mm a piatti con 2 mL di una matrice di rivestimento contenente tipo I collagene per 30 min a temperatura ambiente.

2. convenzionale metodo

1. Pretrattamento del tessuto della pelle
   1. Prendere 1,5 cm² del tessuto della pelle e lavarlo 1 x 10 ml di PBS; quindi, risciacquare con 10 mL di etanolo al 70% per 30 s e incubare 2 x 10 ml di soluzione di lavaggio (PBS contenente il 2%, penicillina e streptomicina), 5 minuti ciascuno.
      Nota: Tutti i lavaggi vengono eseguiti in piastre di coltura cellulare di 100 mm all'interno di una cappa a flusso laminare.
   2. Tagliare il tessuto con forbici sterili per rimuovere lo strato di grasso sottocutaneo in una piastra di coltura cellulare di 100 mm e, quindi, pesare il tessuto della pelle (il peso è di 1 g in questo protocollo).
      Nota: Taglio sufficiente è molto cruciale per la separazione efficiente dell'epidermide dal derma. Lo strato di grasso giallastro può essere facilmente distinto visivamente.
   3. Trasferire il tessuto ad un altro piatto sterile 100 mm con il lato di derma verso il basso e, quindi, tagliate il tessuto della pelle a strisce di 3-4-mm-wide usando un bisturi.
      Nota: Il lato di derma con lo strato di grasso è facilmente riconoscibile visivamente.
   4. Aggiungere 10 mL di soluzione di dispase 2,5 mg/mL per i tessuti cutanei in una piastra di coltura di 100 mm e, quindi, incubare il piatto durante la notte a 4 ° C (non più di 20 h).
      Nota: La quantità di soluzione dispase può essere calcolata utilizzando 10 mL di soluzione di dispase per la digestione di ogni grammo di tessuto.
2. Separazione dell'epidermide dal tessuto della pelle
   1. Il secondo giorno, staccare l'epidermide dal derma con pinzette bene.
      Nota: Se è difficile da staccare l'epidermide, la digestione dispase non era sufficiente, che di solito è a causa di insufficiente rifilatura del tessuto. In questo caso, il tessuto ha bisogno di un tempo di incubazione più lungo.
   2. Tritare l'epidermide pelato con 500 µ l di terreno di coltura cellulare in un impasto di tessuto usando lame di bisturi; Risospendere le con 10 mL di tripsina 0,25% in una provetta da 50 mL, quindi Incubare 20 min in un bagno di acqua a 37 ° C, con agitazione.
3. Raccolta e messa in coltura di cellule primarie
   1. Neutralizzare l'attività della tripsina aggiungendo un uguale volume di soluzione di neutralizzazione (10 mL in questo protocollo).
   2. Dissociare le cellule epidermiche pipettando la soluzione su e giù per 20 volte con una pipetta sierologica di 10 mL e filtrare la soluzione delle cellule attraverso un colino di cella da 100 µm per rimuovere eventuali residui di tessuto residuo.
   3. Centrifugare la soluzione di cella a 200 x g per 5 min dopo filtrazione; Risospendere il pellet cellulare in mezzo di neutralizzazione per il lavaggio e, quindi, centrifugare nuovamente, a 200 x g per ottenere il pellet cellulare.
   4. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno del keratinocyte basso calcio, privo di siero (SFM). Prendere 10 µ l di questa soluzione per contare il numero totale delle cellule e, quindi, piastra circa 2 x 10⁶ cellule con 10 mL di SFM in piastre di coltura delle cellule 100mm pretrattati con matrice di rivestimento (contenenti collagene di tipo I).
      Nota: Il rivestimento è un passo necessario per il metodo convenzionale.
   5. Cambiare il terreno di coltura ogni d 2.
      Nota: Controllare l'adesione delle cellule al microscopio prima e dopo la modifica il terreno di coltura.
   6. Le cellule del passaggio quando raggiungono circa l'80% confluenza.
      Nota: Tutti i piatti di cultura sono pretrattati con la matrice di rivestimento.

