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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Uno della più difficili condizioni di stress che gli organismi si incontrano durante la loro vita comporta un accumulo di ossidanti. Durante lo sforzo ossidativo, le cellule si basano pesantemente su chaperoni molecolari. Qui, presentiamo i metodi utilizzati per indagare la redox-regolati anti-aggregazione attività, nonché monitorare i cambiamenti strutturali che disciplinano la funzione di chaperone utilizzando HDX-MS.

Abstract

Gli organismi viventi devono regolarmente affrontare ambienti fluttuanti durante il loro ciclo di vita, compresi i cambiamenti nella temperatura, pH, l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno e più. Queste fluttuazioni possono portare a una proteina diffusa dispiegarsi, aggregazione e morte cellulare. Pertanto, le cellule hanno evoluto una rete dinamica e stress specifici di chaperoni molecolari, che mantengono un "sano" proteoma durante condizioni di stress. ATP-indipendente chaperoni costituiscono una classe importante di chaperoni molecolari, che servono come molecole di prima linea di difesa, proteggendo l'aggregazione proteica in modo lo stress-dipendente. Una caratteristica di che questi con i supervisori hanno in comune è la loro capacità di utilizzare la plasticità strutturale per la loro attivazione specifica lo stress, il riconoscimento e il rilascio del client misfolded.

In questa carta, ci concentriamo sull'analisi strutturale e funzionale di una tale chaperone intrinsecamente disordinati, la Hsp33 batterica di redox-regolati, che protegge le proteine contro aggregazione durante lo sforzo ossidativo. Qui, presentiamo una serie di strumenti di diverse tecniche per lo studio della attività di chaperone redox-regolati, così come per il mapping dei cambiamenti conformazionali di chaperone, alla sua attività di base. In particolare, descriviamo un flusso di lavoro che prevede la preparazione di proteine completamente ridotte e completamente ossidate, seguita da un'analisi del chaperone attività anti-aggregazione in vitro utilizzando luce-dispersione, concentrandosi sul grado della attività anti-aggregazione e sua cinetica. Per ovviare a frequenti outlier accumulati durante le analisi di aggregazione, descriviamo l'uso di Kfits, un nuovo strumento grafico che permette la facile lavorazione di misure cinetiche. Questo strumento può essere facilmente applicato ad altri tipi di misure cinetiche per valori anomali di smontaggio e montaggio dei parametri cinetici. Per correlare la funzione con la struttura della proteina, descriviamo l'installazione e il flusso di lavoro di una tecnica di spettrometria di massa strutturale, spettrometria di massa dell'idrogeno-deuterio exchange, che consente la mappatura dei cambiamenti conformazionali sul chaperone e substrato durante diverse fasi di attività Hsp33. La stessa metodologia può essere applicata per altre interazioni proteina-proteina e proteina-ligando.

Introduzione

Le cellule incontrano spesso un accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte come sottoprodotti di respirazione1,2, proteica e lipidica ossidazione3,4e processi aggiuntivi5, 6,7. Nonostante il ruolo benefico di ROS' in diversi processi biologici quali8,9 e risposta immunitaria10di segnalazione cellulare, uno squilibrio fra produzione di ROS e la sua disintossicazione potrebbe verificarsi, portando a ossidativo 7di sforzo. I bersagli biologici di ROS sono proteine, lipidi e degli acidi nucleici, l'ossidazione di cui influenzare la loro struttura e funzione. Pertanto, l'accumulo degli ossidanti cellulari è fortemente legata a una vasta gamma di patologie tra cui cancro9,11, infiammazione12,13e invecchiamento14, 15e sono stati trovati per essere coinvolti nell'insorgenza e progressione dei disordini neurodegenerative quali Alzheimer, Parkinson e ALS malattia16,17,18.

