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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Abstract

I microRNA (Mirna) sono una classe di piccoli RNA non codificanti che appaiamento regolano l'espressione genica cellulare. Mirna bind per la regione 3' non tradotta (UTR) del bersaglio mRNA per inibire la traduzione della proteina o in alcuni casi causare la degradazione di mRNA. L'associazione del quieto al 3' UTR del bersaglio che mRNA è mediato da una sequenza di seme del nucleotide di 2 – 8 all'estremità 5' di miRNA. Mentre il ruolo dei miRNA come molecole regolatrici cellulari è ben consolidato, identificazione degli mRNA bersaglio con rilevanza funzionale rimane una sfida. Strumenti bioinformatici sono stati impiegati per prevedere sequenze all'interno di 3' UTR degli mRNA come obiettivi potenziali per l'associazione di miRNA. Questi strumenti sono stati utilizzati anche per determinare la conservazione evolutiva di tali sequenze tra specie affini nel tentativo di prevedere il ruolo funzionale. Tuttavia, questi metodi computazionali spesso generano falsi positivi e sono limitati a predire canonica interazione tra miRNA e mRNA. Di conseguenza, le procedure sperimentali che misurano il legame diretto del miRNA al suo target di mRNA sono necessari da stabilire interazione funzionale. In questo rapporto, descriviamo un metodo sensibile per la convalida di interazione diretta tra i cellulari miRNA miR-125b e 3' UTR di PARP-1 mRNA. Elaboriamo un protocollo in cui imita sintetico biotinilato-miRNA transfected nelle cellule di mammiferi e il complesso di miRNA-mRNA nel lisato cellulare è stato tirato con biglie magnetiche rivestite con streptavidina. Infine, la destinazione del che mRNA nel complesso dell'acido nucleico spostate verso il basso è stato quantificato utilizzando una strategia basata su qPCR.

Introduzione

I microRNA (Mirna) sono piccoli RNA che regolano negativamente l' espressione di proteina1non codificanti. Precursori di miRNA risiedono in cluster attraverso molte regioni del genoma, più frequentemente all'interno delle regioni intergeniche e introni di proteina-codificazione geni2,3. Biogenesi dei miRNA coinvolgono trascrizione dei pri-miRNA da miRNA-codifica geni4. I pri-miRNA sono sottoposti a elaborazione sequenziale, prima nel nucleo e nel citoplasma per generare singolo incagliato Mirna maturi4,5. Successivamente, i miRNA maturi sono incorporati il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC): una proteina-RNA multimerica complessa che include un membro della famiglia di proteine per destinazione riconoscimento4,5, Argonaute 6,7. Mirna maturi nel complesso RISC prevalentemente associare al 3' UTR di destinazione mRNAs8,9,10 ma anche possono associare occasionalmente nella codificazione e la regione 5' UTR del mRNA10,11 . L'associazione di miRNA per il mRNA sequenze risultati in traslazionale silenziamento12,13,14 e in alcuni casi mRNA destabilizzazione15. Poiché un singolo miRNA puoi indirizzare molti mRNA, queste molecole regolatrici sono coinvolte in quasi ogni processo cellulare e sono state implicate in varie malattie condizioni16,17,18.

Conoscenza dettagliata di come Mirna regolano vie cellulari richiede l'identificazione degli mRNA bersaglio. Sono disponibili per predire putativi miRNA:mRNA interazioni19,20più piattaforme di bioinformatica. Queste previsioni si basano su perfetto Watson-Crick appaiamento tra la sequenza di seme del nucleotide di 2 – 8 del quieto e una sequenza complementare entro il4,di mRNA target21. Inoltre, questi strumenti generano la struttura secondaria del duplex miRNA:mRNA, calcolano i parametri termodinamici di questa interazione molecolare e visualizza conservazione delle sedi del legame tra le specie per migliorare la rilevanza funzionale della destinazione Pronostico. Purtroppo, questi strumenti hanno anche la limitazione della predizione falsi obiettivi positivi a un tasso molto elevato (~ 27 – 70%)15,22. La cosa più importante, queste piattaforme in silico non riescono a riconoscere le interazioni non-canonica di Mirna con loro obiettivi23. Pertanto, tali analisi predittive sono spesso combinati con metodi sperimentali per convalidare funzionalmente rilevanti obiettivi.

