Caenorhabditis Setaccio: Uno strumento low-tech e metodologia per l'ordinamento di piccoli organismi multicellulari

Riepilogo

Il protocollo corrente include una metodologia per la cernita e la pulizia delle popolazioni di pari età di elegans di Caenorhabditis. Utilizza un semplice, poco costoso ed efficiente strumento su misura per ottenere una grande popolazione sperimentale dei nematodi per la ricerca.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo di modello consolidata utilizzato in una gamma di ricerca biomedica di base. All'interno della comunità di ricerca del nematode, c'è un bisogno di un modo conveniente ed efficace per mantenere la popolazione di grande, di pari età di c. elegans. Qui, presentiamo una metodologia per meccanicamente l'ordinamento e la pulizia di c. elegans. Il nostro obiettivo è quello di fornire un processo conveniente, efficiente, veloce e semplice per ottenere animali di dimensioni uniformi e fasi della vita per il loro uso negli esperimenti. Questo strumento, il setaccio di Caenorhabditis , utilizza un sistema di coperchio su misura che discussioni sui tubi conici laboratorio comune e Ordina di c. elegans basato sulla dimensione del corpo. Inoltre dimostriamo che il setaccio di Caenorhabditis trasferisce efficacemente animali dalla piastra di una cultura ad un'altra che consente un ordinamento rapido, la sincronizzazione e pulizia senza impattare gli indicatori di salute, tra cui motilità e lo stress-viscoelastico reporter gene. Questo strumento innovativo e accessibile è un'opzione veloce, efficiente e non stressante per il mantenimento di popolazioni di c. elegans .

Introduzione

Il verme nematode Caenorhabditis elegans, è un organismo modello premier. Oltre la natura semplice e controllata della loro coltivazione in laboratorio, è loro intero genoma sequenziato¹ e il destino dello sviluppo di ogni cellula è noto². Grazie a queste caratteristiche, c. elegans è un organismo di modello ampiamente usato per gli studi genetici. Tuttavia, insieme con queste caratteristiche benefiche vengono alcune sfide per i ricercatori. A causa del loro tempo di generazione rapida, popolazioni di c. elegans possono rapidamente a corto di cibo e/o diventano popolazioni con più generazioni miste e stadi di sviluppo presentano in una sola volta. Così, gli esperimenti eseguiti su supporti di solida crescita del nematode (NGM) richiedono ricercatori spostare fisicamente gli animali in piatti freschi prima esaurisce la fonte alimentare batterica e nuove larve si sviluppano. Questo può essere noioso come un frequente trasferimento degli animali è necessaria per prevenire le popolazioni sperimentali da diventando mescolato con generazioni di prole. Ancora, alcuni esperimenti richiedono entrambi i grandi numeri di animali e punti di tempo prolungato (ad es., estrazione di DNA o RNA in età adulta). Questo composti le sfide di accuratamente mantenendo una popolazione sincronizzata e il trasferimento di grandi quantità di animali.