Proteine sia recentemente sintetizzate e mature sono altamente sensibili all'ossidazione a causa delle alterazioni potenzialmente nocive delle loro catene laterali, che forma la proteina struttura e funzione19,20. Pertanto, lo sforzo ossidativo conduce solitamente ad un'inattivazione della proteina diffusa, misfolding e aggregazione, finalmente conducendo alla morte delle cellule. Una delle strategie cellulare elegante per affrontare il danno potenziale di ossidazione della proteina è quello di utilizzare chaperoni redox-dipendente, che inibiscono l'aggregazione proteica diffusa, invece di formare complessi stabili con le proteine misfolded client21 ,22,23. Questi accompagnatori di prima linea di difesa sono rapidamente attivati da un'ossidazione site-specific (solitamente sui residui di cisteina) che li converte in potenti molecole anti-aggregazione24. Poiché lo sforzo ossidativo provoca l'inibizione della respirazione e una diminuzione nell'ATP cellulare livelli25, canonico ATP-dipendente chaperoni sono meno efficaci durante lo sforzo ossidativo condizioni25,26 ,27. Di conseguenza, redox-attiva chaperoni ATP-indipendente giocano un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi della proteina sull'accumulo degli ossidanti nei batteri e negli eucarioti (ad es., Hsp3328 e RidA29 nei batteri, Get330 in lievito, le perossiredossine31 negli eucarioti). L'attività di questi accompagnatori dipende fortemente reversibili strutturali cambiamenti conformazionali indotti da un'ossidazione site-specific che scopre idrofobiche regioni coinvolte nel riconoscimento delle proteine misfolded client.

Ricerca del meccanismo anti-aggregazione e i principi che disciplinano il riconoscimento delle proteine client di chaperoni non è facile a causa della natura dinamica ed eterogeneo di chaperone-substrato interazioni32,33, 34,35,36,37. Tuttavia, lo stress-regolata con i supervisori hanno l'opportunità di avanzare la nostra comprensione della funzione anti-aggregazione dovuto la loro capacità di: 1) ottenere due forme differenti di chaperone, attivo (ad es., ossidato) e inattivo (ad es., ridotto), con l'introduzione o la rimozione di una condizione di stress passare facilmente tra loro (ad es., ossidante e riducente), 2) hanno una vasta gamma di substrati, 3) formano complessi molto stabili con le proteine di client che possono essere valutate mediante diverse metodologie strutturali e 4) concentrarsi esclusivamente sul substrato riconoscimento e rilascio, mediato dai cambiamenti conformazionali redox-dipendente, come la maggior parte di questi accompagnatori manca la capacità pieghevole.

Qui, analizziamo le attività anti-aggregazione del chaperone redox-regolati batterica di Hsp33, una componente essenziale del sistema di difesa batterica contro proteina indotta da ossidazione aggregazione28. Quando ridotto, Hsp33 è una proteina di zinco-leganti strettamente piegata con nessuna attività di chaperone; Tuttavia, quando esposte a stress ossidativo, Hsp33 subisce vasti cambiamenti conformazionali che espongono il relativo substrato associazione regioni38,39. Sopra l'ossidazione, lo ione di zinco che è fortemente associato a quattro residui di cisteina altamente conservata del dominio C-terminale è rilasciato40. Questo provoca la formazione di due ponti disolfuro, uno spiegamento del dominio C-terminale e una destabilizzazione della regione adiacente del linker41. Regioni del C-terminale e del linker sono altamente flessibili e sono definite come intrinsecamente o parzialmente disordinati. Al ritorno in condizioni di non-stress, le cisteine diventano ridotto e il chaperone ritorna al suo stato nativo piegato senza attività anti-aggregazione. Il ripiegamento del chaperone conduce ad un ulteriore svolgimento e destabilizzazione della proteina client associato, che innesca il suo trasferimento al sistema chaperone canonico, DnaK/J, per refolding38. Analisi dei siti di interazione di Hsp33 suggeriscono che Hsp33 usi entrambi che suoi carica disordinata le regioni, come pure le regioni idrofobiche sul linker e il dominio N-terminale di catturare "misfolded" proteine di client e impediscono loro di aggregazione38, 42. in stato piegato, queste regioni sono nascoste per il linker piegato e il dominio C-terminale. È interessante notare che, la regione di linker funge da un gatekeeper di stato piegato e inattivo di Hsp33, lo stato pieghevole della sua adiacente di dominio C-terminale34"sensing". Una volta che ha destabilizzato mediante mutagenesi (sia da una mutazione di punto o di una perturbazione di sequenza completa), Hsp33 viene convertito in un chaperone costitutivamente attivo indipendentemente lo stato redox della sua redox-sensibili cisteine43.

I protocolli qui presentati consentono di monitoraggio di attività di chaperone di redox-dipendente di Hsp33, nonché dei cambiamenti conformazionali di mappatura all'attivazione del e associazione di proteine di client. Questa metodologia può essere adattata per ricercare altri modelli di riconoscimento di chaperone-client così come le interazioni non-chaperone proteina-proteina. Inoltre, vi presentiamo i protocolli per la preparazione di chaperoni completamente ossidati e ridotti che può essere utilizzato negli studi di altre proteine redox-interruttore, per rivelare potenziali ruoli dell'ossidazione della proteina su attività della proteina.

