Frequenti prelievi di punta della coda in topi per la valutazione della secrezione Pulsatile dell'ormone luteinizzante

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo di campionamento di sangue punta della coda per la raccolta del campione di frequente nei topi sfrenati. Questo metodo è utile per la valutazione dei modelli di secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante e potrebbe essere adattato per l'analisi di altri fattori circolanti.

Abstract

In molti sistemi endocrini, ormoni o fattori circolanti non vengono rilasciati continuamente, ma sono secreti come impulsi discreti in risposta ad un fattore di rilascio. Singolo punto di campionamento misure non siano sufficienti comprendere appieno il significato biologico di modello secretivo di ormoni pulsatile o in condizioni fisiologiche normali, o anche durante condizioni della disregolazione. Ormone luteinizzante (LH) è sintetizzata dalle cellule gonadotrope pituitaria anteriore e secreta in un modello pulsatile che richiede frequente raccolta di campioni di sangue per la valutazione del polso. Questo non è stato possibile nei topi fino a recentemente, a causa dello sviluppo di un dosaggio di LH di alto-sensibilità e avanzamento in una tecnica per frequente campionario a basso volume, inizialmente descritto da Steyn e colleghi. ¹ qui descriviamo un protocollo per la raccolta del campione di sangue periferico frequenti da topi con sufficiente acclimatazione di movimentazione per rilevare pulsatile secrezione di LH. L'attuale protocollo i dettagli di un periodo di acclimatazione espanso che permette la valutazione di impulsi robusti e continui di LH nel corso di più ore. In questo protocollo, la punta della coda viene ritagliata e sangue raccolti dalla coda utilizzando una pipetta tenuto in mano. Per la valutazione di LH pulsatile in topi gonadectomized, campioni di serie sono raccolti ogni 5-6 minuti per un minimo di 90-180 d'importanza, la raccolta di sangue e misurazione di impulsi robusti di LH può essere realizzati in topi svegli, liberamente si comporta, dati adeguata manipolazione acclimatazione e lo sforzo per ridurre al minimo i fattori di stress ambientale. Sufficiente acclimatazione può essere raggiunto entro 4-5 settimane prima della raccolta del sangue. Questo protocollo evidenzia progressi nella metodologia per garantire la raccolta di campioni di sangue intero per la valutazione dei pattern di secrezione LH pulsatile sopra più ore nel topo, un potente modello animale per la ricerca della neuroendocrina.

Introduzione

Funzione della gonade in mammiferi dipende dalla secrezione della gonadotropina, ormone luteinizzante (LH) e follicolo-stimolante ormone, da parte della ghiandola pituitaria. Le gonadotropine sono secernute in entrambi un motivo pulsatile o sovratensioni in risposta alla secrezione ipotalamica di GnRH (GnRH). La sintesi e la secrezione di LH e di FSH sono regolati tramite azione endocrini, paracrini e autocrini da una varietà di molecole tra cui GnRH ipotalamico, ormoni steroidi gonadici e il sistema di activina-inhibin-follistatina, come pure una miriade di condizioni fisiologiche tra cui lo stress e del bilancio energetico. ²

Il modello pulsatile di LH nel sangue nasce da uno scarico piuttosto brusco di LH nel sangue periferico, seguita da circa esponenziale eliminazione. Importanti caratteristiche del modello includono la frequenza di ogni scarico di LH e l'ampiezza della risposta LH, entrambi i quali sono dettati, in parte, dal rilascio di GnRH. dovuta alla difficoltà nel raccogliere il sangue portale ipotalamo-ipofisario per la misura di GnRH pulsante, il campionamento e la misurazione di LH è usata come un proxy GnRH regolazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. Di conseguenza, le informazioni critiche sono codificate nella frequenza e l'ampiezza degli impulsi di LH, che non può essere determinata da un singolo campione.

