In Vitro Canini trappola extracellulari del neutrofilo formazione: Analisi dinamica e quantitativa mediante microscopia a fluorescenza

Riepilogo

Descriviamo i metodi per isolare canini neutrofili dal sangue intero e visualizzare formazione netta nei neutrofili dal vivo utilizzando la microscopia a fluorescenza. Sono anche descritti protocolli per quantificare la formazione netta e citrullinato istone H3 (citH3) espressione usando la microscopia di immunofluorescenza.

Abstract

In risposta ad agenti patogeni d'invasione, neutrofili rilasciare trappole extracellulari del neutrofilo (reti), che sono reti extracellulare del DNA decorato con gli istoni e proteine antimicrobiche. Eccessiva formazione netta (NETosis) e citH3 rilascio durante la sepsi è associato con più disfunzione dell'organo e la mortalità nei topi e nell'uomo ma le sue implicazioni nei cani sono sconosciuti. Qui, descriviamo una tecnica per isolare canini neutrofili dal sangue intero per l'osservazione e la quantificazione dei NETosis. Plasma leucocita-ricco, generato dalla sedimentazione del dextrano, è separato dai mezzi di comunicazione di commercialmente disponibile densità gradiente separazione e granulociti raccolti per conteggio e test di vitalità delle cellule. Per osservare in tempo reale NETosis dal vivo dei neutrofili, cellule permeante e macchie fluorescenti impermeant dell'acido nucleico cellulare vengono aggiunti ai neutrofili attivati da lipopolisaccaride (LPS) o phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA). Cambiamenti nella morfologia nucleare e formazione netta sono osservati nel corso del tempo da microscopia di fluorescenza. In vitro NETosis è ulteriormente caratterizzata da co-colocalizzazione di DNA libero (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) e citrullinato istone H3 (citH3) utilizzando un protocollo modificato di doppio-immunolabelling. Per quantificare oggettivamente formazione netta e citH3 espressione utilizzando la microscopia a fluorescenza, reti e cellule citH3-positive sono quantificate in un modo accecato utilizzando il software disponibile. Questa tecnica è un dosaggio specifico per valutare la capacità in vitro dei neutrofili canini di subire NETosis.

Introduzione

I neutrofili sono di breve durati granulociti responsabili della iniziale difesa contro agenti patogeni d'invasione. Neutrofili, reclutati nel sito di infezione, eliminano microrganismi di fagocitosi, la degranulazione e la generazione di ossigeno reattivo (ROS) specie¹. In presenza di batteri o endotossine, neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), composto di cromatina extracellulare decorato con gli istoni e proteine granulari come elastasi e mieloperossidasi (MPO)². Anche se le reti sono indispensabili proprietà antimicrobiche, crescenti evidenze sperimentali e cliniche suggerisce che troppo zelante formazione netta durante la sepsi può condurre a più organo disfunzione e morte^{3,4, 5 , 6}.

Poiché le reti possono svolgere un simile ruolo patofisiologico nei cani, gli interventi terapeutici che prevenire o diminuiscono formazione netta possono servire da nuove strategie terapeutiche in animali settici. Per questo motivo, c'è la necessità di una tecnica affidabile valutare e quantificare i componenti netti nei cani e NETosis. NET componenti tra cui DNA libero (cfDNA) e nucleosomi sono state valutate in precedenza in neutrofili canini e plasma dai clinici cani^7,8,9. Facendo uso delle analisi di fluorescenza, Goggs e Letendre trovato che settici cani hanno livelli elevati di cfDNA rispetto a cani sani,⁸. Anche se queste tecniche sono altamente oggettiva e quantitativa, misura di cfDNA e nucleosomi come marcatori di NETosis è non specifica, poiché essi possono essere derivate da cellule necrotiche diverso da NETosing neutrofili. Qui descriviamo una tecnica che utilizza la microscopia di fluorescenza per esaminare i comportamenti dei neutrofili NETosing dal vivo. Dettagliamo anche un protocollo modificato utilizzando double-immunolabeling soggettivamente quantificare le reti e i loro componenti quali MPO e citH3 in neutrofili canini¹⁰.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la University of California, Davis e istituzionali cura degli animali (numero di protocollo: 18338).

1. prelievo sangue

1. Disegnare 10 mL di sangue da una vena cefalica o giugulare utilizzando un ago 21G dall'aspirazione di siringa.
2. Per evitare un'eccessiva sollecitazione di taglio, rimuovere l'ago dalla siringa prima di trasferire il sangue in provette contenenti eparina sodica (75 USP). Capovolgere delicatamente le provette un paio di volte a garantire un'adeguata miscelazione di anticoagulante e sangue. Verifica l'evidenza di coaguli o aggregati di eritrociti prima di posizionare i campioni sul ghiaccio.