In particolare, descriviamo una procedura per monitorare chaperone attività in vitro e definire la sua specificità di substrato sotto diversi tipi di aggregazione proteica (indotta chimicamente o termicamente), utilizzando la diffrazione della luce (LS) misurato da un fluorospectrometer44. Durante l'aggregazione, light scattering a 360 nm aumenta rapidamente a causa della torbidità crescente. Così, l'aggregazione può essere monitorata in modo dipendente dal tempo a questa lunghezza d'onda. LS è un metodo veloce e sensibile per i test di aggregazione proteica e quindi l'attività anti-aggregazione di una proteina di interesse utilizzando concentrazioni nanomolari, consentendo la caratterizzazione delle proteine correlate a aggregazione parametri cinetici sotto diversi condizioni. Inoltre, il protocollo di LS qui descritto non richiede strumentazione costosa e può stabilire facilmente in qualsiasi laboratorio.

Tuttavia, è abbastanza impegnativo per ottenere curve cinetiche "pulito" e derivare i parametri cinetici di una proteina da tali esperimenti, a causa di rumore e il gran numero di valori anomali generati da bolle d'aria e grandi aggregati di diffusione della luce. Per superare questo ostacolo, vi presentiamo un nuovo strumento grafico, Kfits45, utilizzato per ridurre i livelli di rumore in diverse misure cinetiche, specificamente attrezzati per dati cinetici di aggregazione di proteine. Questo software fornisce parametri cinetici preliminari per una prima valutazione dei risultati e consente all'utente di "pulire" grandi quantità di dati rapidamente senza influire sulle proprietà cinetiche. Kfits è implementato in Python ed è disponibile in open source 45.

Una delle domande difficili nel campo riguarda mappatura siti di interazione tra accompagnatori e le loro proteine di client e la comprensione come chaperoni riconoscono una vasta gamma di substrati misfolded. Questa domanda è ulteriormente complicato quando lo studio di complessi di proteine altamente dinamico che comportano intrinsecamente disordinati chaperoni e substrati aggregazione-incline. Fortunatamente, spettrometria di massa strutturale ha avanzato notevolmente nell'ultimo decennio e con successo ha fornito utili approcci e strumenti per analizzare la plasticità strutturale e mappa residui coinvolti nella proteina riconoscimento46, 47 , 48 , 49. qui, presentiamo un tale cambio di tecnica-idrogeno-deuterio spettrometria di massa (HDX-MS)-che consente la mappatura delle modifiche a livello di residui in una conformazione strutturale su modifica della proteina o proteina/ligando associazione35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS utilizza lo scambio continuo di atomi di idrogeno spina dorsale di deuterio, la cui aliquota è influenzata dall'ambiente chimico, accessibilità, e covalenti e non covalenti56. HDX-MS tiene traccia di questi processi di exchange utilizzando un solvente deuterato, comunemente acqua pesante (D2O) e consente di misurazione basato sul cambiamento di peso molecolare seguendo l'idrogeno per cambio di deuterio. Velocità di scambio di idrogeno-deuterio può derivare da atomi di idrogeno che partecipano a legami idrogeno o, semplicemente, da sterico, che indica le modifiche locali nella struttura57. Modifiche su un ligando o modificazioni post-traduzionali possono anche portare a differenze nell'ambiente di idrogeno, con un'associazione con conseguente differenze per quanto riguarda il cambio (HDX) di idrogeno-deuterio tariffe46,53.

Abbiamo applicato questa tecnologia nelle regioni 1) Mappa Hsp33 che rapidamente si svolgono sopra l'ossidazione, che portano all'attivazione di Hsp33, 2) definire l'interfaccia di associazione potenziale di Hsp33 con il suo substrato misfolded full-length, citrato sintasi (CS)38.

I metodi descritti in questo manoscritto possono essere applicati per studiare funzioni redox-dipendente di proteine in vitro, definire attività anti-aggregazione e il ruolo dei cambiamenti strutturali (se qualsiasi) in funzione della proteina. Queste metodologie possono essere facilmente adattate a diversi sistemi biologici e applicate in laboratorio.

