Un modello di osteogenesi di distrazione del topo

Riepilogo

Vi presentiamo un modello di osteogenesi di distrazione tibial del topo sviluppato utilizzando un distrattore su misura. L'uso di un mouse come un obiettivo di analisi è vantaggioso per far progredire la ricerca.

Abstract

L'osteogenesi di distrazione (DO) è una procedura chirurgica che comporta la rigenerazione del tessuto scheletrico senza trapianto di cellule. Un modello si compone dei seguenti tre fasi: la fase di latenza dopo osteotomia e posizionamento del distrattore esterno; la fase di distrazione, in cui l'estremità dell'osso separati sono gradualmente e continuamente distratto; e la fase di consolidamento. Questo distrattore su misura utilizzato per è composto da due anelli di resina acrilica incompleto e un tassello ad espansione. Il processo è stato avviato facendo uno stampo con il materiale da impronta in silicone e quindi creando il distrattore su misura. Resina dentale è stata versata nella cassaforma fatta di materiale da impronta in silicone, ed è stato permesso di polimerizzare per creare anelli incompleti resina necessari per il distrattore su misura. Questi anelli sono stati fissati con una vite di espansione utilizzando resina trasparente. Il distrattore su misura creato tramite questo approccio è stato fissato alla tibia di topi. La tibia è stata fissata al dispositivo utilizzando una coppia di aghi 25g prossimalmente, una coppia di aghi 27 G distalmente e resina acrilica. Dopo un periodo di latenza di 5 giorni, la distrazione è stata avviata a una velocità di 0,2 mm/12 h. L'allungamento è stato continuato per 8 giorni, risultando in uno spazio totale di 3,2 mm. I topi sono stati sacrificati 4 settimane dopo la distrazione. Formazione dell'osso nello spacco di distrazione è stata confermata usando sia la radiografia e l'istologia.

Introduzione

L'osteogenesi di distrazione (DO) è un metodo di trattamento stabilito per una varietà di disturbi scheletrici, quali discrepanze di lunghezza degli arti, difetti dell'osso e di deformità degli arti¹. Questa strategia di trattamento unico si basa sul "principio di tensione-stress" proposta da Ilizarov. Il metodo richiede diversi giorni per latenza, diverse settimane per attiva di distrazione e diversi mesi per il consolidamento, fino a quando l'osso maturo è formata².

Le condizioni di ipossia locale a causa del blocco del sangue flusso^3,4 e stimolazione meccanica^5,6 sono particolarmente importanti nel processo di guarigione di DO. L'angiogenesi indotta da ipossia trasporta ossigeno, sostanze nutritive, fattori solubili e cellule necessarie per la riparazione dei tessuti localmente attraverso il flusso sanguigno. Lo stimolo meccanico dall'operazione di estensione provoca reazioni biologiche quali la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali, formazione dell'osso, la calcificazione ed il ritocco. Seriale trattamento permette la formazione di non solo tessuti duri, ma anche dei tessuti molli, compresi i nervi, muscoli, vasi sanguigni e dei tessuti della pelle, senza la necessità di trapianto di cellule staminali. Di conseguenza, un modello è considerato un eccellente modello per analizzare la rigenerazione di vari tessuti.

Conigli e cani sono gli animali più ampiamente usati nella ricerca di base per fare; Tuttavia, ci sono alcuni strumenti di analisi disponibili per questi animali. L'utilizzo di un modello di topo facilita un'analisi più dettagliata. È particolarmente adatto per esperimenti utilizzando topi knockout. Tuttavia, quando si utilizza un mouse come un animale sperimentale, un dispositivo di estensione deve essere creato. Qui, vi presentiamo un mouse tibial modello sviluppato utilizzando un distrattore su misura creato utilizzando uno strumento di laboratorio odontotecnico e tecnica, che è stato utilizzato in uno studio precedente.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo protocolli approvati dal comitato di uso della nostra istituzione e cura degli animali. Sterilizzare tutti gli strumenti prima della procedura.

1. preparazione di uno stampo per creare il distrattore su misura

1. Fanno due squilli incomplete (diametro esterno, 20 mm; diametro interno, 10 mm), che sono una parte del distrattore, con un unico foglio di cera di paraffina (145 mm x 74 mm) utilizzando un intagliatore di cera di Evans.
   1. Fare 4 dei pezzi stessi. Utilizzare una spatola cera riscaldata con un bruciatore a gas. Impilare i quattro anelli per uno spessore di 5 mm. fornire spazio per la vite di espansione e ago, 8 x 2 mm e 5 mm x 2 mm rispettivamente con il carver cera Evans (figure 1A, 1B).
2. Incorporare modelli in cera nel materiale da impronta in silicone e creare uno stampo per gli anelli di resina (Figura 1C).
3. Dopo l'indurimento il materiale da impronta in silicone (circa 5 min a temperatura ambiente), rimuovere i modelli in cera.

2. produzione del distrattore su misura

1. Applicare vaselina sottilmente e uniformemente lo stampo in silicone. 3 g di polimerizzazione resina dentale di mescolare e versare immediatamente nello stampo in silicone. Impostare per 5 min a temperatura ambiente (TA).
2. Rimuovere l'anello di resina polimerizzata dallo stampo e lucidare con una barra in metallo duro e un micromotore per rimuovere la bava (1 minuto circa). Due anelli di resina sono necessari per ogni distrattore su misura.
   1. Ripetere la procedura per creare il numero richiesto di anelli di resina (Figura 1D).
3. Lasciare uno spazio di circa 2 mm per fissare gli anelli di resina con cera di utilità e proteggere l'esterno della vite espansione completamente con resina trasparente. Impostare la resina per 5 min a TA. Quando la polimerizzazione è completa, rimuovere il pomello a vite di espansione (Figura 1E).

