Isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano omentale e sottocutaneo

Riepilogo

La differenziazione degli adipociti bianchi e beige da progenitori vascolari del tessuto adiposo porta il potenziale di miglioramento metabolico nell'obesità. Descriviamo i protocolli per CD34 + CD31 + isolamento di cellule endoteliali da grasso umano e per una successiva in vitro espansione e differenziazione in adipociti bianchi e beige. Diverse applicazioni a valle sono discussi.

Abstract

L'obesità è accompagnata da un vasto rimodellamento del tessuto adiposo soprattutto via l'ipertrofia degli adipociti. Estremi del adipocyte crescita determina una scarsa risposta all'insulina, ipossia locale e l'infiammazione. Stimolando la differenziazione degli adipociti bianchi funzionale da progenitori, ipertrofia radicale della popolazione degli adipociti può essere prevenuta e, di conseguenza, la salute metabolica del tessuto adiposo può essere migliorata con una riduzione di infiammazione. Inoltre, stimolando una differenziazione degli adipociti beige/marrone, il dispendio energetico totale del corpo può essere aumentato, con conseguente perdita di peso. Questo approccio potrebbe prevenire lo sviluppo di comorbilità dell'obesità come diabete di tipo 2 e malattie cardiovascolari.

Questo articolo descrive l'isolamento, espansione e la differenziazione degli adipociti bianchi e beige da un sottoinsieme delle cellule endoteliali di tessuto adiposo umano che co-esprimono i marcatori CD31 e CD34. Il metodo è relativamente economico e non è alta intensità di lavoro. Richiede l'accesso al tessuto adiposo umano e il deposito sottocutaneo è adatto per il prelievo. Per questo protocollo, campioni di tessuto adiposo fresco da oggetti morboso obesi [indice di massa corporea (BMI) > 35] vengono raccolti durante le procedure di chirurgia bariatrica. Utilizzando un immunoseparation sequenziale dalla frazione vascolare stromal, abbastanza cellule sono prodotte da un minimo di 2 – 3 g di grassi. Queste cellule possono essere espanse in coltura oltre 10 – 14 giorni, possono essere crioconservate e mantengono le proprietà adipogenico con passaggio fino a passaggio 5 – 6. Le cellule sono trattate per 14 giorni con un adipogenico cocktail utilizzando una combinazione di insulina umana e l'agonista PPARγ-rosiglitazone.

Questa metodologia può essere utilizzata per l'ottenimento della prova degli esperimenti di concetto sui meccanismi molecolari che guidano le risposte adipogenico in cellule endoteliali adipose, o per lo screening di nuovi farmaci che possono migliorare l'adipogenico risposta diretta sia verso il bianco o differenziazione del adipocyte beige/marrone. Utilizzando piccole biopsie sottocutanee, questa metodologia utilizzabile per identificare i soggetti non responsivi per studi clinici voluti a stimolare adipociti bianchi e beige/marrone per il trattamento dell'obesità e co-morbidità.

Introduzione

Dati recenti indicano che sia nei topi e nell'uomo, un sottoinsieme delle cellule che risiedono nel sistema vascolare del tessuto adiposo può essere differenziato nei adipocytes bianco o beige/marrone^1,2,3. Il fenotipo di tali cellule è un argomento di polemica, con prove a sostegno di cellule endoteliali, muscolo liscio/pericyte o uno spettro di fenotipi intermedi^4,5,6,7. L'ambito di sviluppo di questa metodologia è stato testare il potenziale adipogenico di CD34 + CD31 + cellule endoteliali isolate da diversi depositi di grasso da esseri umani obesi. Altri studi in letteratura si stanno concentrando sull'adipogenico potenziale della frazione vascolare stromal totale o del adipocyte noti progenitori^2,8,9. Poiché le tecnologie attualmente esistenti possono indirizzare specificamente le cellule endoteliali del tessuto adiposo per droga consegna¹⁰, comprendere le potenzialità di tali cellule per subire adipogenico induzione verso adipocytes bianco o beige è importante per futuro di terapie mirate.