Protocollo

1. preparazione di proteine completamente ridotte e completamente ossidate

  1. Preparazione di una proteina completamente ridotta
    Nota: Qui, descriviamo la riduzione di proteine zinco-contenendo e uso un ZnCl2 soluzione per ripristinare lo stato di proteina ridotta, Zn-incorporato. La soluzione2 ZnCl può essere sostituita o eliminata. Si noti che il tempo e la temperatura del processo di riduzione dipende dalla stabilità della proteina e funzione ed è dunque specifici per proteina.
    1. Scongelare il campione della proteina sul ghiaccio e girarla verso il basso per rimuovere aggregati. Incubare il campione per almeno 1,5 ore a 37 ° C con 5 mM DTT e 20 µM ZnCl2 (fino al 70% di concentrazione nella proteina).
      Nota: La temperatura in questa fase è proteina-dipendente e deve essere regolata per la stabilità proteica.
    2. Rimuovere DTT utilizzando colonne di dissalazione.
      Nota: Ci sono diverse colonne disponibili di desalificazione. Il protocollo qui sotto descrive la procedura utilizzando colonne di dissalazione specifiche (Vedi Tabella materiali). Prima di utilizzare altre colonne di dissalazione, si consiglia di esaminare la loro efficienza di recupero di rimozione e proteina DTT, poiché alcune colonne di desalinizzazione possono assorbire parzialmente la proteina di interesse.
      1. Equilibrare la colonna con un tampone di fosfato (KPi) di potassio (40 mM, pH 7.5) riempiendo completamente la colonna con il buffer e lasciando che il buffer gocciolare fuori. Ripetere questo processo 2 x.
      2. Rimuovere il filtro bianco disco nella colonna delicatamente spingendolo con le pinzette e rimuoverlo; è più facile da rimuovere, mentre la colonna viene riempita con il buffer di KPi. Riempire la colonna con KPi buffer ed e centrifugare a 1.000 x g per 3 min.
      3. Trasferire la colonna in una provetta pulita, aggiungere lentamente il campione della proteina al centro della colonna ed e centrifugare a 1.000 x g per 2 min. La proteina privo di DTT è ora nel flusso continuo.
    3. Controllare le sue concentrazioni (ad esempio, utilizzare uno spettrometro UV/Vis) e misurare l'assorbanza a 280 nm. Calcolare la concentrazione di proteine utilizzando la legge di Beer.
    4. Distribuire la metà dei campioni proteici in aliquote. Incubare le aliquote in condizioni anaerobiche (ad esempio, utilizzando una camera anaerobica) per 20 min per una rimozione completa di ossigeno. Sigillare i tubi con pellicola di plastica e conservare i campioni a-20 ° C o -80 ° C, a seconda della proteina.
      Nota: Invece di utilizzare la camera anaerobica, i tubi possono essere balenati con gas argon per rimuovere l'ossigeno.
  2. Preparazione di una proteina completamente ossidata
    Nota: Si consiglia di preparare campioni di proteine ossidate da proteine completamente ridotte (descritti in precedenza). Ciò consentirà di ridurre l'eterogeneità negli Stati di ossidazione delle cisteine. È possibile utilizzare diversi reagenti ossidanti; qui, ci stiamo concentrando sul perossido di idrogeno (H2O2).
    Attenzione: Evitare eccessiva ossidazione come può portare a ponti disolfuro intramolecolari indesiderabili e ossidazione irreversibile di diversi aminoacidi, tra cui cisteina, la metionina, tirosina e altri.
    1. Per il restante campione della proteina, aggiungere 5 mM H2O2 (appena diluito) e incubare per 3 ore a 40 ° C agitando.
      Nota: La temperatura in questa fase è proteina-dipendente e deve essere regolata per la stabilità proteica.
    2. Equilibrare la colonna con KPi buffer (40 mM, pH 7.5) riempiendo completamente la colonna con il buffer e lasciando che il buffer gocciolare fuori. Ripetere questo processo 2 x.
    3. Rimuovere il filtro bianco disco nella colonna delicatamente spingendolo con le pinzette e rimuoverlo; è più facile da rimuovere, mentre la colonna viene riempita con il buffer di KPi.
    4. Riempire la colonna con KPi buffer ed e centrifugare a 1.000 x g per 3 min.
    5. Trasferire la colonna in una provetta pulita, aggiungere l'esempio di proteine ossidate lentamente al centro della colonna ed e centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti; la proteina ossidata è ora nel flusso continuo.
    6. Controllare le concentrazioni di proteina come descritto al punto 1.2.5, dividere le proteine ossidate in aliquote e conservare a-20 ° C o -80 ° C, proteina-dipendente.