Analisi della secrezione pulsatile di LH sono stato storicamente limitato ai grandi mammiferi (esseri umani, primati e pecore) a causa del loro sangue grande volume e tolleranza per la raccolta del campione di sangue frequenti. Nei roditori, prelievo di sangue frequenti era limitato al ratto e raggiunto tramite indwelling catetere atriale. ^{3 , 4} il relativamente basso costo e la disponibilità di genetica (ad es. cre-lox, CRISPR) e manipolazioni complesse circuito neurale (per esempio optogenetica, chemogenetics) rendono topi un organismo modello attraente; Tuttavia, realizzazione di campioni di sangue frequenti e successiva analisi delle concentrazioni di LH è fino a recentemente, dimostrato sfuggente. Tale compito monumentale è stata introdotta da Steyn e colleghi di lavoro. ¹ da allora, diversi laboratori hanno iniziato a utilizzare frequenti prelievi e analisi di LH ultra-sensibili per valutare pulsatile secrezione del LH in una varietà di paradigmi sperimentali. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} si noti che il perseguimento di un metodo pratico di raccogliere più campioni di sangue dai topi è stato in corso per almeno 40 anni¹⁰ con più perfezionamenti fatto lungo la strada. ^{11 , 12}

Valutazione dei modelli di impulso del LH (cioè frequenza e ampiezza) rappresenta un importante affinamento in monitoraggio secrezione della gonadotropina basale in questo modello animale geneticamente trattabile. Tradizionalmente, le concentrazioni di LH in topi sono state determinate in un campione di sangue. Una debolezza di singolo-punto campioni è un set di dati altamente variabile perché le concentrazioni di LH sono naturalmente fluttuanti durante ogni impulso. Un altro punto debole è che misure isolate perdere intrinsecamente critiche informazioni veicolate dai pattern di secrezione di impulso del LH. Così, un metodo per la raccolta di campioni di sangue frequenti a comportarsi liberamente, topi sfrenati (ad eccezione di manipolazione delicata durante il campionamento) fornirà informazioni avanzate e rivelarsi utili per molti laboratori indagando la regolazione dell'ormone pulsatile.

Qui, descriviamo un protocollo per la raccolta di frequente (ogni 6 min) campioni dai topi svegli, sfrenati di sangue. D'importanza, includiamo una gestione protocollo di acclimatazione che consente per rilevamento affidabile e continuo della secrezione pulsatile di LH in campioni di sangue intero raccolti nel corso di un periodo di tempo in cui pre- e Post-assesment ad una sfida acuta può essere determinato, come la risposta allo stress psicosociale di immobilizzazione e contenimento. Un dosaggio efficace per le concentrazioni di LH da campioni di sangue intero è stato descritto in precedenza; ¹ il presente protocollo è focalizzato su un metodo per raccogliere i campioni di sangue per la misura di impulso del LH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Il metodo qui descritto è in accordo con gli istituti nazionali di salute Animal Care e linee guida sull'uso e sono state autorizzate dal comitato di impiego presso l'Università di California, San Diego e istituzionali Animal Care.

1. acclimatazione alla movimentazione

1. Procedura di gestione dei
   1. Del mouse posto gabbie nella cappa di biosicurezza. Rimuovere il primo mouse dalla gabbia e posto su una superficie idonea (ad es. un coperchio gabbia pulita) all'interno della cappa di biosicurezza.
   2. Frenare dolcemente il mouse sul piano di lavoro tenendo la base della coda con il dito indice e il pollice di una mano. Quindi, saldamente corsa la superficie ventrale della coda, dalla base fino alla punta della coda, con l'indice e il pollice di altra mano. Ripetere l'operazione che segna 6 volte (cioè 1 insieme) e tornare il mouse alla sua gabbia.
   3. Attendere 6 min e ripetere il punto 1.1.2.
      Nota: In totale, passo 1.1.2 verrà ripetuto 4 volte per topo (cioè 4 gruppi di 6 colpi), così che ogni mouse riceverà un totale di 24 colpi di coda ogni giorno di trattamento.
2. La frequenza di maneggiamento quotidiano
   1. Da cinque fino a due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, è necessario gestire topi come descritto al punto 1.1, cinque giorni alla settimana (topi non vengono gestiti il sabato o la domenica fino alle ultime due settimane di acclimatazione).
   2. Se il trattamento sperimentale durante il periodo di campionamento includerà qualsiasi movimentazione aggiuntiva (ad esempio scruffing o iniezione intraperitoneale), acclimatare i topi a questa attività di manipolazione durante ogni sessione di trattamento.
      Nota: Per l'acclimatazione alle procedure di iniezione, utilizzare un ago smussato per eseguire una finta iniezione.
   3. Durante le due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, è necessario gestire topi come descritto in 1.1, sette giorni alla settimana.
   4. Almeno due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, casa topi a coppie per minimizzare le interruzioni ai topi durante il campionamento.

