Spettrometria di massa di foglia Spray: Una tecnica di ionizzazione ambiente rapido per valutare direttamente metaboliti dai tessuti vegetali

Riepilogo

Spettrometria di massa di foglia spray è una tecnica di analisi chimica diretta che riduce al minimo la preparazione del campione ed Elimina cromatografia, consentendo per la rilevazione rapida di piccole molecole da tessuti vegetali.

Abstract

Le piante producono migliaia di piccole molecole che sono diversi nelle loro proprietà chimiche. Spettrometria di massa (MS) è una tecnica potente per l'analisi dei metaboliti vegetali perché fornisce pesi molecolari con alta sensibilità e specificità. Spruzzo del foglio MS è una tecnica di ionizzazione ambientale cui tessuto vegetale è utilizzato per l'analisi chimica diretta tramite electrospray, eliminando cromatografia dal processo. Questo approccio alla degustazione di metaboliti permette di essere rilevati simultaneamente dai tessuti vegetali intatto, riducendo al minimo la quantità di preparazione dei campioni necessari per una vasta gamma di classi chimiche. Quando viene utilizzato con una MS di massa ad alta risoluzione, accurata, spruzzo del foglio MS facilita il rilevamento rapido di metaboliti di interesse. È anche possibile raccogliere dati di frammentazione tandem massa con questa tecnica per facilitare un'identificazione di composta. La combinazione di misure accurate di massa e la frammentazione è utile nel confermare identità composta. Lo spray di foglia tecnica MS richiede solo piccole modifiche a una sorgente di ionizzazione nanospray ed è uno strumento utile per espandere ulteriormente le funzionalità di uno spettrometro di massa. Qui, il tessuto fresco foglia da Sceletium tortuosum (Aizoaceae), una pianta medicinale tradizionale dal Sud Africa, è analizzato; numerosi mesembrine alcaloidi vengono rilevati con spruzzo del foglio MS.

Introduzione

Le piante contengono una vasta gamma di piccole molecole con proprietà chimiche diverse. MS è una tecnica potente per l'analisi dei composti vegetali perché può fornire composizioni elementale con un'alta sensibilità e specificità per la rilevazione e l'identificazione di metaboliti¹. Più comunemente, MS viene eseguita su campioni estratti con solvente, che sono separati mediante cromatografia a prima analisi MS¹. Tuttavia, l'uso della cromatografia liquida (LC) richiede tempi di analisi lunga e spesso è associato con un vasto campione preparazione¹. Al contrario, analisi chimica diretta dei tessuti intatti che elude la cromatografia è una tecnica molto rapida, che necessitano di preparazione minima del campione². Così, in casi dove possono essere rinunciati passaggi cromatografici, un'analisi chimica diretta può essere molto vantaggiosa.

Tipico di LC-MS per la ricerca di prodotti e metabolomica naturale si basa su estrazioni lunga massa di materiali secchi o surgelati vegetali contenenti più tessuti e delle cellule tipi³. In alternativa, analisi chimica diretta, ad esempio il rilevamento di MS di metaboliti da tessuto vegetale, possono isolare tipi cellulari ed evitare artefatti di preparazione⁴. Spruzzo del foglio MS, noto anche come tessuto-spray^5,6, è una tecnica di ionizzazione ambiente diretto MS, che richiede essenzialmente, nessuna preparazione del campione^5,7. Spruzzo del foglio che MS è collegato strettamente a spruzzo di carta MS, una tecnica di ionizzazione ambiente con caratteristiche di ionizzazione electrospray che consente il rilevamento degli analiti che si depositano sulla carta⁷. A dispetto del nome, spruzzo del foglio MS è applicabile ai vari tipi di tessuti vegetali, lascia non solo è stato dimostrato su frutta, semi, radici, tessuti floreali e tuberi, tra gli altri^{6,8,9, 10,11,12}. La tecnica facilita l'ionizzazione di sostanze fitochimiche endogena direttamente da materiali vegetali nello spettrometro di massa per rilevamento⁸. Spruzzo del foglio MS può anche fornire informazioni sulla distribuzione spaziale delle sostanze chimiche nei tipi differenti del tessuto in piante¹³. Quando spruzzo del foglio MS viene confrontato con l'estrazione con solvente e LC-MS, i risultati indicano spruzzo del foglio che MS consente il rilevamento rapido dei metaboliti superficie da tipi di cella univoci come tricomi¹³. La figura 1 illustra la struttura sperimentale di foglia spray MS. Ionizzazione electrospray diretto si verifica solo le modifiche di origine secondaria. Un'alta tensione viene applicata al tessuto della pianta tramite una fascetta metallica, producendo uno spray di goccioline molto caricate formando un cono di Taylor che trasporta gli ioni e la presa dello ione della sig. ra Electrospray ionizzazione avviene dal liquido naturale della pianta o dal solvente appl IED a superficie della pianta. A punta sul tessuto facilita l'electrospray e possa essere naturalmente presenti in natura o creati dal taglio.