2. isolamento del neutrofilo

1. Diluire il sangue anticoagulato con un volume uguale di tampone fosfato salino di gelida Dubecco (DPBS) (pH 7.4, senza cationi bivalenti). Trasferire 8 mL di sangue diluito in una provetta conica in polipropilene da 50 mL contenente 25 mL di 3% destrano (da Leuconostoc spp. sciolto in soluzione di cloruro di sodio 0,9%). Disporre il tubo verticalmente a temperatura ambiente per 30 min consentire l'aggregazione e la sedimentazione degli eritrociti.
2. Con attenzione strato 5 mL di plasma leucocita-ricco (Figura 1) sulla cima di 5ml di media gradiente di densità in un tubo di turno-fondo 14 mL in polipropilene. Fare attenzione a non mescolare i 2 soluzioni¹¹.
3. Centrifugare le provette a 400 x g con accelerazione/decelerazione (A/D) impostato su 0 (nessun freno) per 30 min a temperatura ambiente.
4. Utilizzando un 5ml pipetta sierologica raccogliere lo strato delle cellule del granulocyte bypassando il plasma e i livelli di sangue periferico (PBMC) di cellule mononucleate (Figura 1). Utilizzare una nuova pipetta ogni volta per minimizzare la contaminazione.
5. Posto 4 a 6 mL di strato delle cellule del polymorphnuclear (PMN) in un tubo conico in polipropilene da 50 mL. Dal momento che una piccola quantità di aggregati di eritrociti può essere aspirata insieme al livello PMN, usare una pipetta sierologica da 1 mL per rimuovere delicatamente gli aggregati dell'eritrocito che sono depositati nella parte inferiore del tubo.
6. Lisare gli eritrociti rimanenti con 20 mL di acqua distillata fredda. Capovolgere delicatamente la provetta più volte per 30 a 60 s per garantire adeguata lisi prima di aggiungere un volume uguale di soluzione di cloruro di sodio 1,8% ghiacciata.
7. Centrifugare a 112 x g per 10 min a 4 ° C, A/D impostato a 0.
8. Ripetere il passo di lisi degli eritrociti se questo pellet viene visualizzato in rosso. Scartare il surnatante con cura con una pipetta sierologica e delicatamente risospendere il pellet in 100 µ l di DPBS (destrosio di 5 mM, 0.9 mM MgCl₂, 1,9 mM CaCl₂ e 1% albumina di siero bovino, pH 7,3). Unire tutte le celle di sedimento e metterli su ghiaccio.
9. Eseguire un conteggio delle cellule usando un analizzatore automatizzato delle cellule e verificare il conteggio di un emocitometro. Se necessario, concentrarsi PMNs su una lastra di vetro utilizzando una citocentrifuga (1.000 giri/min, 5 min) e determinare la percentuale dei neutrofili contando il numero di neutrofili rispetto al numero totale delle cellule.
10. Determinare la fattibilità dei neutrofili eseguendo un test di esclusione del blu di trypan, come indicato dalla Strober et al. ¹² isolamento successo dovrebbe produrre una redditività dal 95 al 100% e neutrofili dovrebbero essere superiori al 95%.
11. Determinare la concentrazione dei neutrofili moltiplicando il conteggio totale delle cellule con la vitalità percentuale e la percentuale dei neutrofili. Isolamento di successo dovrebbe produrre una concentrazione dei neutrofili da 1,5 a 6 x 106/ml.
12. Diluire i neutrofili a una concentrazione finale di 1 x 106/ml con DPBS contenente destrosio di 5 mM, 0.9 mM MgCl₂, 1,9 mM di CaCl₂e 1% di albumina di siero bovino con pH regolato a 7.3.

3. fluorescente microscopia di neutrofili dal vivo

1. Posto da 200 a 400 μL di neutrofili (1 x 106/ml) in ciascun pozzetto della poli-L-lisina 12-pozzetti cultura piatto rivestito. Consentire i neutrofili ad aderire al fondo dei pozzetti incubando le cellule a 37 ° C per 30 min.
2. Etichetta di acidi nucleici con 1 μM di uno dei due acidi nucleici coloranti, uno che le macchie in cellule con membrane intatte e uno che le macchie in cellule con membrane permeabili (Vedi Tabella materiali), per 10 min a temperatura ambiente.
3. Attivare i neutrofili con il lipopolysaccharide di 100 μg/mL (LPS) (e. coli O55. B5), 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) come controllo positivo, o un equivalente volume di DPBS come controllo negativo per 180 min a 37 ° C.
4. Acquisire immagini utilizzando la GFP (eccitazione: 470/22 nm, emissione: 525/50 nm) e canali di Texas Red (eccitazione: 585/29 nm, emissione: 628/32 nm) su un microscopio a fluorescenza a 40 ingrandimenti presso i seguenti punti di tempo: 30, 90, 120 e 180 min.