2. analisi di aggregazione di diffusione della luce

Nota: Tutte le concentrazioni in questo saggio sono specifiche del chaperone e del substrato e dovrebbero essere calibrate. Tutti i buffer dovrebbero essere 0,22 µm-filtrata, come è estremamente importante che i buffer sono particelle o bolle d'aria e le provette sono pulito e privo di polvere. È molto importante utilizzare un agitatore posizionato nella cuvette in quarzo. Verifica agitatore di diverse dimensioni e forme per garantire un'efficiente miscelazione dell'intera soluzione senza produrre bolle d'aria indesiderati. Inoltre, ci sono diversi flouorospectrometers disponibili in laboratori e strutture. Qui, un fluorospectrometer specifico (Vedi Tabella materiali) è stato usato. Strumenti diversi hanno una diversa sensibilità, velocità di misura e parametri del campionatore. Pertanto, i parametri di misura esatta (ad es., larghezza di banda di emissione e di eccitazione, sensibilità e altri) dovrebbero essere ottimizzati utilizzando una proteina di aggregazione-incline nota e le sue condizioni corrispondenti. È consigliabile utilizzare dello synthase del citrato (CS) e/o luciferasi come substrati iniziali a concentrazioni nanomolari.

  1. Analisi chimica di aggregazione
    1. Preparare il substrato denaturato di incubazione 12 µM CS pernottamento in 40 mM HEPES (pH 7.5) e 4,5 M GdnCl. Al fine di preservare il pH, sciogliere il GdnCl nel 40 mM HEPES (pH 7.5).
    2. Aprire il software fluorospectrometer e andare alla misura di corso del tempo. Impostare i parametri: temperatura: 25 ° C; Λem: 360; Larghezza di banda em: 5 nm; Λex: 360; Ex della larghezza di banda: 2,5 nm; e l'intervallo di dati: 0,5 s.
    3. Preparare il campione aggiungendo 1.600 µ l di 40 mM HEPES in una cuvetta di quarzo. Inserire la provetta il portacampioni e lasciare che il campione per raggiungere la temperatura desiderata.
    4. Impostare l'agitazione a 600 giri e iniziare la misurazione finché non viene stabilita una linea di base. Mantenere l'agitazione per l'intera valutazione.
    5. Per misurare l'aggregazione di CS in assenza di un accompagnatore, a 120 s nella misurazione, aggiungere (delicatamente, ma rapidamente) 10 µ l di CS denaturato (concentrazione finale di 75 nM). Continuare la misurazione per 1.200 s.
    6. Per misurare l'aggregazione di CS in presenza di Hsp33, a 60 s nella misurazione, aggiungere Hsp33 (concentrazione finale di 300 nM). Dopo un ulteriore 60 s, aggiungere 10 µ l di CS denaturato (concentrazione finale di 75 nM). Continuare la misurazione per 1.200 s.
      Nota: Quando si aggiunge il substrato o il chaperon, al fine di evitare l'inserimento di bolle, utilizzare una pipetta 10-µ l.
  2. Analisi termica di aggregazione
    Nota: La temperatura per il dosaggio di aggregazione termica dipende la stabilità proteica e deve essere regolata in modo indipendente per ogni proteina.
    1. Aprire il software fluorospectrometer e andare alla misura di corso del tempo. Impostare i parametri come segue: temperatura: 43 ° C; Λem: 360; Larghezza di banda di emissione: 5 nm; Λex: 360; Larghezza di banda di eccitazione: 2,5 nm; e l'intervallo di dati: 0,5 s.
    2. Preparare il campione aggiungendo 1.600 µ l di pre-riscaldato 40 mM HEPES in una cuvetta di quarzo. Inserire la provetta il portacampioni e lasciare che il campione per raggiungere 43 ° C.
    3. Impostare l'agitazione a 600 giri e iniziare la misurazione finché non viene stabilita una linea di base. Mantenere l'agitazione per l'intera valutazione.
    4. Per misurare l'aggregazione di CS in assenza di un accompagnatore, a 120 s nella misurazione, delicatamente aggiungere CS (concentrazione finale di 125 nM) e proseguire con la misurazione per 1.200 s.
    5. Per misurare l'aggregazione di CS in presenza di Hsp33, a 60 s nella misurazione, aggiungere Hsp33 (concentrazione finale di 600 nM). Dopo un ulteriore 60 s, aggiungere CS (concentrazione finale di 125 nM). Continuare la misurazione per 1.200 s.
      Nota: Quando si aggiunge il substrato o il chaperone, evitare l'inserimento di bolle.
  3. Rimozione di rumore e di analisi dei dati di Kfits
    Nota: Kfits è disponibile all'uso di Kfits precedentemente è stato descritto in Rimon et al. 45
    1. Caricare il file di dati.
      Nota: L'ingresso è i risultati grezzi da misure di dispersione della luce in un formato testuale delimitato da virgole o tabulazioni.
    2. Per rimuovere qualsiasi rumore, scegliere parametri di analisi. Uso automatico modello migliore (consigliato), contrassegnare la bandiera di rumore è sempre di sopra di segnale .
    3. Rimuovere manualmente i valori erratici evidente utilizzando le linee verde e rosse regolabile; Questo passaggio consente di filtrare il rumore sopra la linea verde e sotto la linea rossa.
    4. Impostare la linea di base e la curva. Dopo aver applicato la soglia di rumore, Scarica i dati elaborati.