Spruzzo del foglio MS è un metodo veloce per l'analisi qualitativa e semiquantitativa di tessuti vegetali intatto che hanno trovato il programma di utilità per una vasta gamma di applicazioni. Ad esempio, la tecnica è stata utilizzata per rilevare composti endogeni per distinguere specie affini e anche per valutare i cambiamenti nella stessa specie coltivate in condizioni diverse. Studi precedenti hanno dimostrato questo approccio misurando metaboliti in beautyberry (Callicarpa L.) ¹² e ginseng americano (Panax quinquefolium L.) ⁶. in quest'ultimo esempio, ginsenosidi, gli aminoacidi e gli oligosaccaridi potrebbero essere rilevati dopo aver bagnato del tessuto ginseng crudo. Ginseng americano coltivate e selvatiche sono stati differenziati da tubero fette⁶. Spruzzo del foglio successivo MS, che ha permesso per una successiva ispezione morfologica e microscopica⁶era preservare l'integrità di tubero di ginseng. Inoltre, possono essere individuati anche composti esogeni su campioni di piante. Un numero di pesticidi (acetamiprid, difenilammina, imazalil, linuron e tiabendazolo) è stato rilevato sulla buccia o polpa di frutta e verdura⁹. Mentre questi studi e molti altri hanno dimostrato l'utilità di spruzzo del foglio MS per vari scopi specifici, un protocollo dettagliato precedentemente non è stato segnalato.

Qui, la descrizione di protocollo non si concentrerà sull'ottimizzazione del metodo per un tessuto specifico o composti. Piuttosto, la rilevazione di mesembrine alcaloidi di Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) viene utilizzata come esempio per discutere le misure di ottimizzazione necessarie che dovrebbero essere prese durante l'impostazione di un esperimento di MS foglia spray per una specie, tessuto, o presenti per la prima volta. S. tortuosum è una succulenta endemica nella regione di Karroo semi-aride del Sud Africa. Una medicina tradizionale del San e Khoi Khoi i popoli, è stato usato per la soppressione dell'appetito e della sete, anche per quanto riguarda i suoi effetti psicotropi e analgesici^14,15. Attualmente, gli estratti standardizzati sono utilizzati per il trattamento di patologie neuropsichiatriche e neuropsicologiche^16,17. I composti primari di interesse includono il mesembrine dell'alcaloide e suoi derivati, molti dei quali si trovano anche correlate Sceletium specie¹⁵. Popolazioni coltivate e selvatiche di S. tortuosum hanno concentrazioni variabili di alcaloidi mesembrine, presentando così un controllo di qualità sfida¹⁸. Un metodo per la determinazione rapida di alcaloidi mesembrine, come spruzzo del foglio MS, può essere utile nel monitoraggio Sceletium prodotti. Perché in precedenza, c' non era stato nessun protocollo sperimentale visual dettagliato per lo spray foglia tecnica MS, ci illustrerà il metodo utilizzando l'esempio di S. tortuosume viene descritto quanto segue: la modifica di un'origine nanospray, il selezione e preparazione dei tessuti vegetali, l'acquisizione dei dati, l'interpretazione dei risultati e l'ottimizzazione dei parametri MS.

