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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un sistema idroponico semplice, versatile e a basso costo in vitro è stato ottimizzato con successo, consentendo esperimenti su vasta scala in condizioni sterili. Questo sistema facilita l'applicazione di prodotti chimici in una soluzione e loro efficiente assorbimento dalle radici per studi molecolari, biochimiche e fisiologiche.

Abstract

Una vasta gamma di studi in biologia vegetale vengono eseguite utilizzando colture idroponiche. In questo lavoro, un sistema in vitro crescita idroponica progettato per valutare le risposte della pianta ai prodotti chimici ed altre sostanze di interesse è presentato. Questo sistema è molto efficiente nell'ottenere piantine omogenee sani della C3 e C4 modello specie Arabidopsis thaliana e Setaria viridis, rispettivamente. La coltura sterile evita alghe e contaminazione di microrganismi, che sono noti fattori limitanti per la normale crescita delle piante e lo sviluppo in coltura idroponica. Inoltre, questo sistema è scalabile, che permette la raccolta del materiale vegetale su larga scala con minori danni meccanici, come pure la raccolta di singole parti di una pianta se lo si desidera. Un protocollo dettagliato, dimostrando che questo sistema ha un montaggio facile e basso costo, in quanto utilizza pipetta rack come piattaforma principale per la coltivazione di piante, è fornito. La fattibilità di questo sistema è stata convalidata utilizzando piantine di Arabidopsis per valutare l'effetto del farmaco AZD-8055, un inibitore chimico del bersaglio della rapamicina (TOR) chinasi. L'inibizione di TOR è stato rilevato in modo efficiente più presto 30 min dopo un trattamento di AZD-8055 nelle radici e germogli. Inoltre, piante AZD-8055-trattati visualizzato il fenotipo di amido-eccesso previsto. Abbiamo proposto questo sistema idroponico come un metodo ideale per i ricercatori di impianto con l'obiettivo di monitorare l'azione della pianta induttori o inibitori, nonché valutare i cambiamenti continui metabolici utilizzando composti di marcatura a isotopi che, in generale, richiede l'uso di costosi reagenti.

Introduzione

I vantaggi di usando la coltura idroponica coltivazione di piante sono state ampiamente riconosciuti nella produzione di impianti grandi e uniforme, consentendo esperimenti riproducibili1,2,3. In questo sistema, la composizione della soluzione nutritiva può essere adeguatamente controllata e riciclata lungo tutte le fasi della crescita delle piante e lo sviluppo. Inoltre, le radici non sono sottoposti a stress abiotici, come può accadere nelle piante coltivate in terreno, quali carenza di inedia e acqua nutriente4. Come piante coltivate idroponicamente presenti caratteristiche morfologiche e fisiologiche abbastanza simili a quelle coltivate in terreno, questo sistema è stato largamente impiegato nella ricerca perché permette il monitoraggio della crescita di radice/sparare e loro raccolta senza lesioni2,5.

Grazie alla possibilità di cambiare la composizione e la concentrazione della soluzione nutritiva, è stata eseguita la maggior parte della ricerca utilizzando condizioni idroponiche per caratterizzare le funzioni di micro - e macronutrienti1,3 ,6,7,8. Tuttavia, questo sistema ha dimostrato di essere molto utile per una vasta gamma di applicazioni in biologia vegetale, tali da delucidare le funzioni degli ormoni e sostanze chimiche nelle piante. Per esempio, la scoperta di strigolactones come una nuova classe di ormoni9 e il fenotipo di crescita accelerata innescato da Brassinosteroide applicazione10 sono stati effettuati in condizioni idroponiche. Inoltre, questo sistema permette di esperimenti con gli isotopi con etichettati (ad esempio, 14N /15N e 13CO2)11,12 per valutare la loro incorporazione in proteine e metaboliti mediante spettrometria di massa.

Considerando l'importanza di questo sistema nella ricerca della pianta, è stato progettato un elevato numero di colture idroponiche negli ultimi anni, compresi i sistemi che utilizzano (i) il trasferimento delle piantine da piastre a idroponici contenitori3, 13; (ii) rockwool che limita l'accesso agli stadi precoci della radice sviluppo2,14,15; (iii) Polietilene granulato come corpo galleggiante, che rende l'applicazione omogenea delle piccole molecole/trattamenti difficile16; o (iv) un ridotto numero di piante9,17. Il volume dei serbatoi idroponici descritto in molti di questi protocolli sono solitamente grandi (piccoli volumi che vanno da 1-5 L, fino a 32 L)18, che rende l'applicazione di sostanze chimiche estremamente costoso. Anche se alcuni studi descrivono una coltivazione idroponica sotto condizioni asettiche8,19, il montaggio dell'impianto è di solito abbastanza laborioso, costituito la perfetta regolazione di maglie di nylon in plastica o vetro contenitori5,8,17,20.