Diversi approcci sono stati sviluppati per convalidare sperimentalmente l'interazione miRNA:mRNA. Esperimenti genetici utilizzando miRNA mimics, spugne e inibitori che alterano i livelli di miRNA nella cella forniscono indizi per suo effetto regolatore dal bersaglio gene espressione24,25,26. Inoltre, reporter basato su analisi tramite co-transfezione di un clone contenente la regione 3' UTR di mimici di mRNA e miRNA la destinazione o inibitori in cellule forniscono la prova della funzione regolamentare di Mirna26. Mentre questi metodi sono fondamentali per studiare la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica di Mirna, effetti di efficienza e pleotropic di transfezione delle alterazioni nei livelli di miRNA cellulare sono grossi limiti di questi approcci genetici23, 26. Di conseguenza, complementari metodi biochimici che sonda l'interazione diretta tra miRNA e l'obiettivo sono impiegati per comprendere meglio la funzione cellulare dei miRNA.

Un metodo ampiamente utilizzato per studiare l'interazione diretta tra miRNA e il suo obiettivo è immunoprecipitazione del complesso RISC seguito mediante l'individuazione del target di mRNA all'interno del complesso27,28,29,30 . Recentemente, un metodo migliorato di trappola RISC è stato utilizzato anche per identificare bersagli miRNA; si accoppia stabilizzazione degli obiettivi all'interno gli intermedi di RISC-miRNA-mRNA con la purificazione del mRNA bersaglio. Tuttavia, questi methodsface le sfide inerenti delle interazioni aspecifiche tra proteine RNA e RNA-binding che solitamente sono segregate da compartimenti cellulari31,32. Inoltre, queste analisi sono dipendente dalla presenza di proteine AGO2 per immunoprecipitazione del complesso RISC33. Dato che AGO2 non è l'unico argonaute per mediare interazioni miRNA:mRNA efficiente, l'esclusione di altri argonautes potrebbe portare a risultati biased34. Pertanto, strategie alternative sono necessari per studiare il legame diretto del miRNA a mRNA.

In questo rapporto, abbiamo elaborato un approccio One-Step per sondare l'interazione diretta tra un miRNA e l'obiettivo mRNA. In primo luogo, 3' biotinilati bloccato dell'acido nucleico (LNA) miRNA imita transfected nelle cellule di mammiferi. Quindi, la miRNA:mRNA complesso nel lisato cellulare viene catturato utilizzando streptavidina biglie magnetiche. Il target di mRNA associato alla sua miRNA complementare è quantificato utilizzando qPCR.

Protocollo

1. la transfezione di 3'-biotinylated miRNA

Nota: Eseguire la procedura seguente all'interno di una cappa a flusso laminare sterile.

  1. Cellule di seme 4 x 105– 5 x 105 HEK 293T per pozzetto in 2 mL di completano per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) [DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1 x antibiotico penna-strep]. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 durante la notte.
  2. Il giorno successivo, controllare la salute e l'aderenza delle cellule placcati sotto un microscopio chiaro.
    Nota: Assicurarsi che le cellule hanno aderito e raggiunto morfologia appropriata prima di procedere al passaggio successivo. Le cellule HEK 293T sono in genere pronte per la transfezione 18 – 24 h post placcatura.
  3. In un tubo di microfuge sterile 1,7 mL, diluire 75 picomoli di biotinylated miRNA a 200 µ l di media minimi essenziali. Trasferire questo mix un altro 1,7 mL microfuge tubo contenente liposoma base reagente di transfezione (8 µ l/pozzetto) diluito in 200 µ l di media minimi essenziali. Mescolare accuratamente, ma delicatamente, pipettando e incubare per 20 – 25 min a temperatura ambiente per permettere la formazione dei complessi transfezione.
  4. Rimuovere i vecchi media dalla piastra di coltura ben 6 pipettando delicato e riempire ogni pozzetto con 1.6 mL di DMEM completa preparata al momento (senza 1 x antibiotici penna-strep).
  5. Aggiungere i complessi di transfezione (da 1,3) drop-wise per le cellule della piastra 6 pozzetti usando una pipetta ben calibrata. Agitare delicatamente la piastra mentre aggiungendo i complessi per assicurare la loro distribuzione uniforme su tutta la piastra.
    Nota: Questo passaggio è molto critico per il raggiungimento di alta efficienza trasfezione e deve essere eseguito con cura e pazienza.
  6. Coltura le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 per almeno 36 h.