3. il nuovo metodo

1. Pretrattamento del tessuto della pelle
   1. Raccogliere il tessuto come descritto sopra (punto 2.1) per il metodo convenzionale.
   2. Lavare il tessuto della pelle 1 x 10 ml di PBS e, quindi, pesano in un contenitore di plastica sterile di una bilancia elettronica (il peso è circa 1 g in questo protocollo).
      Nota: Il peso minimo del tessuto necessario per questo protocollo è 0,1 g, dal momento che è difficile ottenere un numero sufficiente di cellule se il campione di tessuto utilizzato è troppo piccolo. Non c'è nessun peso massimo del tessuto per questo protocollo, che in definitiva dipende la capacità di gestione dell'operatore.
   3. Utilizzare pinze per sciacquare il tessuto cutaneo con 10 mL di etanolo al 70% per 30 s.
   4. Incubare il tessuto 2 x 10 ml di soluzione di lavaggio (preparata al punto 2.1.1), per 5 minuti ogni volta.
      Nota: Tutti i passaggi di lavaggio indicati in precedenza vengono eseguiti in piastre di coltura cellulare di 100 mm all'interno di una cappa a flusso laminare (un cappuccio di coltura del tessuto).
   5. Trasferire il tessuto piatto sterile cultura di un'altra cella di 100 mm.
   6. Utilizzando lame di bisturi, tritare il tessuto accuratamente in un impasto di tessuto.
   7. Aggiungere 200 µ l di PBS ogni 5 min per mantenere i tessuti bagnati.
      Nota: Prendere circa 15 min per la procedura 3.1.5 - 3.1.7. Tutti i passaggi precedenti vengono eseguiti a temperatura ambiente.
2. Digestione del tessuto cutaneo
   1. Trasferire la soluzione di tessuto omogeneizzato in una provetta da 50 mL. Aggiungere 10 mL di miscela di enzimi per ogni 1 g di tessuto cutaneo. Mescolare accuratamente gli enzimi con i tessuti omogeneizzati.
   2. Incubare la miscela con l'agitazione in un bagno di acqua a 37 ° C per 1 h.
   3. Aggiungere un volume di 1/5 di 0,25% tripsina (2,5 mL in questo protocollo) per la miscela di digestione per altri 30 min in un bagno di acqua a 37 ° C.
   4. Aggiungere dnasi I soluzione per la miscela di enzimi ad un rapporto di 1: 100 (v/v) (250 µ l in questo protocollo) e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
3. Raccolta e messa in coltura di cellule primarie
   1. Interrompere il processo di digestione con l'aggiunta di 12,5 mL di terreno di neutralizzazione in un rapporto 1:1. Dispensare la soluzione su e giù per circa 20 x, utilizzando una pipetta sierologica di 10 mL per dissociare le cellule.
   2. Filtrare le cellule dissociate attraverso un colino di cella da 100 µm per rimuovere i residui di tessuto. Centrifugare il supernatante a 200 x g per 5 min, osservare la pallina nella parte inferiore del tubo.
   3. Scartare il surnatante e lavare il pellet cellulare con 10 mL di mezzo di neutralizzazione e centrifugare nuovamente a 200 x g per 5 min raccogliere le cellule.
   4. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di inoculazione (G-medio dal punto 1.2.5) con 10 µM di Y-27632.
   5. Prendere 10 µ l della soluzione per contare il numero totale delle cellule e, quindi, piastra circa 2 x 10⁶ cellule con 10 mL di G-medio in una piastra di coltura cellulare di 100 mm.
      Nota: Il passaggio gasose non è necessario per il nuovo metodo, e rimozione dello strato dermico non è richiesto.
   6. Dopo 3 d, sostituire il mezzo di inoculazione con il mezzo di SFM basso-calcio. Cambiare il terreno di coltura ogni d 2.
      Nota: Controllare l'adesione delle cellule prima e dopo aver cambiato il mezzo.
   7. Le cellule del passaggio quando raggiungono circa l'80% confluenza.
      Nota: Se necessario, pretrattare le cellule con tripsina 0.05% per 2 min e lavare le cellule con PBS per rimuovere contaminanti cellule dermiche prima trypsinizing delle cellule epidermiche.

