Generazione di un modello di cancro al seno metastatico murino ortotopico ed eseguendo murino mastectomia radicale

Riepilogo

Vi presentiamo un modello murino ortotopico di cancro del seno e mastectomia radicale modello con tecnologia di bioluminescenza per quantificare il carico del tumore per simulare la progressione del cancro al seno umano.

Abstract

Modelli di topo in vivo per valutare la progressione del cancro al seno sono essenziali per la ricerca sul cancro, compresi gli sviluppi preclinici droga. Tuttavia, la maggior parte dei dettagli pratici e tecnici comunemente è omessi nei manoscritti pubblicati che, pertanto, rende difficili da riprodurre i modelli, in particolare quando si tratta di tecniche chirurgiche. Bioluminescenza tecnologia consente la valutazione delle piccole quantità di cellule tumorali anche quando un tumore non è palpabile. Utilizzando le cellule tumorali che esprimono luciferasi, stabiliamo una tecnica di inoculazione ortotopico cancro al seno con un tasso alto tumorigenesi. Metastasi del polmone è stato concluso utilizzando una tecnica di ex vivo . Abbiamo, quindi, stabilire un modello di mastectomia con un tasso basso di ricorrenza locale per valutare l'onere di tumore metastatico. Qui, descriviamo, in dettaglio, le tecniche chirurgiche di impianto ortotopico e mastectomia per cancro al seno con un tasso di tumorigenesi alta e bassa percentuale di recidiva locale, rispettivamente, per migliorare l'efficienza del modello di cancro al seno.

Introduzione

Modelli animali svolgono un ruolo chiave nella ricerca sul cancro. Quando un'ipotesi è dimostrata in vitro, devono essere testato in vivo per valutare la sua rilevanza clinica. Metastasi e progressione del cancro sono spesso meglio catturati dai modelli animali rispetto ai modelli in vitro, ed è essenziale per testare un nuovo farmaco in un modello animale come uno studio preclinico per droga sviluppo^1,2. Tuttavia, i dettagli tecnici degli esperimenti sugli animali spesso non sono ben descritti in articoli pubblicati, che lo rende difficile da riprodurre con successo il modello. Infatti, gli autori che hanno stabilito questi modelli ortotopici di inoculazione e mastectomia è attraversato da lunghi e rigorosi processi di prova ed errore. Il tasso di successo del tumorigenesis dopo l'inoculazione delle cellule di cancro è uno dei fattori chiavi per determinare il successo e l'efficienza di un animale di Studio³. La linea cellulare e il numero di celle per inoculare, il sito di inoculazione e il ceppo dei topi sono tutti fattori importanti. È noto che ci sono enormi variazioni nei risultati degli esperimenti sugli animali a causa di differenze individuali, rispetto alle tecniche in vitro. Pertanto, utilizzando un modello ben consolidato con una tecnica standard è importante per ottenere risultati stabili, per migliorare l'efficienza degli esperimenti sugli animali e per evitare risultati falsi.

Questo documento fornisce tecniche ben consolidate⁴ per generare modelli del cancro al seno orthotopic e mastectomia del mouse. Questi metodi mirano 1) per simulare la progressione del cancro al seno umano e corsi del trattamento e 2) di condurre esperimenti in vivo con una maggiore efficienza e più alti tassi di successo rispetto ad altri inoculazione di cancro al seno o tecniche di mastectomia. A inoculazione di orthotopic del cancro delle cellule, per simulare la progressione del cancro al seno umano, scegliamo il cuscinetto grasso mammario #2 come un sito di inoculazione, che si trova nel petto. Nella maggior parte degli studi, le cellule di cancro al seno sono inoculate sottocute⁵. Questa tecnica non richiede intervento chirurgico e, quindi, è semplice e diretto. Tuttavia, il microambiente sottocutaneo è abbastanza differente dal microambiente della ghiandola mammaria, che si traduce nella progressione del cancro diversi e profili molecolari anche^6,7. Alcuni studi riportano la ghiandola mammaria #4, che si trova nell'addome, come un sito di inoculazione⁶. Tuttavia, poiché #4 ghiandole mammarie sono situati nell'addome, il modello metastatico più comune è la carcinosi peritoneale⁷, che si verifica con meno del 10% di carcinoma mammario metastatico cancro⁸. Cancro al seno generato dalla tecnica ha presentata qui, nella ghiandola mammaria #2, si riproduce per metastasi al polmone, che è una delle più comuni al seno cancro metastatico siti⁹.