Attuali metodi di trasferimento di c. elegans coltivati su NGM sono picking o lavare gli animali da piastra a piastra; trattare chimicamente gli animali (per esempio, con il DNA replica inibitore fluorodeossiuridina o FUDR); o mediante citometria a flusso per ordinare gli animali in piastre multi-pozzetto. Picking prevede l'utilizzo di uno strumento a mano, realizzato con un sottile filo di platino o un ciglio, trasferire manualmente i singoli o più animali^3,4. Questo metodo è preciso ma richiede abilità e il tempo ed è una limitazione per gli studi che coinvolgono un numero elevato di animali. Picking maggio anche essere fisicamente dannosa e stressante per gli animali sottoponendo gli individui potenzialmente importi innaturali e incoerenti della dispersione e della forza. Lavaggio comporta una piastra di coltura con una soluzione tampone di risciacquo e trasferimento della soluzione con gli animali tramite vetro pipetta Pasteur di una nuova piastra di coltura. Questo metodo è rapido ed efficiente, ma non è accurato come più generazioni e stadi di sviluppo degli animali vengono trasferiti alla rinfusa. Trattamenti chimici, ad esempio FUDR, possono essere sciolto in coltura media per prevenire la produzione di prole attraverso il blocco di qualsiasi replica del DNA e quindi, lo sviluppo di uova e produzione di gameti. Mentre efficace, questo metodo deve essere applicato dopo la maturazione dello sviluppo per non interferire con i normali processi di sviluppo, e questo significa che c'è ancora un requisito per trasferire gli animali prima della sua amministrazione³. Questo metodo influisce anche più cellulari vie di segnalazione, con conseguente effetti notevoli sugli animali che invecchiano (ad esempio, un'estensione di durata della vita o un'alterata proteostasis) a seconda del ceppo di c. elegans utilizzato^{5, 6,7,8,9,10}. Il flusso cytometry metodi automaticamente ordinare e trasferire singoli c. elegans da una piastra multi-pozzetto per un altro¹¹. Mentre questo metodo è molto efficace ed efficiente, apparecchiatura di citometria a flusso è proibitivamente costosi e inaccessibili per molti ricercatori. Un'alternativa al trasferimento di animali consiste nell'utilizzare modelli di mutanti che sono termosensibili, quali fer-15 e fem-1, che diventano sterili con temperatura regolazione¹². Durante l'utilizzo di animali mutanti è utile in alcune situazioni, questi ceppi specifici crescono più lentamente rispetto agli animali wild type e fanno affidamento su un genoma alterato, che serve come poveri rappresentanti per invecchiamento o sani vermi. Inoltre, il ricorso a un cambiamento di temperatura per indurre sterilità risultati anche in assenza di un ambiente statico, e cambiamenti di temperatura sono state prontamente indicati per influenzare gene espressioni^{13,14, 15}. gruppi di ricerca sono pubblicati in precedenza tecniche che descrivono l'uso di una mesh per filtrare c. elegans di dimensioni¹⁶. Tuttavia, siamo riusciti a trovare un lavoro precedente test per eventuali modifiche negli esiti di salute globale che possono essere associati con l'uso di tali filtri.

C'è, così, un'esigenza di un metodo conveniente, efficiente, rapida e accurata per trasferire grandi quantità di animali tra piastre di coltura all'interno della comunità di ricerca di c. elegans . Abbiamo sviluppato un migliorato, accessibile pezzo di equipaggiamento (denominato il setaccio di Caenorhabditis ) e un protocollo associato per la fabbricazione e il suo funzionamento che soddisfa le esigenze della comunità di ricerca di c. elegans . Qui, condividiamo il design del setaccio di Caenorhabditis e metodi per il suo utilizzo, e dimostriamo che il suo utilizzo non influisce la salute comune o eventuali marcatori di stress rispetto alla raccolta manuale standard e un trattamento con il comunemente usati, limitare la fertilità chimica FUDR.