Diversi gruppi hanno riferito la combinazione di marcatori CD31 e CD34 come surrogati per isolare le cellule endoteliali dal tessuto adiposo umano^11,12,13. In genere, l'isolamento viene eseguita utilizzando due punti sequenziali e una selezione positiva utilizzando biglie magnetiche. In questo rapporto, è stato utilizzato immunoseparation utilizzando CD34 + biglie magnetiche combinati con perline in plastica CD31. Abbiamo trovato questa tecnica superiore alla immunoseparation magnetica sequenziale per quanto riguarda la conservazione della morfologia endoteliale tipico acciottolato. Inoltre, siamo stati in grado di generare abbastanza cellule necessarie per l'induzione di espansione e adipogenico a partire da un minimo di 1 – 2 g di grassi. Una biopsia di piccolo campione di grasso sottocutaneo è sufficiente per produrre la quantità necessaria di cellule per applicazioni a valle. Questo aspetto è potenzialmente importante, soprattutto se questo metodo sarà utilizzato per lo screening per una reattività ad induzione adipogenico nei soggetti umani.

A differenza di altri sistemi segnalati nella letteratura, questo metodo utilizza solo due ingredienti per l'induzione di adipogenico del CD34 + CD31 + cellule: un agonista PPARγ — rosiglitazone — e l'insulina umana. D'importanza, la quantità di insulina usata cade all'interno della gamma normale/alto di fare circolare l'insulina in esseri umani¹⁴. Il grado di reattività all'insulina del cellule in vitro, misurata dalla fosforilazione di Akt, non correla con la loro capacità di rispondere all'induzione cocktail. È interessante notare che, utilizzando questa condizioni di cocktail e sperimentale di induzione, un mix di bianche e beige/marrone cellule sono stati ottenuti come determinato dalle dimensioni e numeri di goccioline del lipido intracellulare e l'espressione di marcatori molecolari. Questo protocollo di induzione semplice e conveniente con la valutazione quantitativa del fenotipo delle cellule del radar-risponditore (bianco vs beige) permette uno screening degli agenti che potenzialmente possono alterare l'equilibrio del beige differenziato : bianco adipocytes.

Questo metodo fornisce anche un approccio traslazionale per comprendere i meccanismi di fondo del adipogenesis di progenitori endoteliali vascolari nel tessuto adiposo umano. Utilizzando questa tecnica di isolamento/differenziazione specifica, gli investigatori possono interrogare varie vie responsabili adipogenesis in un sottoinsieme delle cellule endoteliali vascolari da vari depositi di grasso in esseri umani magri ed obesi.

Protocollo

Comitato di Consiglio di revisione istituzionale presso la Eastern Virginia Medical School ha approvato la ricerca e la raccolta di campioni di tessuto adiposo umano utilizzato nello studio. Consenso informato scritto è stato raccolto dai pazienti.

1. preparazione del buffer, i Media e gli strumenti

1. Preparare una soluzione di Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM di cloruro di sodio, 5 mM di cloruro di potassio, solfato di magnesio di 1 mM, 0.4 mM potassio fosfato bibasico, 5,5 millimetri di glucosio, adenosina di 1 mM, 0,01% antibiotico/antimicotico mix (50 µ g/mL di penicillina, 50 µ g/mL di streptomicina, 30 µ g/mL di gentamicina, 15 ng/mL di amfotericina) e 10 mM HEPES (pH = 7.4). Questa soluzione viene preparata fresco ogni volta per la raccolta di tessuto e la digestione.
2. Preparare una soluzione di collagenasi fresche: 1 mg/mL di collagenasi, tipo 1, in KRBSS; fare 3 mL/g di grasso. Pre-riscaldare la soluzione della collagenosi a 37 ° C in un bagno di acqua prima della digestione del tessuto.
3. Preparare un Buffer di isolamento delle cellule CD34: 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 mM EDTA in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS).
4. Preparare il supporto di Adipogenesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina, 1.25 µ l/mL di insulina umana (5 µ g/mL o 144 mU/mL) e 0,36 µ l/mL di 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).
5. Preparare una soluzione stock di olio rosso O (ORO) 0,3% (peso/volume) da sciogliere 0,3 g di ORO in 100 mL di isopropanolo.