2. preparazione di streptavidina rivestito biglie magnetiche — io

  1. Risospendere accuratamente i branelli magnetici streptavidina nel Vortex. Trasferire 30 µ l di sospensione di tallone (per campione) in una provetta di microfuge privo di nucleasi di 2 mL.
  2. Collocare la provetta contenente la sospensione di perlina allo stand di separatore di biglie magnetiche ("magnete" qui di seguito) per 2 min. Dopo aver verificato che le perle siano portate a lato del tubo a contatto con il magnete, rimuovere con cautela il surnatante mediante una micropipetta.
  3. Aggiungere 100 µ l di tampone di lavaggio della perla (10 mM Tris-Cl a pH 7.5, 0,5 mM EDTA, NaCl di 1m) ai talloni. Rimuovere il tubo dal magnete. Vortex per 15 s a temperatura ambiente per lavare le perle.
  4. Collocare la provetta contenente microsfere sul magnete per 2 min e attentamente rimuovere e scartare il surnatante.
  5. Ripetere i passaggi da 2.3 e 2.4 per un totale di tre lavaggi. Dopo la fase di lavaggio finale, togliere il tubo dal magnete.
  6. Aggiungere 100 µ l di RNAsi liberando soluzione (0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl) ai talloni, mescolare bene su vortex per 15 s e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Posizionare il tubo contenente microsfere sul magnete per 2 min e attentamente rimuovere e scartare il surnatante.
  7. Ripetere il passaggio 2.6 per un totale di tre volte.
  8. Aggiungere perlina risospensione soluzione (0,5 M NaCl) ai talloni, vortice 15 s e incubare a temperatura ambiente per 5 min posto le perle di sedimento sul magnete per 2 min e rimuovere con cautela il supernatante.
  9. Aggiungere 200 µ l del tallone (1 µ g / µ l BSA, tRNA del lievito di 2 µ g / µ l) di soluzione bloccante ai talloni. Mix dolce nel Vortex per 15 s a temperatura ambiente. Incubare a 4 ° C per 16 ore (durante la notte) in un rotatore di multi-tubo.

3. preparazione dei lisati cellulari

  1. Raccogliere le cellule HEK 293T trasfettate da dolce raschiare con una spatola sterile cella all'interno della cappa laminare, quindi trasferire ciascun campione in una provetta di microfuge sterile mL 2.
  2. Agglomerare le cellule raschiate per centrifugazione a 1.500 x g per 5 min. Risospendere il pellet in 1X PBS sterile (fosfato tampone salino), pH 7,2. Centrifugare nuovamente a 1.500 x g per 5 min ottenere un pellet gratuito dei media residua. Immediatamente immergersi nella provetta contenente il pellet in ghiaccio.
  3. Preparare il tampone di lisi di cellule fresche completo (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7,5, 5mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/mL Superase, inibitore della proteasi: 1x).
    Nota: Uno stock di tampone di lisi delle cellule manca IGEPAL, Superase e proteasi inibitore cocktail può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente. Preparare un lotto fresco di tampone di lisi della cellula completa aggiungendo i supplementi di cui sopra alle concentrazioni finali consigliate nel buffer di lisi delle cellule stock e riporlo sul ghiaccio.
  4. Aggiungere 260 µ l di tampone di lisi ghiacciata cella completa per ogni campione nel tubo microfuge (cioè, ogni tubo microfuge contiene cellule raccolte da un pozzetto della piastra 6 pozzetti) e risospendere il pellet cellulare in una sospensione omogenea di pipettaggio.
  5. Lisare le cellule utilizzando il metodo di congelamento-scongelamento: incubare le provette a-80 ° C per 10 – 15 min. Quindi, permettono alle cellule di scongelare su ghiaccio.
  6. Centrifugare la cella risultante lisata a 16.000 x g per 5 min in una centrifuga da banco refrigerato a 4 ° C.
  7. Trasferire il lysate delle cellule liquidati in una provetta di microfuge sterile 1,7 mL sul ghiaccio. Scartare il pellet.
    Nota: Il volume finale di cancellato lisato dovrebbe essere ~ 240-250 µ l.
  8. Aggiungere 5 M NaCl per lo sgomberati lisato ad una concentrazione finale di 1M e mantenere i campioni su ghiaccio.

4. preparazione di biglie magnetiche streptavidina — II

  1. Preparare il tampone di lavaggio di discesa completa fresco (10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1m NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase e 1 x cocktail di inibitore della proteasi)
    Nota: Uno stock di tampone di lavaggio di discesa manca IGEPAL, Superase e proteasi inibitore cocktail può essere preparato in anticipo e conservato a temperatura ambiente. Preparare un lotto fresco di tampone di lisi della cellula completa aggiungendo i supplementi di cui sopra alle concentrazioni finali consigliate nel buffer di lisi delle cellule stock e riporlo sul ghiaccio.
  2. Posizionare la provetta contenente il preparato Perline (dal punto 2.9) sul magnete per 2 min attentamente rimuovere e scartare il surnatante.
  3. Aggiungere 150 µ l di tampone di lavaggio completo a discesa ghiacciata ai talloni. Vortex per 15 s e incubare a temperatura ambiente per 30-60 s. posto i tubi sul magnete per 2 min con attenzione rimuovere e scartare il surnatante.
  4. Ripetere il passaggio 4.3 per un totale di 3 volte.
  5. Risospendere le sfere in 300 µ l di tampone di lavaggio completo menu a tendina.