Protocollo

1. Caenorhabditis setaccio costruzione e uso

1. Protocollo di costruzione
   1. Acquisire 2 coperchi da provette coniche da 50 mL (Figura 1A).
   2. Rimuovere l'area di centro all'interno del labbro interno dei coperchi (quando hanno visto dal basso, Figura 1B) utilizzando un bruciatore di Bunsen e una sonda di metallo caldo o un saldatore o ha fatto un passo trapano.
      Nota: Utilizza il calore per tagliare il coperchio di plastica è preferibile una lama perché c'è meno rischio di lesioni.
   3. Pulire e carteggiare i bordi tagliati e la superficie con una lima curva o un rotary rettifica strumento (ad es., Dremel) superiore. Vedere Figura 1.
   4. Tagliare il cerchio del monofilo al diametro appropriato (Figura 1). Per questo, tracciare un coperchio su uno strato di maglia di nylon monofilamento e tagliare appena dentro la linea tracciata.
   5. Tagliare le scanalature/barre la superficie superiore dei coperchi per migliorare l'adesione dei due coperchi quando la colla è applicata alla plastica (Figura 1E).
   6. Pulire i coperchi con etanolo e lasciarli asciugare.
   7. Applicare la colla cianoacrilato per la superficie superiore di entrambi i coperchi, mantenendo verso il bordo esterno.
      Nota: un po' di colla va un lungo cammino.
   8. Posare il monofilo, secondo la tabella 1, su un coperchio incollato (Figura 1F). Posizionare il secondo coperchio rovesciato sopra la maglia; entrambi i coperchi devono avere loro cime insieme. Premere saldamente insieme (Figura 1). Assicurarsi che la rete sia tesa.
      Nota: come misura di sicurezza, uso delle pinzette per posizionare la mesh sui coperchi.
   9. Una volta che il primo strato di colla si è asciugata, applicare un anello della colla del cianoacrilato intorno allo spacco esterno tra i coperchi. Essere generosi come questo aggiunge l'integrità e impedisce qualsiasi peeling apart o con perdite.
   10. Etichettare il filtro con la maglia dei pori del monofilo.
       Nota: Qui, usiamo due maglie poro — 20 µm e 50 µm.
2. Utilizzare il protocollo
   1. Pre-bagnato il setaccio.
      1. Dispensare una soluzione salina, come M9 [5 g di NaCl, 6 g di Na₂HPO₄, 3 g di KH₂PO₄, 1 L di ultrapura H₂O e 1 mL di MgSO₄ (1m)]¹⁷, attraverso il centro del setaccio sino ad ottenere una gocciolina , si condensa e gocciola fuori dal centro della parte inferiore del filtro (Figura 2A). Facoltativamente, applicare un panno privo di lanugine (ad es., Kimwipe) verso il basso per forma o diffondere una gocciolina di umidità sulla mesh.
      2. Posizionare il setaccio sopra una provetta conica da 50 mL. Etichettare la provetta come 'Tubo di rifiuti' (Figura 2B).
   2. Lavare una popolazione di c. elegans fuori una piastra di agar.
      1. Lavare la piastra con il buffer di M9 e posizionare il mezzo verme-contenente sulla fesa di monofilo 1 mL alla volta (Figura 2). Assicurarsi di operare nel centro della maglia. Lavare tutti i vermi dalla piastra.
         Nota: In genere, 3 mL di M9 per un piatto di 60 mm è sufficiente.
      2. Per ridurre al minimo il numero di vermi perdita nel pipettaggio, utilizzare un pipetta Pasteur di vetro per spostare i vermi fuori la piastra e al centro della maglia (ripetere se necessario).
      3. Risciacquare il filtro con il buffer di M9 dall'alto. Ancora una volta, assicurarsi di operare nel centro della maglia e sciacquare tutti i vermi in quella zona. Lavare tante volte quanto necessario per garantire che tutti i batteri e i più piccoli vermi sono passati attraverso le maglie.
   3. Raccogliere gli animali di pari dimensioni dal setaccio.
      1. Allegare una nuova provetta conica 50 mL alla parte superiore della sieve, con i vermi adulti dal passaggio 1.2.2.3 rivolto verso l'interno del nuovo tubo di raccolta (Figura 2D).
      2. Rimuovere il primo tubo (tubo di scarico) e capovolgere velocemente il setaccio e il nuovo tubo per mantenere la goccia dalla migrazione (Figura 2E).
         Nota: Se la sterilità non è necessaria, utilizzare un panno privo di lanugine (ad es., Kimwipe) per stoppino fluido dal basso della maglia prima del capovolgimento.
      3. Sciacquare la mesh con M9 nel nuovo tubo 50 mL da nuovo fesa (Figura 2F). Ancora una volta, operare nel centro della maglia e mantenere una goccia sulla parte inferiore della maglia.
      4. Consentire i vermi di estinguere o li spin delicatamente verso il basso (ad esempio, < 16 x g) per circa 1 min (Figura 2).
      5. Aspirare la soluzione tampone dal pellet di vermi, idealmente verso il basso per > 0,5 mL, o rimuovere quanto più liquido possibile senza disturbare il pellet.
      6. Pipettare i vermi usando un vetro pipetta Pasteur su un piatto NGM e lasciarli asciugare. Spazio più goccioline fuori su un piatto nuovo modo si asciugano più velocemente (Figura 2 H).
   4. Pulire il filtro.
      1. Sciacquare il setaccio delicatamente e accuratamente con acqua etanolo e ad osmosi inversa. Lasciarlo asciugare.
      2. Conservare in un contenitore pulito per un utilizzo futuro indefinito.
      3. Scartarla quando la rete si sviluppa un aspetto di "sag".