Con questa tecnica, l'obiettivo è anche di raggiungere un più alto tasso di tumorigenesi con variabilità di dimensione minima del tumore rispetto ad altre tecniche di inoculazione del cancro al seno. A tale scopo, le cellule tumorali sospese in una miscela di proteine gelatinoso vengono inoculate sotto visione diretta attraverso un'incisione di parete di cassa anteriore mediana. Questa tecnica produce un tasso di tumorigenesi alta con minore variabilità rispetto all'iniezione sottocutanea o non-chirurgico, come precedentemente segnalato^3,7e delle dimensioni del tumore.

Introduciamo anche una tecnica di mastectomia radicale del mouse in cui il tumore al seno ortotopico è resecato con i tessuti circostanti e i linfonodi ascellari. In ambito clinico, lo standard di cura per malati di cancro al seno senza malattia di metastasi a distanza è mastectomia^10,11. Prima di una mastectomia, metastasi di linfonodo ascellare è esaminata dalla biopsia di linfonodo di imaging e sentinella. Se non c'è nessuna evidenza di metastasi di linfonodo ascellare, il paziente viene quindi trattato con una mastectomia totale o parziale, in cui la resezione di linfonodo ascellare è omesso. Mastectomia totale è una tecnica per resecare il cancro al seno con il tessuto del seno tutto in blocco, considerando che la mastectomia parziale deve resecare il tumore al seno con un margine del circostante tessuto mammario normale solo, così conservando il tessuto restante del seno normale nella paziente. Tuttavia, i pazienti che conservano la restante tessuto normale del seno dopo una mastectomia parziale richiedono radioterapia postoperatoria per evitare la ricorrenza locale¹⁰. I pazienti che hanno metastasi di linfonodo ascellare si impegnano mastectomia radicale che rimuove il cancro al seno con normale tutti i linfonodi ascellare e del tessuto del seno e invasero tessuti en bloc^10,11. Nel modello del topo, sorveglianza per radiazioni di metastasi e/o post-operatorio di linfonodo ascellare non è ragionevole o fattibile. Quindi, utilizziamo la tecnica di mastectomia radicale per evitare la metastasi di linfonodo ascellare o locale.

Inoculazione delle cellule del cancro attraverso la vena della coda è la più comune del polmone metastasi del mouse modello¹², il cosiddetto "metastasi sperimentale". Questo modello è facile da generare e non richiedono un intervento chirurgico; Tuttavia, esso non imitare la progressione del cancro al seno umano che può causare un comportamento diverso malattia metastatica. Al fine di simulare il ciclo di trattamento di cancro al seno umano cui metastasi si verifica spesso dopo mastectomia, il tumore primario è rimosso dopo inoculazione di orthotopic del cancro delle cellule. Questa tecnica produce meno ricorrenza locale rispetto alla resezione del tumore semplici, come precedentemente segnalato¹³ed è utile per nuove terapie, studi preclinici e per gli studi di ricerca del cancro della mammella metastatico. Le tecniche qui descritte sono applicabili per la maggior parte degli esperimenti di modello ortotopico di cancro al seno. Tuttavia, è importante considerare che la miscela di proteine gelatinoso può influenzare il microambiente e chirurgia può influenzare la risposta di stress/immunitario¹⁴. Pertanto, gli investigatori studiando il microambiente e/o la risposta di stress/immunitario dovrebbero essere informati di potenziali fattori di confondimento.

Protocollo

Approvazione da parte del Comitato di uso e Roswell Park Cancer completa centro animale istituzionale Care è stata ottenuta per tutti gli esperimenti.

Nota: Nove a dodici settimane-vecchi topi BALB/c femminili sono ottenuti. 4T1-luc2 cellule, una linea di cellule di adenocarcinoma mammario di topo derivata da topi BALB/c è stata studiata per esprimere luciferasi, vengono utilizzate. Queste cellule sono coltivate in mezzo 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% siero bovino fetale (FBS).