Data l'importanza di Arabidopsis thaliana come pianta modello, la maggior parte dei sistemi di coltura idroponica sono stata progettata per questa specie1,2,8,14,18, 19 , 20. Tuttavia, ci sono pochi studi che riferiscono le caratteristiche di crescita idroponica di altre specie di piante con un pretrattamento dei semi per migliorare la loro germinazione e sincronizzazione i tassi in vitro8,16 . Al fine di lavorare su larga scala, abbiamo sviluppato un protocollo per l'impostazione di un sistema idroponico di manutenzione semplice e a basso costo che consente condizioni di sterilità per la coltivazione di piante, tra cui a. thaliana e altre specie, come l'erba Setaria viridis. Il metodo qui descritto è adatto a diversi esperimenti, come la crescita del semenzale può essere ingrandita, sincronizzata e facilmente monitorata. Inoltre, questo sistema ha molti vantaggi come: (i) il suo montaggio è semplice e suoi componenti possono essere riutilizzati; (ii) permette la facile applicazione di diverse sostanze chimiche nel liquido di coltura; (iii) le piantine germinano e crescono direttamente nel terreno di coltura senza la necessità di transfert per il sistema di coltura idroponica; (iv) la crescita/sviluppo sparare e radice può essere strettamente sorvegliata e le piantine vengono raccolte senza danni; e (v) lo rende possibile lavorare su larga scala, mantenendo condizioni fisiologiche.

Protocollo

1. preparazione di terreni di coltura solidi e liquidi

  1. Preparare un terreno liquido usando mezzo di Murashige e Skoog (MS) di metà-forza con vitamine [0,0125 mg/L di cobalto (II) cloruro pentaidrato, 0,0125 mg/L di rame (II) solfato pentaidrato, 18,35 mg/L di acido etilendiamminotetraacetico ferrico di sodio, 3,10 mg/L di acido borico, 0,415 mg/L di ioduro di potassio, 8,45 mg/L di manganese solfato monoidrato, 0,125 mg/L di sodio molibdato diidrato, 4,30 mg/L di solfato di zinco eptaidrato, 166,01 mg/L di cloruro di calcio, 85 mg/L di potassio diidrogeno fosfato, 950 mg/L di nitrato di potassio, 90,27 mg/L di solfato di magnesio, 825 mg/L di nitrato di ammonio, 1 mg/L di glicina, 50 mg/L di myo-inositolo, 0,25 mg/L di acido nicotinico, 0,25 mg/L di piridossina cloridrato e 0,05 mg/L del cloridrato della tiamina] completati con 0,25 g/L di MES e regolare il pH a 5,8 con 10 M di KOH.
  2. Aggiungere 10 g/L di agar in modo da rendere un metà-forza MS-solido supporto. Sterilizzare in autoclave il mezzo a 121 ° C per 20 min prima dell'uso.

2. idroponico sistema montaggio

Nota: Questa procedura deve essere seguita meticolosamente per costruire il sistema idroponico.

  1. Sterilizzazione del materiale
    1. Trasportare nella borsa autoclave la punta della pipetta rack (senza fodero) che verrà utilizzato come minitanks. Autoclave le cremagliere a 121 ° C per 20 min, 15 psi.
      Nota: Il rack di punta di pipetta in polipropilene abbiamo utilizzato aveva le seguenti dimensioni: 120 mm (lunghezza) x 89 mm (larghezza) x 55 mm (altezza). La superficie piana del suggerimento di pipetta deve avere un'area per l'aggiunta di terreno di coltura. Altri scaffali di punta possono essere utilizzati (Vedi Tabella materiali).
      Nota: Durante la procedura di assemblaggio del sistema idroponico, è necessario utilizzare una cappa a flusso laminare, che dovrà essere pulita e disinfettata prima di etanolo al 70% di utilizzare. Lo sperimentatore deve indossare un camice da laboratorio, lavarsi le mani e qualsiasi esposte della pelle e disinfettarle con etanolo al 70%. I guanti sono facoltativi, ad eccezione di applicazione della droga.
    2. Pulire tutti gli accessori descritti sopra (scatole di plastica usa e getta, nastro adesivo, pipette, forbici e pinzette) con etanolo al 70% prima di entrare la cappa a flusso laminare. Se il cofano permette, accendere la luce UV per 10 min prima del montaggio del sistema idroponico per mantenere l'area di lavoro decontaminato.
  2. Minitank montaggio
    1. Sigillare la superficie superiore della punta della pipetta con nastro adesivo (Figura 1B). Se possibile, lasciare sotto UV luce per 10 min.
    2. Aggiungere 180 µ l fuso solido MS del terreno di coltura (leggermente caldo) ad ogni pozzetto usando una pipetta multicanale (Figura 1).
      Nota: Nella preparazione di molti carri armati, utilizzare una piastra riscaldante per impedire il mezzo di MS di solidificazione.
    3. Consentire a solidificare completamente (per circa 30 min).
      Nota: Durante il periodo di solidificazione, la luce UV può essere attivata.
    4. Riempire la griglia di punta di pipetta completamente con terreno di coltura liquido MS (Figura 1) e garantire c'è stretto contatto tra il solido e i liquido media.
    5. Rimuovere il nastro adesivo della superficie superiore della punta della pipetta piatta e montarla sul rack con attenzione. Il sistema idroponico è ora pronto a ricevere i semi sterilizzati.