2. adiposo frazione vascolare Stromal isolamento

Nota: Lo studio ha incluso un gruppo trasversale dei diabetici obesi tipo 2 (T2D) e oggetti non-diabetico, età compresa tra 18-65 anni, sottoposti a chirurgia bariatrica presso il Sentara metabolica e il centro di chirurgia di perdita di peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Criteri di esclusione comprendevano una malattia autoimmune, tra cui il diabete mellito di tipo 1, condizioni che richiedono la terapia immunosopressiva cronica, farmaci anti-infiammatori, thiazolinendiones, l'uso attivo del tabacco, infezioni croniche o acute o una storia di malignità trattati negli ultimi 12 mesi. T2D è stata definita come un glucosio plasmatico a digiuno di 126 mg/dL o maggiore, una glicemia di 200 mg/dL o maggiore dopo una tolleranza al glucosio di 2 h di prova o l'uso dei farmaci antidiabetici.

1. Raccogliere umano omentale (OM) e sottocutanea (SC) del tessuto adiposo (AT) da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica.
2. Tenere l'OM e SC AT separate fiale contenente soluzione salina tamponata di Hank con 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina a temperatura ambiente subito dopo l'estrazione del tessuto.
3. Pulire accuratamente e rimuovere sezioni di tessuto fibrotici e cauterizzati utilizzando pinzette e forbici monitorate di etanolo 70% quando il campione arriva al laboratorio dopo l'estrazione del tessuto.
4. Pesare il tessuto adiposo e aliquote di it in 5 g (o meno) per la digestione della collagenosi di partizione.
5. Tritare finemente 5 g di AT in 5 mL di soluzione in un flaconcino di scintillazione a temperatura ambiente, collagenosi utilizzando due paia di forbici.
6. Aggiungere un ulteriore 10 mL di soluzione della collagenosi al tessuto macinato per 15 mL totale.
7. Digerire i campioni per 1h a 37 ° C, in un bagnomaria con agitazione continua.
8. Tagliare la punta fuori una siringa da 20 mL per rendere una punta smussata.
9. Ritagliare un quadrato di 9 x 9 cm da una maglia di 250 µm e spingerlo a metà in una provetta conica 50 mL utilizzando la siringa di estremità smussata.
10. Versare i campioni nella siringa da 20 mL estremità smussata e filtro attraverso la rete di nylon 250 µm nella provetta conica 50 mL per separare adipociti e cellule vascolari stromale dal tessuto non digerito.
    Nota: Non utilizzare più di 5g di AT per provetta conica da 50 mL, come la mesh verrà intasarsi a causa di materiale non digerito fibrotico in eccesso.
11. Lavare il flaconcino di scintillazione con 10 mL di KRBBS e versarlo attraverso il filtro per raccogliere le cellule residue.
12. Incubare i campioni filtrati per 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: Questo passaggio è importante per consentire gli adipociti a galleggiare nella parte superiore del tubo e alcune delle cellule vascolari stromal di depositarsi sul fondo del tubo.
13. Utilizzare una siringa da 20 mL e un 20 x 6 nell'ago di pipettaggio per rimuovere lo strato stromal frazione vascolare e trasferirlo in una provetta conica da mL 50 pulito.
14. Aggiungere 10 mL di KRBBS e consentire ai campioni di sedersi sulla panchina per 5 minuti, a temperatura ambiente.
15. Ripetere i passaggi da 2.12 – 2,14 due volte.
    Nota: Questa procedura garantisce che non esiste nessuna contaminazione delle cellule vascolari stromal con gli adipociti galleggiante.
16. Mantenere le frazioni vascolare stromale da entrambi i depositi sul ghiaccio per un'ulteriore elaborazione, come descritto nella procedura seguente.
    Nota: Non lasciare le cellule sul ghiaccio per più di 1 h, come questo può avere un impatto sull'attuabilità delle cellule. Gli adipociti possono essere flash-congelati in azoto liquido per la conservazione a lungo termine o utilizzate freschi per gli esperimenti.