Protocollo

1. le modifiche all'origine Nanospray per foglia spruzzare MS

1. Utilizzare un'origine nanospray modificate per spruzzo del foglio MS. Come nessun componenti fluidici sono necessari per spruzzo del foglio MS, è possibile modificare l'origine rimuovendo la sonda LC dall'origine.
2. Assemblare il filo MS di spruzzo di foglia si applicherà la tensione al tessuto della pianta con il perno adatto per collegare la sorgente. Saldare il perno a un'estremità di un filo isolato; un morsetto all'estremità opposta del filo di saldatura.
   Nota: Il morsetto (alligator clip tipo) può o non può avere i denti. Per piccolo tessuto, un morsetto senza denti è preferito. Un braccio flex opzionale con un morsetto può essere aggiunti all'origine nanospray per facilitare il posizionamento del tessuto vegetale. Nota che questo protocollo in particolare viene descritto come eseguire spruzzo del foglio MS su un analizzatore di massa di ibridi quadrupolo trappola ionica sistema MS (Vedi la Tabella materiali); Tuttavia, altri sistemi MS possono essere modificati per eseguire questa tecnica⁶. Spruzzo del foglio di accoppiamento MS con un'analisi chimica in tempo reale portatile spettrometro di massa può essere eseguita sul posto senza la necessità di trasportare il materiale vegetale per il laboratorio^19,20.
3. Posizionare un tappetino antistatico al piano sottostante l'origine per ridurre la scarica elettrica che può verificarsi dall'origine utilizzando alte tensioni.

2. preparazione del sistema MS per foglia Spray MS

1. Se il sistema è stato recentemente in uso, lasciarlo raffreddare al tatto e rimuovere qualsiasi fonte alternativa e il cono di sweep. Associare la fonte di MS nanospray spruzzo di foglia.
2. Creare un file tune con i parametri appropriati ionizzazione impostati come segue: guaina, ausiliare e gas di espulsione a 0; la tensione di spruzzo a 2-5 kV; la temperatura capillare a 150-250 ° C; e il livello di S-obiettivo RF a 50. Salvare il file di sintonia con i parametri desiderati^8,13. Ottimizzare la tensione e la temperatura per l'ionizzazione migliore del tessuto e presenti di interesse.
   Nota: Sono buoni punti di partenza 4 kV e 200 ° C.
3. Creare un file di metodo incluso il foglia spray MS tune file con: MS completo positivi e negativi; una risoluzione di 70.000; un obiettivo AGC di 1 x 10⁶; un massimo di 200 ms; e l'intervallo di scansione desiderata m/z. In alternativa, utilizzare solo 1 polarità.

3. preparazione dello strumento, solventi e tessuto vegetale

Nota: Sempre indossare guanti e non utilizzare tessuto vegetale che è stato gestito con le mani nude. In caso contrario, gli ioni di contaminanti come il polietilene glicole dominerà gli spettri.