3. le sementi sterilizzazione

  1. Posto 500 semi di Arabidopsis in una microprovetta 1,5 mL. Utilizzare microprovette come necessario in base al numero di impianti necessari per l'esperimento.
  2. Lavare i semi con etanolo al 70% per 2 min con una movimentazione delicata. Lasciate che i semi stabilirsi, quindi rimuovere con cautela l'etanolo.
  3. Aggiungere 1 mL di una soluzione di ipoclorito di sodio 10% contenente 2 µ l di un detergente di polisorbato 20. Agitare la soluzione per 5 min, Rimuovi la soluzione con attenzione.
  4. Sciacquare i semi con acqua distillata sterile fino a quando tutto il residuo di candeggina è completamente rimosso (circa 5 volte).
    Nota: Dopo la sterilizzazione superficiale, i semi sono stati immersi in acqua distillata sterile e stratificati a 4 ° C al buio per 5 d sincronizzare la germinazione.
    Nota: Semi di Setaria viridis (adesione A10.1) sono state preincubate in acido solforico concentrato per 15 min (rompere la dormienza fisica), accuratamente lavati in acqua distillata sterile e quindi disinfestate con ipoclorito di sodio ad una concentrazione del 5% contenente 0,1% polisorbato 20 per 5 min con una movimentazione delicata21. I rimanenti passaggi di sterilizzazione erano identici a quelle descritte per semi di Arabidopsis .

4. seme applicazione

  1. Tagliare leggermente l'estremità di una punta di 200 µ l con l'ausilio di un bisturi sterile.
  2. Pipettare i semi di Arabidopsis in terreno di coltura solido sulla superficie superiore della punta della pipetta piatta. Fare attenzione che il mezzo non si allenta dall'appartamento; in caso contrario, i semi saranno ombreggiati e le piantine non crescerà correttamente (Figura 1E).
    Nota: Utilizzare una pinzetta sterile per semi di Setaria (con l'embrione posizionato verso l'alto).
  3. Memorizzare come molti minitanks possibili all'interno di una scatola di plastica usa e getta per mantenere un'elevata umidità e mantenere l'ambiente libero da microrganismi (Figura 1F).
  4. Sigillare la scatola di plastica usa e getta accuratamente con del nastro adesivo per evitare la contaminazione.
  5. Inserire i sistemi idroponici in una camera di crescita con le condizioni di crescita appropriata per l'impianto di interesse.
    Nota: In questo lavoro, le seguenti condizioni sono state utilizzate: 75% di umidità e 150 µmol m-2 s-1 di irradianza ed equinoziale condizioni di luce 12h (21 ° C) / 12h scuro (19 ° C) per Arabidopsis, o 300 µmol m-2 s-1 di luce di irradianza e 12 h (28 ° C) / 12 ore di buio (25 ° C) per Setaria (Figura 1 e 1 H).

5. convalida l'uso di questo sistema idroponico per inibire il bersaglio della rapamicina chinasi

Nota: Questo sistema idroponico è stato inizialmente sviluppato per agevolare la gestione dei prodotti chimici per le piante, che, in generale, sono molto costosi da applicare negli esperimenti su larga scala. Come un proof of concept, l'inibitore competitivo ATP AZD-8055, che è conosciuto come destinazione in particolare il sito di legame di ATP di TOR proteina chinasi22, è stato impiegato per seguire la repressione di attività di TOR nei semenzali di a. thaliana Columbia-0 ( Il centro di Nottingham Arabidopsis Stock, nascita ID: N22681). Qui, il protocollo utilizzato è brevemente descritto.