3. isolamento di cellule endoteliali del tessuto adiposo

1. Girare le frazioni vascolare stromale (SVF) a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
2. Rimuovere i campioni dalla centrifuga e versare con cautela il sovranatante; tenere il pellet contenente le celle di SVF.
3. Delicatamente e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS.
   Nota: Se più di 5 g di un deposito di AT è stato elaborato in aliquote multiple (Vedi punto 2.4), riunire il pellet cellulare.
4. Girare i campioni a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
5. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS contare le celle.
   Nota: Qui, un contatore di cellule automatica è stato usato per il conteggio delle cellule. La vitalità cellulare è stata ottenuta mescolando 12 µ l di sospensione cellulare con 12 µ l di una soluzione di acridina arancio/propidio ioduro (AO/PI) (Vedi Tabella materiali). Il numero medio di cellule per grammo di AT per ogni deposito è: (a) OM Depot: 1.69 x 10⁵ ± 4,51 x 10⁴; (b) SC Depot: 1,24 x 10⁵ ± 6,45 x 10⁴. L'attuabilità delle cellule da entrambi i depositi era > 90%.
6. Pellet i campioni a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
   Nota: Un protocollo di selezione immunomagnetica CD34 (Vedi Tabella materiali) è stato adattato per la procedura 3,7 – 3,15.
7. Risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di isolamento di CD34.
   Nota: La conta totale delle cellule richiede i seguenti volumi di risospensione: (a) < 2 x 10⁷ cellule: risospendere il pellet in 100 µ l; (b) 2 x 10⁸– 5 x 10⁸ celle: risospendere il pellet in 1 mL. Nei passaggi 3.9 – 3,16, i volumi dei reagenti utilizzati sono stati ridimensionati per < 2 x 10⁷ cellule.
8. Aggiungere 10 µ l di CD34 cocktail e incubare il campione per 15 minuti, a temperatura ambiente.
9. Aggiungere 5 µ l di biglie magnetiche e incubare il campione per 10 min, a temperatura ambiente.
10. Aggiungere 2,5 mL di tampone di CD34 isolamento per ogni campione e inserire i campioni nel magnete, per 5 minuti, a temperatura ambiente.
11. Invertire il magnete per 5 s per versare il tampone di isolamento.
12. Rimuovere i campioni dal magnete e ripetere i passaggi 4 x 3.10 e 3.11.
13. Rimuovere il tubo dal magnete e aggiungere 2 mL di buffer di isolamento di CD34.
14. Agglomerare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.
15. Risospendere il pellet di cellule in 1 mL di buffer di isolamento CD34 e contare le celle.
    Nota: Qui, il numero medio di cellule per grammo di AT è: (a) OM Depot: 4,75 x 10⁴ ± 3,36 x 10⁴; (b) SC Depot: 1,06 x 10⁴ ± 9,53 x 10³. Un protocollo di plastica immunobead CD31 è stato adattato per la procedura 3.16 – 3,34 (Vedi Tabella materiali).
16. A pellet di cellule a 500 x g per 5 min e risospendere il pellet in 250 µ l di tampone B e 250 µ l di tampone di lavaggio.
17. Risospendere accuratamente le perline CD31 nel Vortex il tubo.
18. Aggiungere 20 µ l di CD31 perline.
    Nota: A causa della totale delle cellule conta > 1 x 10⁶, il volume è stato ridimensionato secondo ingresso del produttore.
19. Incubare il campione con dondolo per 30 min a temperatura ambiente.
20. Collegare una gabbietta in una provetta conica sterile 50 mL.
    Nota: L'apertura più grande del filtro deve essere sulla parte superiore.
21. Prima la separazione delle cellule, aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio per equilibrare il colino. Applicare la miscela generata sotto passo 3.16 al filtro.
22. Lavare il filtro con 5 mL di tampone di lavaggio in un movimento circolare per un volume totale di 20 mL. Collegare il connettore a una provetta conica sterile 50ml e chiudere luer-lock.
23. Collegare la gabbietta al connettore. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio lungo la parete del filtro. Aggiungere 1 mL di tampone attivato D lungo la parete del filtro. Agitare delicatamente il campione e incubare per 10 minuti, a temperatura ambiente.
24. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio. Separare le cellule dalle perle pipettando su e giù per 10 volte.
    Nota: Evitare di generare bolle d'aria.
25. Aprire luer-lock e permettono alle cellule indipendente di fluire la provetta conica da 50 mL. Lavare il filtro 10 x con 1 mL di tampone di lavaggio ogni volta.
26. Eliminare il connettore e il colino e centrifugare i campioni a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di completa EGM-2 Media per la cultura.
    Nota: Il numero medio di cellule per grammo di AT a questo punto è: (a) OM Depot: 5.92 x 10³ ± 4,27 x 10³; (b) SC Depot: 4,12 x 10³ ± 2.1 x 10³. La vitalità delle cellule da entrambi i depositi era oltre il 90%.