4. netto quantificazione e l'individuazione delle componenti netti mediante immunofluorescenza

1. Posizionare con attenzione il coprioggetto 18 mm diametro poli-D-lisina rivestito nei pozzetti di una piastra di coltura 12-pozzetti. Etichettare correttamente i pozzi.
2. Seme 100 a 200 μL di isolato neutrofili (1 x 106/ml) direttamente sulle lamelle e consentire i neutrofili ad aderire al coprioggetto incubando le cellule a 37 ° C per 30 min.
3. Attivare i neutrofili come descritto al punto 3.3. Inibiscono la formazione netta pretrattando i neutrofili con µΜ 200 Cl-amidine (15 min, 37 ° C) prima dell'attivazione come precedentemente descritto da Li et al. ¹³ assicurarsi che il controllo del proprio veicolo (DMSO) è incluso nell'esperimento.
4. Rimuovere con cautela i vetrini con una pinzetta. Strato un foglio di pellicola di paraffina sopra un cavalletto di provetta creare pozzi poco profondi e inserire 2 o 3 gocce di 4% PFA in ogni ben¹⁰. Etichettare correttamente i pozzetti e appoggialo delicatamente con il coprioggetto upside-down sui pozzi di PFA-riempito. Consentire alle cellule di essere fissato a temperatura ambiente per 20 min.
5. Lavare le cellule 3 volte in DPBS per 5 min, spostandoli da un pozzetto per il prossimo.
6. Se immunolabelling non può essere eseguita subito dopo la fissazione e l'attivazione del neutrofilo, consentire vetrini coprioggetto essere essiccato inserendo i vetrini a faccia in su un pezzo di carta di assorbanza. Vetrini possono essere conservati per fino a 1 settimana a faccia in su in una piastra di coltura di 12-pozzetti etichettati a 4 ° C fino a ulteriori analisi. Lavare le cellule 3 volte in DPBS per 1 min, utilizzando la stessa tecnica come descritto in 4.4 prima di procedere al passaggio successivo.
7. Per permeabilize le cellule, appoggiare delicatamente il vetrino coprioggetto capovolta su una goccia di 1% NP-40 per 1 min, utilizzando la tecnica descritta in 4.4. Lavare 3 volte in DPBS per 1 minuto su un agitatore meccanico.
8. Assegnare ogni campione a un numero e utilizzare un indicatore di punte di diamante per etichetta di conseguenza i coprioggetti in modo casuale.
9. Preparare ed etichetta individuale di Petri allineato con il film di paraffina e 100 a 200 μL di siero di capra del 5% sulla pellicola (tampone di arresto). Posare i coprioggetti upside-down sul tampone bloccante. Mettere su un rocker e incubare per 1h a 37 ° C.
10. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.
11. Diluire l'anticorpo primario (istone di 1: 400 coniglio policlonale anti-citrullinated H3 (citH3) nel 5% di siero di capra). Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Mettere su un rocker e incubare per 1h a 37° C.
12. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico.
13. Diluire anticorpo secondario coniugato con un fluoroforo (1: 200) in siero di capra 5%. Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Posto su un rocker e Incubare 1h a 37 ° C al buio.
14. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.
15. Per il rilevamento simultaneo del myeloperoxidase (MPO) seguire i seguenti passi per un protocollo modificato Doppio immunolabeling come descritto da Li et al. ¹³
16. Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down su 100 e 200 μL di 10% coniglio siero sotto dolce dondolo (durante la notte, 4 ° C, al buio).
17. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.
18. Incubare le cellule in capra non coniugata di 50 μg/mL anti-coniglio Fab frammenti per 2 h a temperatura ambiente su un rocker nel buio.
19. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.
20. Diluire l'anticorpo primario (1: 200 coniglio anti-umani MPO anticorpi policlonali) in siero di capra 5%. Incubare le cellule in piastre di Petri con etichetta allineato con il film di paraffina. Appoggiare ogni vetrino coprioggetto upside-down sul 50 a 100 μL della soluzione di anticorpo diluito. Posto su un rocker e Incubare 1h a 37° C al buio.
21. Diluire l'anticorpo secondario coniugato ad un fluoroforo in siero di capra del 5% e incubare come descritto in 4.8
22. Lavare 3 volte in DPBS per 5 minuti su un agitatore meccanico al buio.
23. Controlli di interferenza devono essere preparati da escluse incubazione con entrambi gli anticorpi primari nel secondo passaggio immunitario-etichettatura.
24. Macchia di DNA con 300 nM di 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole, dicloridrato (DAPI) per 5 min al buio a temperatura ambiente.
25. Lavare 3 volte in DPBS per 1 minuto su un rocker nel buio.
26. Applicare una goccia (~ 50 μl) del montante antifade su una lastra di vetro. Picchiettare delicatamente il bordo del coverslip su una carta assorbente per rimuovere il tampone in eccesso prima di montare il vetrino coprioggetto con le cellule upside-down. Il mezzo di montaggio dovrebbe formare uno strato sottile tra il vetrino coprioggetto e il vetrino. Per rimuovere le bolle d'aria, premere molto delicatamente il vetrino coprioggetti con una pinzetta.
27. Permetta che i campioni curare una notte al buio a 4 ° C. Il mezzo di montaggio dovrebbe indurire per analisi microscopiche con lenti ad immersione. Conservare i campioni a 4 ° C al buio.