2. preparazione di provette per prelievo ematico

1. Preparare il tampone di dosaggio ultrasensibile LH in bottiglia di vetro: 0,2% di albumina di siero bovino e 0.05% Tween-20 in PBS [0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na₂HPO₄ (anidro), 0,24 g KH₂PO₄, acqua ultrapura a 1 L, pH 7.4, filtro e autoclave] , conservare a 4° C. ¹
   Nota: Volume di tampone di dosaggio ultrasensibile LH essere preparati può essere calcolato basato sul numero di campioni e il volume per esempio come indicato di seguito (2.2 & discussione)
2. Preparare le provette per prelievo ematico (microcentrifuga 0,6 mL). Tubi e tampone aliquota etichette (57 µ l di tampone per tubo; notare, questo volume può variare a seconda del volume di sangue prelevato o il rapporto del sangue per il buffer desiderato). Tubi può essere preparato giorni prima del campionamento, conservare a 4 ° C.

3. prelievo sangue

1. Preparazione di materiali di raccolta del sangue.
   1. Preparare il gabinetto di biosicurezza per l'uso e organizzare i seguenti materiali nella cappa o su un carrello è vicino a: 10 µ l (set di 3 µ l o volume di raccolta di sangue desiderata), puntali di pipetta, Pattumiera per puntali usati, timer, stampa con numero di animali e campione numeri ( per le note relative ai problemi di campionamento o animale), ghiaccio secchio con tubi di raccolta sangue, forbici e piccola garza (2 "x 2").
      Nota: Il "contare" funzione su un timer di laboratorio è utile perché non ha un allarme acustico che potrebbe disturbare i topi
   2. Utilizzare un pennarello per segnare la coda di ogni mouse (vicino alla base) per semplificare l'identificazione rapida del mouse corretto durante il campionamento.
2. Ritaglio della preparazione coda e pre-sangue raccolta.
   1. A 45 min prima dell'inizio della raccolta sangue, rimuovere il primo mouse dalla sua gabbia e posto su una superficie adatta (un coperchio gabbia pulita funziona bene) all'interno della biosicurezza armadietto.
   2. Usare le forbici taglienti, sterile per rimuovere 1-2 mm della punta della coda di topo, seguendo la preparazione asettica (cioè strofinare con alcol e betadine).
      Nota: Questo può essere ottenuto in animali svegli con dolce fermo o nell'ambito dell'anestesia isoflurano.  Inoltre, l'analgesia essere effettuato seguendo la raccomandazione del IACUC locale.
   3. Corsa con attenzione la coda del mouse, come descritto in precedenza (1.1.2; 1-2 colpi sono generalmente sufficienti) fino a quando la goccia di forme di sangue sulla punta della coda.
   4. Utilizzare una pipetta con punta pulita per raccogliere 3 µ l di sangue dalla punta della coda ed eliminare il puntale della pipetta con sangue.
   5. Prima di restituire il mouse alla sua gabbia, garantire che il flusso di sangue è stata interrotta. Se necessario, applicare una leggera pressione con una garza sterile.
   6. Ripetere i passaggi 3.2.1 - 3.2.5 per tutti i topi. Campioni di sangue successive possono essere raccolti da saldamente carezze coda di topo fino a una gocciolina di forme di sangue sulla punta della coda.
      Nota: Se una gocciolina di sangue non forma dopo colpi di fermi, la coda può essere tamponò con una garza imbevuta di soluzione fisiologica. I grumi sono più propensi a forma durante il campionamento meno frequente (cioè > intervalli di 15 min). Una volta che il coagulo è cancellato dalla vena, il campionamento può continuare.
   7. Continuare a raccogliere 3 µ l di sangue da ogni mouse come descritto sopra ogni 6 min per circa 45 min durante questo periodo di preparazione del pre-sangue raccolta. Eliminare la punta di sangue e pipetta.
3. Prelievo di sangue
   1. Raccogliere 3 µ l di sangue dalla punta della coda come descritto sopra. Prendere le dovute precauzioni per assicurare che l'intero campione di 3 µ l si tenga la punta della pipetta (senza bolle o contaminazione di biancheria da letto). Espellere il campione di sangue nel tampone in una provetta etichettata. Mescolare per inversione e tornare il tubo al ghiaccio.
   2. Prima di restituire il mouse alla sua gabbia, garantire che il flusso sanguigno ha smesso. Se necessario, applicare una leggera pressione con una garza sterile.
   3. Ripetere i passaggi 3.3.1 - 3.3.2 per ogni mouse, ogni 6 min, per la durata di campionamento predeterminati. Monitorare ogni animale per segni di sofferenza (per esempio parzialmente chiuse le palpebre, posizione ricurva [non causato da altro trattamento] o mancanza di risposta al trattamento) e terminare il campionamento, se necessario.
      Nota: Disagio comportamentale o altre complicazioni che richiedono la risoluzione di campionamento si presentano estremamente raramente nel nostro laboratorio.
   4. Se gli animali non sono euthanized dopo prelievo di sangue, è necessario garantire che il flusso di sangue dalla punta della coda è interrotto completamente. Pulire qualsiasi sangue versato dall'interno di ogni animale in gabbia (o cambiamento gabbie) e restituire le gabbie degli animali alla cremagliera di alloggiamento.