1. preparazione degli strumenti

1. Scongelare una miscela di proteina gelatinoso congelati (ad es., Matrigel) sul ghiaccio in una cappa di coltura del tessuto.
2. Pulire e autoclave due insiemi di strumenti chirurgici (microdissection forbici, pinzette Adson e un porta-aghi) prima dell'intervento. Preparare sterilizzato 5-0 suturare di seta e asciugare sterilizzante (quando sono previsti interventi chirurgici seriale).
3. Clip capelli petto middle dei topi utilizzando un clipper e contrassegnare i topi per identificazione perforando l'orecchio prima del momento dell'intervento.
4. Preparare il tavolo di procedura, che può essere immediatamente utilizzato per l'operazione.
   1. Diffondere un tampone assorbente e fissare gli angoli con del nastro, Difficoltà ogive di anestesia con nastro, mettere sterilizzante e disinfettante (clorexidina, iodio e 75% etanolo) accanto allo spazio di manovra e posizionare i topi nell'ordine di funzionamento.

2. preparazione delle cellule (per 10 topi)

Nota: Le cellule devono essere inoculate entro 1 h dopo essere distaccata dal piatto per evitare di attuabilità delle cellule in diminuzione. In particolare, la sospensione cellulare dovrebbe essere miscelata in miscela proteica gelatinosa entro 15 min dopo aver scollegato le cellule dal piatto per mantenere la loro vitalità.

1. Cultura 4T1-luc2 cellule, una linea cellulare di adenocarcinoma mammario topo esprimendo la luciferasi, in RPMI 1640 media con 10% FBS in un incubatore a 37 ° C in 5% CO₂.
2. Lavare le cellule aderenti 4T1-luc2 in un piatto di 10 cm con tampone fosfato salino (PBS) usando una pipetta sierologica di 10 mL. Aggiungere 1 mL di tripsina 0,25% utilizzando una pipetta P1000 e, quindi, incubare il campione a 37 ° C per 5 min. Quindi, aggiungere 4 mL di coltura (RPMI-1640 con 10% FBS) utilizzando un 5ml sierologici pipetta e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica 15 mL in una cappa di coltura del tessuto. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 x g per 5 min.
3. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 2 mL di PBS; quindi, contare le celle utilizzando l'emocitometro.
4. Sospendere 2 x 10⁶ cellule 4T1-luc2 in 40 μL di PBS freddo (pH 7.4, 4 ° C) nella coltura del tessuto cappa.
5. Mescolare la sospensione cellulare 40-μL con 360 µ l della miscela proteica gelatinoso in una microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio nella cappa di coltura del tessuto.
   Nota: La concentrazione finale è 1 x 10⁵20 μL (1:9 PBS: miscela gelatinosa della proteina). Per il modello ortotopico (senza mastectomia), 1 x 10⁴20 μL della concentrazione finale è stato usato, per evitare di raggiungere criteri di eutanasia (tumore dimensioni > 2 cm) entro due settimane.

3. cancro inoculazione delle cellule

1. Messo i topi in camera di induzione di anestesia con 2-4% di isoflurano e 0,2 L/min di flusso di ossigeno fino a quando i topi respirano con calma (2 – 3 min).
2. Afferrare il mouse e iniettare per via sottocutanea 0,05 mg/kg buprenorfina nella sua spalla.
3. Confermare un'anestesia adeguata dalla mancanza di reazione a un pizzico di punta. Inserire il naso del mouse nel foro della maschera del mouse, che permette di anestesia inalatoria con 2-4% isoflurane e 2 L/min flusso di ossigeno collegato ad un'unità di carbone canister.
4. Trattenere gli arti del mouse utilizzando nastro lab e sterilizzare la sua pelle utilizzando clorexidina, iodio e 75% di etanolo, utilizzando tamponi di cotone.
5. Fare un'incisione cutanea di 5 mm al centro della parete di cassa anteriore utilizzando forbici sterili microdissection, ascensore sul lato destro pelle accanto l'incisione e staccare la pelle dalla parete della cassa, usando le forbici e poi, invertire la pelle per esporre il diritto #2 cuscinetto di grasso mammario.
6. Attentamente e iniettare 20 μL della sospensione di cellule di cancro usando una siringa da insulina 1 mL con un ago di 28,5 G nel cuscinetto grasso sotto visione diretta attraverso la ferita.
   Nota: L'ago passa attraverso la ferita, non la pelle. Tenere premuto l'ago nel cuscinetto grasso per 5 prima di s a tirarlo fuori, che permette un tempo per la miscela di proteine gelatinoso a solidificare.
7. Chiudere le incisioni cutanee da cuciture, con punti di sutura non riassorbibile sterile 5-0.
8. Dopo la chirurgia, restituire gli animali in una gabbia pulita e monitorarli fino a quando essi hanno recuperato e stanno muovendo liberamente (dopo ~ 1 – 2 min). Se un animale non sembra essere in buona salute entro 24 h dalla chirurgia, amministrare buprenorfina (0,2 mg/kg).
9. Rimuovere le suture in anestesia (Vedi punto 3.1) 7D dopo l'intervento chirurgico.