3. spettrometria di massa di cambio idrogeno-deuterio

  1. Preparazione dei tamponi e campioni della proteina (complesso Hsp33 e Hsp33-CS)
    1. Diluire i campioni della proteina ad una concentrazione finale di 1 mg/mL in tampone di 25 mM Tris-HCl a pH 7.5 e trasferirli in fiale da 1,5 mL.
    2. Preparare proteina-substrato campioni complessi incubando Hsp33 con CS ad un rapporto di 1: 1,5 a 43 ° C.
      1. Aggiungere CS in modo graduale per evitare qualsiasi aggregazione rapida e garantire un'associazione fruttuosa tra la Hsp33 e il CS termicamente dispiegato.
      2. Utilizzare almeno quattro passaggi (vale a dire, ogni volta che Aggiungi un quarto del volume finale) e incubare i campioni per 15 min dopo ogni aggiunta per consentire la protezione del CS di Hsp33.
    3. Rimuovere qualsiasi aggregazione utilizzando una centrifugazione di 30 min a 16.000 x g a 4 ° C.
      Nota: Nuovi complessi proteina-substrato devono essere preparate fresca. Aggiunta di substrato dovrebbe essere effettuata gradualmente; in caso contrario, si verificherà l'aggregazione. Concentrazioni di substrato, substrato e temperatura sono proteine specifiche.
    4. Preparare un buffer H (25 mM Tris-HCl, pH 7.5), che funge da controllo di deuteration, e un buffer D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), ovvero il buffer di deuteration. Anche preparare un tampone di dissetante fresca (TCEP, 3 M GdnCl, 150 mM 0,1% acido formico).
      Nota: Il buffer di tempra deve essere ottimizzato per la proteina di interesse al fine di ottenere la copertura massima sequenza dopo la digestione pepsina.
    5. Trasferire tutti i buffer e campioni in fiale e metterli in vassoi corretto. Tenere buffer H e D a 25 ° C (vassoio di 25 ° C); d'altra parte, tenere i campioni e il buffer di tempra a 0 - 2 ° C (cassetto 0 ° C). Posizionare i campioni in inserti in vetro 150-µ l (vedere la Tabella materiali) in primo luogo e poi trasferirli in fiale.
  2. Preparazione dello strumento
    Nota: Lo spettrometro di massa è dotato di due programmi software di accompagnamento: uno controlla le pompe, e gli altri controlli lo spettrometro di massa (fare riferimento alla Tabella materiali). I prossimi passi saranno descritta usando questi due programmi software.
    1. Attivare manualmente tutte le unità di raffreddamento. Una volta che tutti i sistemi di raffreddamento raggiungono la loro temperatura di destinazione, accendere manualmente sia la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e pompe di carico.
      Nota: Nel nostro caso, questi consistono di due bagni di raffreddamento e una scatola di raffreddamento (che contiene la trappola e colonne analitiche). Un'unità di raffreddamento si raffredda il vassoio a 0 ° C, mentre l'altra tiene il vassoio a 25 ° C; la temperatura del frigorifero portatile è 1-2 ° C.
    2. Aprire il software che controlla sia pompe, così come il software che controlla lo spettrometro di massa; Assicurarsi che MS è in Standby.
    3. Scollegare la valvola di scarico HPLC dalla fonte di MS e lavare il sistema prima con una soluzione "triple pulitore" (1% di acido formico, acetonitrile 33%, 33% isopropanolo, metanolo al 33%), poi con il tampone B (80% acetonitrile, acido formico 0.1%) e infine con tampone A (0,1% acido formico, pH 2,25) e poi inserire la colonna di pepsina nel sistema. Se cambiando il buffer, assicurarsi di eliminare entrambe le pompe prima di procedere.
    4. Assicurarsi che la portata per entrambe le pompe è 0,1 mL/min e la pressione è stabile.
    5. Dopo aver lavato il sistema con un flusso costante e pressione costante, inserire la presa HPLC nell'origine MS e accendere il MS.
  3. Parametri di spettrometro di massa
    1. Impostare l'ionizzazione del peptide di ionizzazione electrospray (ESI) a 175 ° C, il flusso di gas di guaina a 17 anni, il bagliore di gas aux alle 2 e la tensione di spruzzo a 4,5 kV (complementare figura 1).
    2. Impostare i parametri come indicato di seguito per i campioni non deuterated.
      1. Impostare i parametri: intervallo di scansione m/z per 300-1500; Risoluzione a 70.000; Destinazione del controllo automatico del guadagno (AGC) a 106; e il tempo di iniezione di massimo (IT) a 100 ms.
        Nota: Gli ioni più intensi 5 con Stati di carica tra + 2 e + 6 (loro intensità superiore a 1.3 x 104) e una finestra dinamica di 30 in saranno isolata.
      2. Eseguire la frammentazione di ioni di alta energia collisionale dissociazione (HCD) nella cella di collisione multipla con energia di collisione normalizzato (NCE) pari a 28. Rilevare gli ioni frammento da tandem MS ad una risoluzione di 35.000, destinazione AGC di 105, massima a 60 ms e una finestra di isolamento di 2.0 m/z.
    3. Per gli esempi di deuterato, impiegano MS1 solo con una risoluzione maggiore di 140.000 e con parametri simili.