5. pull-down di Target mRNA-miRNA complessi

  1. Trasferire 300 µ l della cella lysata (dal punto 3.8) nella provetta di microfuge contenente 300 µ l di perline (dal punto 4.5).
  2. Incubare la miscela su un mixer nutante per 1 h a temperatura ambiente.
  3. Posto il tubo sul magnete per 5 min, attentamente rimuovere e scartare il surnatante.
  4. Aggiungere 300 µ l di tampone di lavaggio completo a discesa ghiacciata ai talloni. Vortex per 15 s a temperatura ambiente e posto il tubo sul magnete per 5 min, attentamente rimuovere e scartare il surnatante.
  5. Ripetere il punto 5.4 altre due volte.
  6. Risospendere le sfere in 100 µ l di acqua priva di nucleasi e incubare in ghiaccio.

6. totale estrazione del RNA, sintesi del cDNA e qPCR

  1. Estrarre RNA totale dalle perle sedimento (dal punto 5.6) utilizzando un metodo appropriato (Vedi Tabella materiali). Risospendere il RNA totale estratto in 25 µ l di acqua priva di nucleasi. Determinare la concentrazione di RNA e la qualità utilizzando uno spettrofotometro (assorbanza a 260/280). Preparare un brodo di lavoro di RNA a 50 ng / µ l.
  2. Eseguire la sintesi del cDNA, in triplici copie, utilizzando 50 ng di RNA totale (dal punto 6.1) utilizzando una sintesi di cDNA appropriato kit (Vedi Tabella materiali) utilizzando oligo dT primer in un volume finale di 20 µ l (tabella 1). Quindi, provette per PCR carico nello strumento qPCR per eseguire cicli termici secondo le condizioni descritte nella tabella 2.
  3. Eseguire qPCR sul CDNA (dal punto 6.2) utilizzando chimica SYBR Green (Vedi tabella materiali):
    1. Eseguire tutte le reazioni di qPCR in triplici copie in un piatto fondo ben chiaro 96 in condizioni sterili.
    2. Aliquotare 9 µ l della miscela di reazione dal qPCR master mix (Vedi tabella 3) in ciascun pozzetto della piastra. Quindi, aggiungere 1 µ l di cDNA in ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di 10 µ l. sigillare la piastra per PCR usando foglio sigillante resistente al calore PCR e caricare nello strumento qPCR
    3. Eseguire cicli termici secondo le condizioni designate nella tabella 4.
    4. Normalizzare i livelli di espressione (valori Ct) di ciascun campione per i livelli di espressione del controllo uova strapazzato. Utilizzare questi valori per calcolare piega cambiamenti nell'espressione.

Risultati

Mirna regolano processi cellulari legandosi agli mRNA bersaglio. Di conseguenza, identificazione mRNA bersaglio è la chiave per capire la funzione di miRNA. Qui abbiamo elaborato un metodo per identificare target di mRNA di miRNA cellulare. Questo protocollo è adattato da Wani et al. 35 con la modifica dell'utilizzazione biotinilati basati su LNA miRNA imita di pulldown bersaglio mRNA. L'uso di base di LNA oligonucleotidi mimici migliora la specificità ...

Discussione

Identificazione di mRNA target dei miRNA cellulari è importante per capire la loro funzione regolatrice. Diversi strumenti computazionali sono impiegati per prevedere obiettivi basati sulla complementarietà di sequenza di sementi e sulla conservazione di sequenze bersaglio19,20. Anche se questi strumenti sono utili, possono generare elevati livelli di falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, queste previsioni sono accoppiate con metodi sperimentali qual...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari e non finanziari.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni DA037779 (a J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 e MD007586 (a C.D.). Il lavoro è stato anche sostenuto dal RCMI Grant G12MD007586, i Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, centro di ricerca traduzione Meharry (MeTRC) CTSA concedere (U54 RR026140 da NCRR/NIH, il Grant MD007593 U54 da NIMHD/NIH e il Tennessee Center per AIDS Ricerca (P30 AI110527).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line- HEK293T cellsATCCCRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNase AmbionAM2238
Opti-MEM Reduced serum mediaGIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagentInvitrogen/ Thermofisher11668-019
Biotinylated hsa-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled controlExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Streptavidin Magnetic beadsPierce88816
Yeast tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Potassium chloride (KCl) solutionSigma-Aldrich60142
Magnesium chloride (MgCl2) solutionSigma-AldrichM1028
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0Sigma-AldrichE7889
Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340
RNAse/DNAse free waterGIBCO/Thermofisher10977-015
RNeasy extraction kitQiagen74104
iScript-Select cDNA synthesis kitBiorad170-8897
qPCR Primers Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin MagnetInvitrogen/Thermofisher12320D

Riferimenti

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