1. Portare i tessuti vegetali per l'analisi per la stessa camera come il sistema MS consentono per un campionamento rapido.
2. Per tessuto vegetale che non dispone di una punta naturalmente, usare una lama di rasoio su un vetrino per tagliare un punto conico (Figura 2). Determinare la quantità di tessuto necessari per l'analisi basata sulla sensibilità dello strumento, tipo di tessuto e presenti di interesse (ad es., un giovane S. tortuosum foglia di ~ 5 mm di lunghezza).
   1. Taglio S. tortuosum lascia a 10 settimane post-germinazione in strisce sottili, ciascuno con un'estremità appuntita per formare un punto.
3. Utilizzare pinze per selezionare delicatamente il tessuto della pianta alla fine che sarà bloccata. Tenendo il tessuto con il forcipe, trasferire con cautela al morsetto.
   Attenzione: Non toccare l'origine dello strumento se la tensione è su.
4. Regolare il braccio flessibile e il filo con il morsetto per posizionare il tessuto in linea con l'ingresso di MS in modo che la distanza fra i tessuti vegetali e l'ingresso di ioni del MS è 5-10 mm per il triplo quadrupolo (ad es., TSQ) e trappola lineare quadrupolo (LTQ) e 10 -50 mm per la presa dello ione analizzatore di massa (ad es., orbitrap)⁸.
   1. Collegare l'estremità opposta del filo la fonte. Se i primi tentativi di produrre un'intensità di segnale basso, spostare il tessuto vegetale più vicino verso l'ingresso di ioni (fare riferimento alla discussione per ottimizzazione).
5. Caricare il file di metodo; nome del file di dati e impostare il percorso di archiviazione di file. Attivare il sistema MS facendo clic su Play , quindi fare clic su Start per iniziare l'acquisizione dei dati.
6. Applicare un solvente (ad es., metanolo) utilizzando una pipetta con una punta di gel-caricamento per massimizzare la distanza tra le mani e l'alta tensione per proteggere l'utente.
   Nota: Il volume di solvente necessario dipende dalla dimensione, secchezza e trama del tessuto, in genere ~ 2-20 µ l. S. tortuosum foglie non richiedono alcun solvente da aggiungere. Applicare con cura il solvente e non toccare l'origine dello strumento quando la tensione è su. Utilizzare solventi grado LC-MS e lavori di vetro che è stato acido lavato ed è libero di detergenti. In alcuni tessuti, un segnale può essere osservato senza l'aggiunta di un solvente a causa del contenuto di acqua naturale del tessuto della pianta. Tuttavia, una maggiore intensità del segnale e la ridotta S/N in genere si ottiene applicando un solvente al tessuto.
7. Acquisire dati, purché il segnale persiste o fino a quando gli spettri adeguati sono stati raccolti, in genere 30-60 s. Se necessario, applicare ulteriori solvente per mantenere un'alta intensità del segnale per una quantità di tempo maggiore. Fermare l'acquisizione di dati e mettere in pausa il sistema MS.
8. Rimuovere il tessuto e lavare il morsetto con 100% di metanolo e un panno privo di lanugine. Pulire l'ingresso di ioni MS dopo circa 1-2 h dell'acquisizione di spruzzo del foglio MS secondo le specifiche del fornitore. Inoltre, pulire l'ingresso di ioni MS tra analisi di diversi tipi di tessuto.

4. i dati valutazione di qualità

1. Aprire il file di dati e ispezionare visivamente il Cronogramma massa base picco. Verifica che l'intensità del segnale è ~1.0 x 10⁷ a 5,0 x 10⁸. Se il segnale è inferiore, è possibile spostare il tessuto più vicino verso l'ingresso di ioni. Se superiore, il front-end del sistema MS diventerà sporco, quindi spostare il tessuto più lontano l'ingresso di ioni.
2. Basato sulla presenza o sull'assenza degli ioni di interesse in spettri di massa prodotta, alterare i parametri.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

5. tandem massa frammentazione

1. Decidere quali gli ioni sono di interesse per la frammentazione di massa tandem (MS/MS); un segnale di spettri di massa che è > 1,0 x 10⁵ è sufficiente per la selezione di ioni per MS/MS.
2. Fare un nuovo file di metodo con un elenco di inclusione di m/z fuori a 4 cifre decimali. Fare clic su elenchi globali e inclusione. In proprietà del PRM, selezionare l'energia di frammentazione [ad es., energia di collisione normalizzato (NCE) di 30-50 è una buona gamma per cominciare] e altri parametri di MS/MS.
   1. Per ottenere i dati di MS/MS per gli alcaloidi mesembrine, frammento i seguenti ioni, 276.1583 m/z, 290.1742 m/ze 292.1897 m/z, NCE 35.
      Nota: L'acquisizione di dati di MS/MS può essere eseguita immediatamente dopo la MS o in un secondo momento. Lo stesso tessuto spesso può rimanere bloccato dopo una MS completa e può essere riutilizzato per acquisire i dati di MS/MS. Tuttavia, se un accertati non fornisce un segnale sufficiente, utilizzare un nuovo tessuto.
3. Caricare il file di metodo di MS/MS e un file di dati denominato. Accendere il sistema MS e inizia l'acquisizione di dati, eventualmente aggiungendo un solvente. Quando gli spettri adeguati sono stati raccolti, in genere dopo 30-60 s, interrompere l'acquisizione.
4. Quando si assegnano gli ioni frammento, raccogliere frammentazione alle tante energie.
   Nota: Poiché spruzzo del foglio MS manca una separazione cromatografica, gli spettri di frammentazione sono suscettibili di contenere molti ioni e frammentazione alle diverse energie vi aiuterà a fare chiarezza.