2. convalida del setaccio di Caenorhabditis metodo di ordinamento

1. Manutenzione generale
   1. Per tutti gli esperimenti, cultura worms su un Nematode crescita Media standard¹⁷ (1 L di NGM è costituito da 2,5 g di peptone, 17 g di agar, 3 g di NaCl, 975 mL di acqua bidistillata, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL, 1 mL di 1 M CaCl₂ 1 mL di 1 M MgSO₄, 25 mL di 1 M KHPO₄e 0,5 mL di 100 mg/mL di streptomicina) a 25 ° C.
2. Amministrazione di trattamento sperimentale
   1. Confrontare i tre gruppi di trattamento: pick, fluorodeossiuridina (FUDR) e Caenorhabditis setaccio.
      1. Per il gruppo di trattamento di FUDR, aggiungere 100 mg/mL FUDR ai media NGM ad una concentrazione finale di 100 μM per prevenire qualsiasi produzione di progenie e trasferire i vermi ogni altro giorno per un piatto fresco di NGM per evitare lo svuotamento del cibo.
      2. Per il gruppo di scelta, selezionare e trasferire i vermi manualmente utilizzando un'ansa di platino.
      3. Per il gruppo di trattamento del setaccio Caenorhabditis , seguire passo 1.2 e pipettare i vermi in un piatto NGM.
3. Caenorhabditis Percentuale del rendimento del setaccio
   1. Per quantificare quanto sia efficace il setaccio è presso l'ordinamento di c. elegans, crescere età-sincrono N2 animali al giorno 1 dell'età adulta a 25 ° C (cioè, 48 ore dopo la deposizione delle uova) e poi trasferirli di raccoglierli per piatti freschi di NGM (per un totale N = 50 o N = 100 animali per tre gruppo di primarie).
   2. Dopo 24 h di recupero, trasferire la popolazione a nuove piastre di NGM con il setaccio di Caenorhabditis seguendo il precedente protocollo (Vedi punto 1.2) e contare il numero degli animali trasferiti con successo.
   3. Calcolare la percentuale del rendimento come il rapporto tra il numero degli animali trasferiti in confronto al numero di partenza all'inizio del trasferimento moltiplicato per 100 (%).
4. Healthspan saggi
   Nota: Punteggio ottenuto healthspan parametri della classe motilità, il tasso di pompa faringea e sia l'anteriore che la posteriore tocco delicato risposta nei giorni 2, 4, 6 e 8 di età adulta per età-sincronizzato N2 animali mantenuti a 25 ° C.
   1. Motilità di rilevamento
      1. Assegnare i punteggi di motilità basati su un sistema basato su classi (classi A, B e C) seguendo i metodi di Herndon et al. ¹⁸. confrontare gli effetti dei tre gruppi sperimentali utilizzando un modello di statistiche logistica ordinale nel software di analisi statistica.
         Nota: Gli individui classe A muovono spontaneamente in un modello normale, sinusoidale. Individui di classe B spostare nei movimenti contrassegnato non sinusoidale e possono richiedere incitamento per incoraggiare la circolazione. Classe C individui spostare loro testa o la coda in risposta alla sollecitazione ma non sono in grado di spostarsi attraverso l'agar.
   2. Portata della pompa faringea
      1. Contare il movimento smerigliatrice della lampadina di pharyngeal terminale dell'animale visivamente sotto un microscopio stereoscopico a un 600 X ingrandimento finale per 1 min.
      2. Condurre un'analisi statistica con un one-way ANOVA con α = 0.05 e post-test di Bonferroni con α = 0.05.
   3. Risposta al tocco
      1. Registrare una risposta al tocco delicato e confrontare tra tre gruppi di trattamento. Eseguire i saggi basati su metodi descritti da Calixto et al. ¹⁹.
      2. Risposta al tocco record anteriore e posteriore delicatamente accarezzando un pick ciglia perpendicolarmente attraverso la coda o la testa (5 x ogni, alternando testa e coda) degli animali.
      3. Punteggio ottenuto qualsiasi movimento nella direzione opposta del tratto come 1 punto su una scala da 0 a 5 per l'anteriore e il posteriore risposta.
      4. Condurre analisi statistica con un one-way ANOVA con α = 0.05 e post-test di Bonferroni con α = 0.05.
5. Dosaggio di fecondità
   1. Per determinare l'uso dell'impatto del setaccio Caenorhabditis sulla riproduzione, crescere età-sincrono N2 animali al giorno 2 dell'età adulta a 25 ° C.
   2. 60 h dopo uovo laici, trasferire gli animali a nuove piastre di NGM con un plettro di platino o il setaccio di Caenorhabditis e dare loro 4 h per recuperare (asciugare le piastre setacciate per 20-30 min).
   3. Dopo il recupero, individualmente piastra gli animali tramite una ciglia pick a piastre NGM, dare loro 24h per deporre le uova e rimuovere gli animali. Consentire la progenie su ogni piatto di sviluppare in condizioni normali a 25 ° C per altre 24 ore.
      Nota: Un pick di ciglia è un ciglio umano fissato all'estremità di una pipetta di Pasteur con smalto e sterilizzata con etanolo.
   4. Contare il numero di individui di generazione F1 praticabili. Eseguire un'analisi statistica usando un T-test con α = 0.05.
      Nota: Prole vitali sono considerati da uova che si schiudono e cominciano il loro sviluppo attraverso i cicli regolari larvali con successo.
6. Saggi di risposta dello stress reporter fluorescente
   1. Eseguire tre saggi reporter fluorescenti comunemente utilizzati per rilevare potenziali markers di stress: una traslocazione di DAF-16::GFP in nuclei delle cellule in un ceppo [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]²⁰; un'espressione di hsp-16,2 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]²¹; e un' espressione sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. Per ogni dosaggio, cultura età-sincrono animali da tre gruppi di trattamento a 20 ° C ed esaminarli al giorno 3 dell'età adulta: utilizzare un controllo negativo (su base giornaliera, trasferire un gruppo di animali manualmente con un plettro di platino), un controllo positivo (su base giornaliera trasferire un gruppo di animali manualmente con un plettro di platino più un fattore di sforzo stabilito) e il setaccio di Caenorhabditis (passano gli animali attraverso il setaccio e consentire loro di recuperare per 30 min in NGM appena prima di imaging).
   3. Nell'analisi della DAF-16::GFP, calore shock gli animali di controllo positivo a 37 ° C per 30 min prima dell'imaging di²⁰. Per il dosaggio di hsp-16.2, calore shock gli animali di controllo positivo per 90 min, 20 h prima dell'imaging di²¹. Per il dosaggio di zolla-3, è necessario trattare gli animali di controllo positivo con il paraquat di 100 mM per 4 h prima dell'imaging di²².
   4. Raccogliere i vermi immediatamente con un prelievo di ciglia e montarle un vetrino coprioggetto con 1 μL di soluzione 36% poloxamer 407 tensioattivo per immobilizzare i vermi.
   5. I vermi montati con un altro vetrino coprioggetto un panino. Montare due lamelle ad un vetrino standard di microscopia e immagini i vermi con un ingrandimento 8x su un microscopio a fluorescenza invertito (per un ingrandimento complessivo di 80 X) e una costante esposizione con un filtro FITC.
   6. Per rilevare eventuali differenze tra i tre gruppi nel test DAF-16::GFP, classificare gli animali in base alla posizione del DAF-16::GFP reporter (nucleare se il reporter traslocata ai nuclei, citosolici se il giornalista si trova nel citosol e se intermedio il giornalista che si trova in entrambi i nuclei e citoplasma).
   7. Confrontare i risultati utilizzando un modello statistico di logistica ordinale nel software di analisi statistica. Per la hsp-16.2 e analisi della espressione sod-3, è possibile utilizzare un one-way ANOVA con α = 0.05 e prove di post hoc di Tukey con α = 0.05 per confrontare la fluorescenza totale della regione della testa.