  1. Crescere semi idroponica finché stadio 1.04 secondo il BBCH scala23 (per circa 11 d) condizioni climatiche sopra descritto. Sostituire l'elemento nutritivo, con fresca Media contenente 0,05% DMSO (controllo), 2 µM AZD-8055 (inibitore di TOR) diluito in DMSO, o senza trattamento (Lupetto), alla fine della notte (EN).
  2. Raccogliere alcune piantine in diversi momenti dopo il trattamento e separarli in radici e germogli. Congelare i campioni in azoto liquido, li pestava polvere finissima in un macinino robotico (Vedi Tabella materiali) e conservare la polvere a-80 ° C fino all'utilizzo.
  3. Immunoblot contro fosforilate e non-fosforilate forme di 40S proteina ribosomiale S6 (RPS6) secondo Dobrenel et al. 24.
  4. Candeggina intatti piantine per depigmentazione campione, lavarli in acqua distillata, immergerli in una soluzione di iodio per 5 min25e fotografare le piantine in un microscopio stereoscopico (0.63 X obiettivo, 20 x ravvicinamento e grandezza x 7,5) per un valutazione qualitativa del contenuto di amido.
  5. Quantificare l'amido seguendo la degradazione enzimatica e la misurazione del glucosio rilasciato spettrofotometricamente accoppiando alla riduzione del NADP+ a NADPH26,27.
  6. Eseguire un estrazione di RNA totale, una sintesi di cDNA e analisi di RT-PCR quantitative come descritto da Caldana et al. 28 per valutare il livello di espressione dei geni relazionati a diversi tipi di sollecitazioni.
  7. Facoltativamente, crescere piantine su un substrato di orticolo in vasi di plastica con una capacità di 0,1 L sotto condizioni climatiche simili [60% di umidità, 150 µmol m-2 s-1 di irradianza ed equinoziale condizioni di luce 12h (21 ° C) / 12h scuro (19 ° C )] al fine di confrontarli con i semenzali coltivati hydroponically.
    Nota: I geni bersaglio utilizzati per le analisi di espressione genica sono stati ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), e TPS5 (At4g17770) ed i loro livelli di espressione sono stati normalizzati che impiegano il metodo delta-Ct29 utilizzando ACT2 (At3g18780) o PDF2 (At4g04890) come i geni di riferimento interno, supponendo che il 100% di efficienza di amplificazione di PCR attraverso tutti i campioni. Le coppie di oligonucleotidi utilizzate per la PCR quantitativa erano: ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) e PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).

Risultati

La chinasi di TOR è un regolatore importante che integra la segnalazione per promuovere la proliferazione delle cellule e la crescita in tutti gli eucarioti di energia e nutrienti. Gli sforzi per delucidare le funzioni TOR in piante includono la generazione di linee transgeniche di Arabidopsis contenente il repressione condizionale TOR attraverso interferenza del RNA o artificiale microRNA28,30,

Discussione

Questa struttura di idroponica ottimizzata permette la cultura di successo in vitro di piante. Semi germinano bene sul mezzo solido alla superficie piana della punta di pipetta, un guadagno considerevole rispetto ai sistemi dove semi siano imbevuti di soluzione nutritiva. Un grande vantaggio di questo sistema è che durante lo sviluppo del semenzale, radici ottenere direttamente a contatto con il liquido di coltura senza la necessità di transfert. Inoltre, trattamento chimico può applicarsi facilmente nel liqu...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dalla Fondazione di ricerca di São Paulo (FAPESP; Concedere 12/19561-0) e la società Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Carolina C. Monte-Bello (FAPESP; Grant 14/10407-3), Valéria Mafra (FAPESP; Grant 14/07918-6), e vi sono grati per le borse di Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013). Gli autori ringraziano Christian Meyer dall'Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, Francia) per generosamente fornendo anticorpi contro RPS6. Gli autori ringraziano RTV UNICAMP e Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza per il loro supporto tecnico durante l'audio registrazione.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
EthanolMerck100983
Sodium hypochlorite solutionSigma-Aldrich425044
Polysorbate 20  Sigma-AldrichP2287
Murashige and Skoog (MS) medium including vitamins Duchefa BiochemieM0222
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) monohydrateDuchefa BiochemieM1503
Agar Sigma-AldrichA7921
Potassium hydroxideSigma-Aldrich484016
Laminar flow hoodTelstarBH-100
HotplateARECF20510011
Growth chamberWeiss TechnikHGC 1514
Glass Petri dish (150 mm x 25 mm)Uniglass189.006
200 μL pipette tip racks KasviK8-200-5 *
300 μL multichannel pipetteEppendorf3122000060
300 μL pipette tipsEppendorf30073088
200 μL pipette Eppendorf3120000054
200 μL pipette tipsEppendorf30000870
ScissorsTramontina25912/108
TweezerABC Instrumentos702915
Scalpel bladeSigma-AldrichS2771
Adhesive transparent tape (45mm x 50m)Scotch 3M5803
Disposable plastic boxes, external dimensions: 353 mm (L)x 178 mm (W) x 121mm (H)Maxipac32771

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