3. protocollo chirurgico

1. Utilizzare topi maschi di 8 settimane.
2. Indurre l'anestesia con un'iniezione intraperitoneale di medetomidina cloridrato a 0,3 mg/g, midazolam a 4 mg/kg e butorfanolo tartrato 5 mg/kg del peso corporeo.
   1. Attentamente la barba e disinfettare l'area chirurgica con soluzione di iodio 10% e quindi, amministrare 0,5% lidocaina cloridrato presso l'arto inferiore destro.
3. Fare un'incisione longitudinale della pelle (circa 15 mm di lunghezza) a destra abbassare la gamba con un bisturi n. 15. Senza mezzi termini separare i muscoli sottostanti, facendo attenzione a non per rimuovere tutti del periostio. Approccio dall'esterno per raggiungere facilmente il perone. Tagliare il perone con le forbici.
4. Impugnare la caviglia con pinze sterili sottile strette e usare un ago sterile di 27 G per fare un buco nell'osso circa 5 mm dal tallone. L'ago deve penetrare la pelle, ossa e pelle in quell'ordine. Quando l'ago penetra, tagliare la punta e la radice con una pinza in modo che l'ago è di circa 15 mm.
   1. Fare un altro buco nello stesso modo, circa 2 – 3 mm prossimale. Tenere intorno alla caviglia e passare due aghi 25g sotto il ginocchio nello stesso modo. Dopo gli aghi penetrano, tagliate le punte e le radici con una tenaglia (Figura 1,F).
5. Posizionare il distrattore su misura tale che è parallela alla direzione di estensione. Difficoltà gli aghi e dispositivo con sufficiente resina dentale di polimerizzazione per riempire i solchi del dispositivo. Attendere la polimerizzazione completare (circa 5 min) (Figura 1G).
6. Fare attenzione a non danneggiare i tessuti circostanti. Tagliare la metà della diafisi della tibia utilizzando un disco di taglio molto sottile durante l'applicazione di una soluzione salina (1 – 2 mL).
7. Chiudere la ferita con una sutura in nylon 4-0.
8. Dare le iniezioni sottocutanee di buprenorfina (0,1 mg/kg) per analgesia subito dopo l'operazione. Continuare buprenorfina ogni 12 h attraverso giorno postoperatorio 7 e come necessaria in seguito.

4. distrazione protocollo

Nota: Ci sono vari rapporti sul tasso di distrazione e periodo di latenza, ma qui, sono indicati i protocolli rappresentativi.

1. Dopo un periodo di latenza di 5 giorni, start distrazione a una velocità di 0,2 mm/12 h. Per estensione, utilizzare il pin collegato alla vite di rapida espansione. Spostare il perno nella direzione della freccia gialla attaccata alla vite di estensione (Figura 1E).
2. L'anestesia non è necessaria durante l'estensione. Tenere la coda con il mignolo e il palmo e fissare il dispositivo di estensione con l'indice e il pollice.
3. Eseguire estensione (0,2 mm per 1/4 di giro). Continuare allungamento per 8 giorni, che si tradurrà in uno spazio totale di 3,2 mm.

5. analisi

1. Analisi della radiografia: dopo il completamento dell'estensione, valutare la rigenerazione ossea con tomografia computata in anestesia generale utilizzando 2,0% isoflurane.
   Nota: Se la cura è stata presa per quanto riguarda la posizione del dispositivo di estensione, è possibile valutare con la semplice radiografia anche con la periferica collegata.
2. Analisi istologica: rimuovere l'apparecchio con cautela per non causare una frattura distrazione durante il campionamento. Fissare il campione in 10% formalina neutra tamponata per 24 h a temperatura ambiente. Effettuare la decalcificazione con soluzione di Morse (citrato di sodio 10%, 20% acido formico) durante la notte a 4 ° C.

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Risultati

Figure 1A e 1B presentano anelli incompleti (esterno diametro, 20 mm interno diametro, 10 mm; spessore 5 mm) con cera di paraffina. Due modelli in cera sono stati incorporati nel materiale da impronta in silicone, e uno stampo per gli anelli di resina (Figura 1C) è stato formato. Resina polimerizzata immediatamente è stata versata in questo stampo, e anelli di resina sono stati ottenuti (

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Discussione

Quando un animale di grandi dimensioni viene utilizzato come modello sperimentale, può essere utilizzato un dispositivo di estensione già pronti, ed è facile da ottenere buon fissaggio e valutare l'operazione di estensione stessa e la quantità di estensione. Tuttavia, quando il mouse è utilizzato come modello sperimentale, è necessario sviluppare alcune o tutte le attrezzature. Isefuku et al. e Tay et al ha fatto il dispositivo e creato un mouse modello^7,

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin wax	YAMAHACHI DENTAL MFG. CO.	-	For preparation a mold for resin rings
Labocone putty	GC Corporation	-	For preparation a mold for resin rings
Utility wax	GC Corporation	-	For preparation a mold for resin rings
Expansion screw	Ortho Dentaurum	600-301-30	Component of custom-made distractor
Unifast III	GC Corporation	-	Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor
Ortho Crystal	NISSIN	-	Transparent resin Component of custom-made distractor
25 G needle	TERUMO	NN-2516R	For custom-made distractor
27 G needle	TERUMO	NN-2719S	For custom-made distractor
ICR mouse	Chubu Kagaku Shizai Corporation	-	Experimental animal
Somnopentyl	Kyoritsu Seiyaku	-	Pentobarbital sodium salt
Isoflurane	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	099-06571	Isoflurane inhalation solution