  4. In esecuzione dell'esperimento
    1. Impostare i vassoi nel modo seguente.
      1. Posizionare il tampone H e D in vassoio 25 ° C, quindi posizionare il buffer dissetante e campioni nel cassetto 0 ° C.
      2. Posto X vuoto fiale, allineati in entrambi i vassoi, dove X = il numero di campioni x il numero di intervalli di tempo.
        Nota: Nel vassoio di 25 ° C, i flaconcini vuoti servono come vials di reazione, e nel cassetto 0 ° C, essi servono come tempra fiale.
      3. Ciascuno dei flaconcini vuoti contiene un inserto di vetro vuota; scartare e sostituire detto inserire fra gli esperimenti.
        Nota: Per eseguire l'esperimento HDX nel modo più efficiente e meno che richiede tempo, un software che consente di eseguire contemporaneamente campioni (complementare figura 2) è stato utilizzato. I prossimi passi saranno descritta usando questo software.
    2. Aprire il software. Impostare i parametri del programma per eseguire le seguenti operazioni.
      1. Incubare ciascun campione (5 µ l) con 45 µ l di tampone D per diversi minuti, a seconda dei punti di tempo selezionati (ad es., 1, 3, 18, 40 e 100 min) a 25 ° C. Incubare il campione non deuterated con 45 µ l di tampone H invece.
      2. Immediatamente dopo l'incubazione, mescolare 50 µ l di proteina deuterata in 50 µ l di tampone di tempra ghiacciata e iniettare loro in una colonna di pepsina immobilizzato (20 mm di lunghezza, diametro 2,0 mm).
      3. Eluire qualsiasi peptidi dalla colonna pepsina nella pre-colonna mediante lavaggio con tampone A 6 min a un tasso di 50 µ l/min tenere tampone A nella casella di raffreddamento a 0 ° C.
      4. Eluire i peptidi dalla pre-colonna nella colonna analitica C18 (colonna C18, 130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm x 50 mm, mantenuto a 0 ° C) e separarli mediante l'applicazione di un gradiente lineare di acetonitrile a 100 µ l/min Run del gradiente di acetonitrile utilizzando acetonitrile 100% come buffer B : 7 min a 2%, 7 min a 10-30%, 2,5 min a 30-90%, 1,5 min al 90%, pendenza rapida per 1 min 90-8% e infine equilibrare la colonna per 4 min a 2%.
    3. Costruire una sequenza di esecuzione (vedere complementare Figura 2): inserire tutti i punti di tempo, nomi di esempio e località in vassoi, come pure i nomi di buffer e posizioni.
      Nota: Il software permette l'allineamento di tutti i tempi di esercizio differenti in un programma che viene eseguito diversi campioni contemporaneamente, in modo efficiente diminuendo i tempi di esecuzione.
  5. Analisi dei dati
    Nota: Lavoriamo con diversi programmi software nel processo di analisi dei dati, tra cui Proteome Discoverer e MaxQuant (software gratuito) per l'identificazione del peptide e l'analisi di sequenza copertura, nonché workbench HDX, un software gratuito che permette l'analisi dell'incorporazione deuterio in proteine e un confronto tra i tassi di HDX tra diversi set di esperimenti. I prossimi passi saranno descritta usando questi programmi software.
    1. Analizzare la copertura del peptide del campione eseguendo i campioni di controllo non deuterated tramite il software (complementare Figura 3). Installare il software utilizzando i seguenti parametri.
      1. Utilizzare il metodo Sequest HT con un No-enzima (aspecifici) fendere. Ricerca di peptidi di aminoacidi 4-144 con una tolleranza di massa di 7 ppm e Da 0,5 per il precursore dello ione e frammento. Consentono un'ossidazione di metionina dinamico.
      2. Creare un database per la proteina, attraverso il quale il software può determinare la copertura del peptide. Esportare i peptidi identificati in formato testuale.
    2. Analizzare i risultati deuterati utilizzando il software gratuito di workbench HDX58.
      1. Aprire l'editor di proteina e definire la proteina inserendo il file di code coverage di sequenza e peptide proteina.
      2. Successivamente, aprire l'editor di sperimentare l'installazione guidata e immettere tutti gli input richiesti.
        Nota: Il programma richiede il numero di campioni, il numero di intervalli di tempo, il numero delle ripetizioni, il valore pH del buffer e la temperatura.
      3. Infine, inserire i parametri per quanto riguarda lo spettrometro di massa utilizzato, dopo di che il programma genera un elenco dei peptidi rilevati.
        Nota: Il software rileva i peptidi "HDX", ispeziona i cluster dell'isotopo e dimostra una chiara visualizzazione di deuteration nei campioni.
  6. Presentazione dei dati
    1. Etichettare le regioni con un assorbimento di deuteration deferente sulla struttura utilizzando il software PyMol o qualsiasi altro software di visualizzazione.
    2. Introdurre i livelli di assorbimento di deuterio anziché i valori di B-fattore.
      Nota: Un tutorial di base può essere trovato alla https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Risultati