5. del neutrofilo trappola extracellulare quantificazione

1. Accecare gli operatori di acquisire e analizzare le immagini del microscopio alle condizioni sperimentali.
2. Usando un microscopio a fluorescenza a 40 ingrandimenti, prendere 10 immagini in modo casuale da varie regioni di ogni vetrino coprioggetti in un esperimento sotto i rispettivi canali. Assicurarsi che il tempo di esposizione, la luminosità e il contrasto di ogni canale sono mantenuti costante durante l'acquisizione di immagini.
3. Analizzare le immagini utilizzando il software disponibile come ImageJ (NIH). Identificare le reti basate su co-localizzazione di cfDNA, citH3 e MPO (Figura 3A, B). Quantificare il numero delle reti e dei neutrofili in 10 campi casuali per ogni condizione sperimentale. Numeri di reti rilasciato può essere espressa come rapporto (numero di reti: numero totale dei neutrofili) per ogni condizione sperimentale.
4. Per valutare gli effetti del trattamento sull'espressione intracellulare citH3, contare il numero dei neutrofili con citH3 intracellulare e il numero dei neutrofili senza citH3 intracellulare in 10 campi casuali a 40 ingrandimenti sotto i rispettivi canali ( Figura 3, frecce rosse). Espressione citH3 intracellulare può essere espresso come il rapporto tra numero dei neutrofili con citH3 intracellulare al numero di neutrofili senza citH3 intracellulare.

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Risultati

Usando questo protocollo dell'imaging di cellule vive, gli investigatori possono osservare la morfologia nucleare, l'integrità della membrana del plasma e la presenza di cfDNA vivente dei neutrofili. Un colorante nucleare impermeant cella macchie acidi nuclei rosso in cellule con membrane cellulari danneggiate. Un altro colorante cellulare-permeante, etichette sugli acidi nucleici intracellulare in cellule vive con le membrane intatte di plasma. Tutti i neutrofili intatti, indipendenteme...

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Discussione

Presentiamo qui un protocollo per osservare i cambiamenti nella conformazione e cfDNA i nuclei dei neutrofili canini vivente utilizzando un colorante permeante cella sia un colorante impermeant cella. Il vantaggio principale di questo test è che permette per il rilevamento in tempo reale di formazione netta di microscopia ad alta risoluzione nei neutrofili dal vivo senza fissazione delle cellule, di conseguenza, fornendo uno strumento semplice e prezioso per l'osservazione in vitro formazione netta. Poiché que...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran from Leuconostoc spp.	Sigma	31392	Molecular weight 450,000 – 650,000
Ficoll-Paque PLUS	GE Life Sciences	17144002
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	A1285801	With divalent cations
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	14190136	Without divalent cations
E. coli O55:B5	InvivoGen
SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S11368	5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes
SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain	ThermoFisher Scientific	S7578	1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes
Surface-Amps NP-40	Pierce	28324
Poly-D-Lysine coated coverslips	neuVitro	H-12-pdl	12 mm diameter
Anti-citrullinated histone H3 antibody	Abcam	Ab5103
Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments	Jackson ImmunoResearch	111-007-003	Specificity: IgG (H+L)
Anti- Myeloperoxidase antibody	Dako	A0398
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)	Life Technologies Corporation	D1306