6. putativi identificazioni di frammentazione di massa massa accurata e Tandem

1. Fare identificazioni putativi facendo riferimento a precise misurazioni di massa da database di metabolita pubblicamente disponibile come Metlin²¹, Human Metabolome Database²², massa Banca²³, mappe dei lipidi²⁴, Istituto nazionale di Standard e tecnologia MS ricerca²⁵, rispetto per i Phytochemicals²⁶, o PNL²⁷.
2. Come questi database non sono esaustivi, di eseguire una revisione della letteratura sulle specie vegetali caratterizzati chimicamente come necessario.
3. Corrispondenza tra gli ioni di frammentazione da foglia spruzzare MS/MS per i database di cui sopra quando sono disponibili informazioni di MS/MS, o alla letteratura. In alternativa, utilizzare un'interpretazione manuale degli ioni frammento MS/MS o una frammentazione di un autentico standard effettuate dall'iniezione diretta o LC-MS/MS.

7. analisi dei dati

1. Convertire i file raw di MS mzXML file con lo strumento di msConvert da Proteowizard²⁸.
2. Utilizzare il pacchetto di software XCMS implementato in R per il prelievo di picco. Utilizzare un'infusione diretta l'elaborazione del metodo per lo spray foglia analisi MS.
   Nota: Il ben commentato scripts utilizzati per l'elaborazione dati può essere trovato alla https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
3. Per ottenere misure semi-quantitative, contabilità per la variabilità sperimentale, normalizzare l'intensità di ogni metabolita dalla corrente ionica totale (TIC), come lo spray di foglia MS l'intensità del segnale può variare, in parte a causa di lievi variazioni nel posizionamento dei la foglia nell'origine e le differenze di dimensioni e forma della foglia.
4. In alternativa, utilizzare fornito dal fornitore di software per l'analisi dei dati o MZmine2 (per essere trovato alla http://mzmine.github.io/)²⁹.

Risultati

A 10 settimane che post-germinazione, appena raccolti coltivati in serra, S. tortuosum foglie sono stati analizzati da spruzzo del foglio MS. Il flusso di lavoro sperimentale per la rilevazione di metaboliti da S. tortuosum lascia utilizzando spruzzo del foglio che MS è illustrata nella Figura 2. Una foglia è stata selezionata, tagliata in una striscia sottile con un'estremità appuntita per formare un punto e serrata con lo spray di fogli...

Discussione

Il riuscito uso di questo protocollo si basa sull'ottimizzazione dei vari passaggi per la specie di piante, tipo di tessuto e presenti di destinazione di interesse. I parametri descritti nel protocollo forniscono un buon punto di partenza. Le seguenti decisioni sperimentali devono essere realizzati e testati: o meno all'uso (1) taglio o tessuto uncut e (2) solvente o nessun solvente, (3) quali solvente da utilizzare e in quale volume, (4) che cosa la distanza del tessuto dall'ingresso di ioni deve essere e (5) l'ampiezza...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conn Pin	Digi-Key elctronics	WM2563CT-ND	pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clamp	Digi-Key elctronics	314-1018-ND	CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp	Digi-Key elctronics	290-1951-ND	ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink	Digi-Key elctronics	Q2Z1-KIT-ND	to cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion Source	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap	Thermo scientific	NA	Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software	Thermo scientific		Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software	Thermo scientific
Plant of interest - S. tortousum