4. cellule di passaggio

1. Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS e, quindi, aggiungere 2 mL di tripsina 0,05% (per ogni piatto di 100 mm).
2. Incubare le cellule in un incubatore (37 ° C con 5% CO₂) per 5 min.
3. Controllare le celle utilizzando un microscopio per assicurarsi che tutte le cellule hanno staccato dalla piastra di coltura.
4. Aggiungere 8 mL di DMEM con 10% FBS per neutralizzare la reazione enzimatica e, quindi, raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL.
5. Centrifugare a 200 x g per 5 min ottenere il pellet cellulare.
6. Rimuovere il surnatante lentamente e, quindi, risospendere il pellet cellulare con 10 mL di terreno SFM e contare il numero di cellule.
7. Piastra di 1 x 10⁶ cellule con 10 mL di SFM in ogni piatto di cella di 100 mm.
8. Modificare il mezzo ogni d 2.

Risultati

Diagrammi schematici del nuovo metodo (Figura 1A) e il metodo convenzionale (Figura 1B) sono presentati nella Figura 1. Il metodo convenzionale è una digestione in due fasi, che richiede una procedura di 2 giorni. Al contrario, il nuovo metodo è una digestione di One-Step, che dura circa 3 ore per eseguire. Cosa importante, il nuovo metodo di One-Step può ottenere due popolazioni (cellule epidermi...

Discussione

Colta HKCs primario sono stati ampiamente utilizzati per curare le ferite in cliniche per più di tre decenni e, da quel momento, è stato sempre importante ottenere in modo efficiente un numero sufficiente di cellule per applicazioni cliniche in modo tempestivo. Quindi, in pratica, il metodo di isolamento convenzionale, che richiede la separazione dell'epidermide dal derma, rende difficile soddisfare queste esigenze, a causa della bassa resa delle cellule e la bassa capacità di passaggio di cellule adulte. Qui, descriv...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026333	For cell incubating
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004380	Cell centrifuge
Constant Temperature Shaker	Shanghai Boxun	150036	For water bath
Electronic Scale	Harbin Zhonghui	1171193	For tissue weighing
Cell Culture Dish	Eppendorf	30702115	For cell culture
50ml Centrifuge Tube	KIRGEN	171003	For cell centrifuge
Cell Strainer	Corning incorporated	431792	Cell filtration
Phosphate buffered solution	Solarbio Life Science	P1020-500	Washing solution
DMEM	Thermo Scientific	C11995500	Component of neutralization medium
Defined K-SFM	Life Technologies	10785-012	Epidermal cells culture medium
Penicillin Streptomycin	Thermo Scientific	15140-122	Antibiotics
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1AC5	Component of neutralization medium
0.05% Trypsin	Life Technologies	25300-062	For HKC dissociation
0.25% Trypsin	Beijing Solarbio Science & Technology	T1350-100	For HKC dissociation
Coating Matrix Kit	Life Technologies	R-011-K	For coating matrix
Dispase	Gibco	17105-041	For HKC isolation
Collagenase Type I	Life Technologies	17100-017	For HKC isolation
Deoxyribonuclease I	Sigma	9003-98-9	For HKC isolation
F12 Nutrient Mix, Hams	Life Technologies	31765035	Component of G-medium
B27 Supplement	Life Technologies	17504044	Growth factor in G-medium
FGF-2 Millipore	Merck Biosciences	341595	Growth factor in G-medium
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	ROCK inhibitor
Fungizone	Gibco	15290026	Preparation for G-medium
EGF Recombinant Human Protein	Gibco	PHG0311	Growth factor in G-medium
Cell Counting Kit-8	Thermo Scientific	NC9864731	cell proliferation and cytotoxicity assays
Mouse Anti-Human Cytokeratin5	Hewlett-Packard Development Company	MA-20142	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Rabbit Anti-Human Loricrin	Covance	PRB-145p	For immunofluorescence staining to check differentiation marker of HKCs
Mouse anti-human Vimentin	Cell Signaling Technology	3390	For immunofluorescence staining of dermal fibroblasts
Integrin α6(GOH3)	Santa Cruz	SC-19622	flow cytometry analysis of HKCs
Rat IgG2a FITC	Santa Cruz	SC-2831	negative control antibody of α6-integrin  in flow cytometry analysis