4. mastectomia

Nota: La tempistica della mastectomia è molto importante. Se è fatto troppo presto, non si verifica la metastasi del polmone. Se è fatto troppo tardi, il tumore primario ha invaso i principali vasi sanguigni, che rendono difficile una completa resezione oncologica. Così, più punti di tempo sono stati testati per mastectomia determinare quale punto di tempo prodotto il giusto equilibrio in attesa per la metastasi prima resezione è diventato troppo impegnativa. Dopo oltre 50 esperimenti del mouse in questo modo, è stato dimostrato che la mastectomia a 8 giorni dopo l'inoculazione delle cellule di cancro (o quando le dimensioni del tumore raggiungono 5 mm) era l'ideale tempo punto per ottenere che l'equilibrio¹³.

1. Anestetizzare un mouse con 2-4% inalato isoflurano e iniettare buprenorfina (Vedi punti 3.1 e 3.2).
2. Trattenere il mouse e sterilizzare la sua pelle (Vedi punto 3.4).
3. Fare un'incisione cutanea di 5 mm 2 mm a sinistra dalla cicatrice chirurgica che è stata effettuata presso l'inoculazione delle cellule di cancro iniziale, usando le forbici di microdissection. Estendere l'incisione verso la radice dell'arto anteriore per rimuovere il tumore, pelle compreso la cicatrice chirurgica e la lesione a contatto con il tumore, così come il bacino di linfonodo ascellare in cui la maggior parte del tempo non esiste alcun nodo linfatico visibile al momento del mastect omy¹³. Assicurarsi di non danneggiare la vena ascellare.
4. Chiudere i difetti della pelle da cuciture, usando suture non assorbibili sterile 5-0 in forma di una "Y".
5. Lo stesso come descritto al punto 3.8, restituire il mouse ad una gabbia pulita e monitor fino a quando non hanno recuperato.
6. Rimuovere le suture in anestesia (Vedi punto 3.1) 7 giorni dopo la chirurgia.

5. bioluminescenti quantificazione del tumore primario (inoculazione di Orthotopic senza mastectomia) o metastasi del polmone (modello di mastectomia)

Nota: Per la quantificazione degli oneri di tumore primario, la bioluminescenza è misurata 2 volte alla settimana dal giorno dopo l'inoculazione di orthotopic. Per la quantificazione di metastasi del polmone, la bioluminescenza è misurata 2 volte alla settimana dal giorno dopo la mastectomia.

1. D-luciferina, sciogliere in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) ad una concentrazione finale di 15 mg/mL in una cappa di coltura del tessuto. Aliquotare in luce-schermato 1,5 mL microcentrifuga tubi. Conservare la soluzione diluita a-80 ° C.
   Nota: Per un mouse 20g, 200 µ l di diluito D-luciferina è richiesto.
2. Aprire il software di imaging e fare clic su inizializzare.
   Nota: Si impiegano circa 15 minuti per raffreddare il charge coupled device (CCD). Quando il CCD raggiunge la temperatura impostata, il colore della barra di temperatura cambia da rosso a verde.
3. Anestetizzare i topi con 2-4% isoflurane in una camera di induzione dedicato prima di formazione immagine (Vedi punto 3.1).
4. Pesare i topi.
5. Iniettare D-luciferina 150 mg/kg per via intraperitoneale nel punto di metà di-addome, utilizzando un ago di 28,5 G.
6. Montare ogni mouse con un cono di naso all'interno del sistema di imaging in posizione supina (posto un massimo di cinque topi allo stesso tempo). Mantenere l'anestesia presso isoflurane 1% - 3% (in 100% di ossigeno) attraverso i coni di naso durante l'imaging.
7. Acquisire un'immagine ogni 5 minuti per rilevare la bioluminescenza picco per 50 minuti (o fino alla bioluminescenza confermato picco).
   1. Selezionare luminescenza come Auto, Binning come Mediume campo visivo come D.
   2. Fare clic su Acquisisci per acquisire l'immagine.
8. Restituire i topi a loro strisciamenti e monitorarli finché non hanno recuperato (Vedi punto 3.8).