Risultati

Il setaccio di Caenorhabditis è costituito da 2 tappi a vite, protezione di un'area di monofilo di nylon tessuto inferiore al diametro del corpo dell'età dello sviluppo desiderato, utilizzato per estrarre dal vivo popolazioni di organismi usando una tecnica semplice lavaggio. Si attacca ai tubi conici standard e utilizza il setaccio a maglie per ordinare meccanicamente animali di diametro del corpo, lasciando gli animali desiderati nel tubo pronto per la successiva manutenzione...

Discussione

Nel presente documento, abbiamo introdotto la progettazione e l'uso del setaccio Caenorhabditis accessibile, efficace come strumento per l'ordinamento e il mantenimento di c. elegans. Questo strumento presenta diversi vantaggi per picking manualmente singoli animali, popolazioni, trattamenti chimici (ad esempio, FUDR) e metodi più costosi degli animali segregating di lavaggio. In primo luogo, il Caenorhabditis setaccio efficientemente e rapidamente (meno di 20 min) Ordina progenie da ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safety glasses	Uline	S-21076
Protective heat resistant glove	Grainger	Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube	Falcon	14-432-22
Synthetic Nylon mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
Pliers	Vampliers	VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file	Lowe's	Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)	Sigma	S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)	BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)	BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Paraquat dichloride hydrate	Sigma	36541
Inverted fluorescence microscope	Olympus	FSX100