4. induzione di Adipogenesis in cellule endoteliali isolate

1. Crescere le cellule in piastre di coltura del tessuto-trattati 6-pozzetti con completa EGM-2 media in un 37 ° C, 5% CO₂ incubator. Sostituire i media ogni 3 – 4 giorni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza di 80 – 90%.
   Nota: Il raddoppio della popolazione è tra 2 – 3 giorni.
2. Espandere le cellule da loro placcatura su piastre Petri da 100 mm e dividere le celle 1:3 una volta. In questa fase, le cellule sono il passaggio 2.
3. Conta le celle utilizzando una cella automatica del contatore (Vedi Tabella materiali).
4. Celle di seme circa 100 – 200.000 in piastre da 6 pozzetti garantendo pozzetti duplicati per ogni deposito e cultura li in completo EGM-2 supporti per 2 giorni.
5. Aspirate fuori qualsiasi media di crescita e sostituirlo con 2 mL di DMEM/F12 con 5% FBS e cellule di 50 µ g/mL di penicillina/streptomicina per il controllo e sostituirlo con 2 mL di Adipogenesis media (Vedi punto 1.4) per le cellule di trattamento.
6. Incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata 5% CO₂ incubatore per 13 giorni, sostituendo i rispettivi media ogni 3-4 giorni.
   Nota: Cellule iniziano ad accumulare lipidi dopo 4 giorni di trattamento.
7. Condotta di ORO e Nilo rosso colorazione secondo metodi pubblicati^15–17.
8. Per isolare le cellule per un'estrazione di RNA, rimuovere il supporto dalle piastre induzione 6 pozzetti e lavare con 1 mL di PBS sterile.
9. Aggiungere 350 µ l di una soluzione di tiocianato-fenolo-cloroformio guanidium (Vedi Tabella materiali) di ogni bene e incubare a temperatura ambiente per 5 – 10 min.
10. Raschiare le cellule fuori la piastra con un raschietto in cella e trasferire le cellule in una microcentrifuga da 1,5 mL.
    Nota: I campioni possono essere conservati nel congelatore-80 ° C per l'estrazione di RNA e ulteriore elaborazione in una data successiva.
11. Estrarre il mRNA dai campioni utilizzando un'estrazione di RNA adattata protocollo (Vedi Tabella materiali).
12. Eseguire una reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR) per valutare l'espressione genica utilizzando le seguenti sonde: adiponectina, UCP-1 e CIDEA (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Qui, RT-PCR procedure sono state effettuate utilizzando il protocollo standard seguente: denaturazione (95 ° C; 15 s), ricottura ed estensione (60 ° C; 1 min) per 40 cicli. Gli esempi di geni con C_T valori espressi > 35 sono stati considerati non rilevabile.

Risultati

Il nostro protocollo mira a fornire un approccio in vitro per determinare il potenziale adipogenico di CD34 + CD31 + cellule vascolari da diversi depositi del tessuto adiposo umano. Un diagramma semplificato è mostrato in Figura 1A. Il primo passaggio utilizzando una selezione positiva di CD34 in cellule che esprimono risultati in > 95% cellule CD34 + nella popolazione delle cellule appena isolate (Figura 1A). D'importa...

Discussione

Il focus di questo lavoro è quello di fornire una metodologia per l'isolamento, espansione e adipogenico induzione di CD34 + CD31 + cellule endoteliali da depositi di viscerale e sottocutanei del tessuto adiposo umano.

Metodologie sono state segnalate per l'isolamento di cellule endoteliali da vari posti letto vascolare di roditori o di esseri umani che coinvolgono principalmente le tecniche utilizzando anticorpi CD31 fluorescente etichettati o accoppiato a biglie magnetiche^...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484