6. polmonare metastasi del tumore onere quantificazione di Ex Vivo Imaging

Nota: Quantificazione di metastasi del polmone è applicabile per l'inoculazione di orthotopic con e senza modelli di mastectomia. Nel modello di mastectomia, ex vivo imaging o sopravvivenza osservazione viene scelto, a seconda dello scopo. Nel modello ortotopico inoculazione (senza mastectomia), la maggior parte dei casi produrre criteri di tumore primario dimensione eutanasia (> 2 cm) circa 21 giorni dopo l'inoculazione.

1. Quantificare le lesioni metastatiche del polmone 21 giorni dopo l'inoculazione delle cellule di cancro di ex vivo imaging.
2. Anestetizzare i topi con 2-4% isoflurane in una camera di induzione dedicato (Vedi punto 3.1).
3. Pesare i topi.
4. Iniettare 150mg/kg D-luciferina intraperitonealmente (Vedi punto 5.6).
5. Eutanasia i topi di dislocazione cervicale, 15 min dopo le iniezioni.
6. Aprire l'addome tagliando la pelle e il peritoneo presso il metà di-addome, utilizzando forbici Mayo curve. Estendere l'incisione sia destra che sinistra. Estrarre il fegato con una pinza fino a quando il diaframma è visualizzato; quindi, tagliare il diaframma.
7. Utilizzando le forbici di Mayo curve, tagliare le costole bilaterale da caudale (12 costole) a cephalad (1 ° costole) per esporre i polmoni lanciando la parete del torace anteriore.
8. Identificare l'esofago toracico, che si presenta come un cordone che collega i polmoni alla colonna vertebrale, sollevando i polmoni utilizzando forcipe e, quindi, tagliare l'esofago usando le forbici di microdissection.
9. Sollevare il polmoni bilaterali e cuore usando il forcipe (applicando trazione tirando verso il basso, in direzione di cephalad a caudale) e, quindi, tagliare la trachea e i grossi vasi all'apice del polmone presso il cephalad, usando le forbici microdissection.
   Nota: Ciò consente l'isolamento del polmone e del cuore dal corpo.
10. Togliere il cuore dai polmoni utilizzando le forbici microdissection.
11. Mettere i polmoni in una capsula di Petri di 10 cm.
12. Acquisire l'immagine di bioluminescenza (vedere i passaggi 5.7.1 e 5.7.2) 5 min dopo l'eutanasia (20 min dopo l'iniezione di luciferina).

Risultati

Lo scopo del modello ortotopico è quello di imitare la progressione del cancro umano (cioè, la crescita del tumore primario seguita da metastasi linfonodali e metastasi del polmone quindi distanti)¹⁵. Dopo l'inoculazione delle cellule di cancro, la bioluminescenza è quantificata regolarmente (due o tre volte / settimana) (Figura 1A). La bioluminescenza nei polmoni è più profondo e più piccolo della lesione primaria. La b...

Discussione

Per l'ultimo decennio, abbiamo stabilito più modelli murini cancro, compresi seno cancro modelli^{3,7,13,16,20,21}. Precedentemente, abbiamo dimostrato che inoculazione di orthotopic seno cancro delle cellule nel tessuto della ghiandola mammaria sotto visione diretta prodotto un tumore più grande con minore variabilità di dim...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissection Scissors	Roboz	RS-5983	For cancer cell inoculation and masstectomy
Adson Forceps	Roboz	RS-5233	For cancer cell inoculation and masstectomy
Needle Holder	Roboz	RS-7830	For cancer cell inoculation and masstectomy
Mayo	Roboz	RS-6873	For ex vivo
5-0 silk sutures	Look	774B	For cancer cell inoculation and masstectomy
Dry sterilant (Germinator 500)	Braintree Scientific	GER 5287-120V	For cancer cell inoculation and masstectomy
Clipper	Wahl	9908-717	For cancer cell inoculation and masstectomy
Matrigel	Corning	354234	For cancer cell inoculation
D-Luciferin, potassium salt	GOLD-Bio	LUCK-1K	For bioluminescence quantification
Roswell Park Memorial Insitute 1640	Gibco	11875093	For cell culture
Fetal Bovine Serub	Gibco	10437028	For cell culture
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	For cell culture