I due metodi presentati rendono possibile seguire l'attività cinetica e la dinamica delle interazioni proteina chaperon e suo substrato. Inoltre, il protocollo di riduzione-ossidazione permette la preparazione di un chaperone completamente ridotta e completamente ossidata, dà una comprensione più approfondita del meccanismo di attivazione di chaperoni disordinati redox-dipendente.

In primo luogo, abbiamo usato la dispersione ...

Discussione

In questa carta, abbiamo fornito protocolli per l'analisi dell'attività di chaperone di redox-dipendente e la caratterizzazione dei cambiamenti strutturali al momento l'associazione di una proteina di client. Si tratta di metodologie complementari per definire potenziali complessi di chaperone-substrato e analizzare i potenziali siti di interazione.

Qui, abbiamo applicato questi protocolli per la caratterizzazione di un complesso tra il chaperone redox-regolati Hsp33 con un substrato ben stud...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori sono grati a Meytal Radzinski per sue discussioni utili e lettura dell'articolo e di Patrick Griffin e membri del suo laboratorio per la loro assistenza illimitata durante la creazione della piattaforma di analisi HDX critica. Gli autori sono grati per la Fondazione di tedesco-Israele (I-2332-1149.9/2012), il Binational Science Foundation (2015056), la concessione di integrazione di Marie-Curie (618806), la Fondazione di scienza di Israele (1765/13 e 2629/16) e la scienza di frontiera umana Programma (CDA00064/2014) per il loro sostegno finanziario.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plusSigma Aldrich34998-2.5Lsolvent
Formic acid Optima LC/MSFisher ChemicalsA117-50solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC gradeFisher ChemicalsP750717solvent
MethanolFisher ChemicalsA456-212solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma Aldrich252859buffer
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich76-05-1solvent
Water for HPLCSigma Aldrich270733-2.5L-Msolvent
ZnCl2, Zinc ChlorideMerckB0755416 308reagent
DTTgoldbio27565-41-9reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcareGE healthcare29-9180-07desalting column
Potassium PhosphateUnited states Biochemical Corporation20274buffer
Hydrogen peroxide 30%MerckK46809910526oxidizing agent
citrate synthasesigma aldrichC3260substrate
HEPES acid freesigma aldrich7365-45-9buffer
Gndclsigma aldrichG3272-500Gdenaturant
Deuterium Chloride Solutionsigma aldrich543047-10Gbuffer
Deuterium Oxide 99%sigma aldrich151882-100Gsolvent
TCEPbioworld42000058-2reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvetteHellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 FluorospectrometerJasco
Thermomixer ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifugeThermo Scientific
pH meter , PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter).AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm)Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock doorCOY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometerThermo-Fischer Scientific
PAL system LHX - robotic system for handling HDX samplesPAL systemhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pumpThermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pumpThermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Datahttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur softwarehttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau)http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 softwarehttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench softwarehttp://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

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