4. l'elaborazione e l'analisi del campione

1. Conservare i campioni di sangue a-20 ° C fino all'analisi.
   Nota: Il LH è analizzata in campioni di sangue intero diluiti in tampone del saggio; Nessuna separazione del siero o del plasma è necessaria prima del deposito o analisi.
2. I campioni di sangue di dosaggio ultrasensibile Elisa come descritto in precedenza i valori¹ e relazione in ng/mL di sangue intero dopo la correzione per la diluizione del volume campione nel tampone.
3. Identificare gli impulsi LH nel set di dati. Calcolare e confrontare Ampiezza impulso media e frequenza dell'impulso (o intervallo di Inter-impulso) come appropriato per il set di dati.
   Nota: Criteri pubblicati^13,14 e programmi, sono disponibili^15,16 per il rilevamento di impulsi di LH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Rappresentante modelli impulso del LH 4 topi sono illustrati nella Figura 1 (dati ristampati da Yang et al., 2017). LH è stata misurata in campioni di sangue frequenti per determinare la risposta ad una sfida sforzo psicosociale acuto. Topi C57/Bl6 femminili adulti erano ovariectomizzati e gestiti come dettagliate nel presente protocollo per la raccolta del sangue frequenti. I campioni di sangue sono stati raccolti per i primi 90 min in tutti gli an...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Qui descriviamo un protocollo per la raccolta di sangue frequenti tutta la punta della coda dei campioni di sangue per la valutazione della secrezione pulsatile di LH in topi. Questo protocollo consente il prelievo di campioni per il rilevamento di cambiamenti acuti nella pulsatile secrezione del LH dopo esposizione a stress psicosociale ed è particolarmente adatto per la valutazione degli impulsi LH sotto altre manipolazioni acute o croniche.

Un componente critico di questo protocollo per la...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biosaftey cabinet	Lab Products Inc	L/F-B
Bovine serum albumin	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (anhydrous)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Ultrapure water	Millipore		Purified and filtered water
Broome Rodent Restraint Device	Harvard Apparatus	52-0460	Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.
DynPeak	n/a	n/a	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001