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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Ricerca sulle strategie di trattamento per i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti è importante per la traduzione clinica della terapia cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per, in primo luogo, generare teratomi derivati da cellule staminali in topi e, quindi, a selettivamente bersaglio e curare questi tumori in vivo usando un irradiatore di piccoli animali.

Abstract

Il crescente numero di vittime del "turismo delle cellule staminali," il trapianto non regolamentato delle cellule staminali in tutto il mondo, ha sollevato preoccupazioni circa la sicurezza del trapianto di cellule staminali. Sebbene il trapianto di differenziato piuttosto che cellule indifferenziate è pratica comune, i teratomas possono ancora derivano dalla presenza di cellule staminali indifferenziate residuale al momento del trapianto o da mutazioni spontanee in differenziato cellule. Perché terapie con cellule staminali sono spesso trasportate in siti anatomicamente sensibili, anche i piccoli tumori possono essere clinicamente devastanti, con conseguente cecità, paralisi, cognitive anomalie e disfunzioni cardiovascolari. L'accesso chirurgico a questi siti potrebbe essere ridotte, lasciando i pazienti con poche opzioni terapeutiche. Controllo comportamento scorretto della cellula formativa è, quindi, critico per la traduzione clinica della terapia cellulare.

Radiazione esterna del fascio offre un mezzo efficace di erogare la terapia mirata a diminuire l'onere di teratoma, riducendo al minimo lesioni di organi circostanti. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale di cellule staminali, che sono associati con clinici supplementari di sicurezza ed efficacia. Qui, descriviamo un protocollo per creare i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti in topi e applicare la radioterapia esterna del fascio per ablazione selettivamente questi tumori in vivo.

Introduzione

Lo sviluppo di terapie con cellule staminali per la rigenerazione tissutale ha rilevato un numero di barriere in parecchi decenni passati, che ostacola gli sforzi per la distribuzione efficiente di clinica. Questi ostacoli sono conservazione scadente delle cellule ai luoghi di consegna, l'immunogenicità delle cellule staminali e il potenziale neoplastico a forma i teratomas1. Carcinogenicità è di particolare interesse clinico in quanto può potenzialmente danneggiare cellule staminali trapianto destinatari2. Conti di formazione del tumore a causa di iniezioni di cellule staminali non regolamentata sono già stati segnalati in molteplici contesti clinici3,4,5. Il potenziale per la formazione di teratoma è il più frequentemente citati preoccupazione clinica nello sviluppo delle cellule staminali (PSC) pluripotenti e ha provocato ritardi e cancellazioni di più alto profilo sulle cellule staminali embrionali (ESC) e indotta da cellule staminali pluripotenti (iPSC) prove6,7,8,9. Così, c'è una necessità urgente per una ricerca traslazionale dedicata verso fornendo trattamento appropriato, dovrebbero sorgere questi tumori iatrogenici.

Ad oggi, la maggior parte delle strategie per controllare il comportamento scorretto di cellule staminali si sono concentrati sulla riduzione del numero degli sportelli unici con potenziale cancerogeno2,10. Purtroppo, solo un piccolo numero di cellule residue (ad es.., 1 x 104 a 1 x 105 celle11) è necessario per la formazione di teratoma, che è molto di sotto del limite di rilevazione citata da saggi attualmente disponibili12, 13. altre limitazioni di utilizzo di questi metodi preseparazione includono bassa efficienza e costi elevati, dipendenza dalle sospensioni unicellulari che potrebbe non essere appropriato per più recenti approcci di ingegneria dei tessuti e il danno potenziale della cella sopravvivenza e l'attecchimento.

Pochi studi hanno affrontato le opzioni di trattamento seguendo la formazione di teratoma. Forse la strategia più ben studiata è l'incorporazione di geni di "suicidio" in cellule staminali14,15. Questo metodo consiste nel manipolare geneticamente le cellule staminali per incorporare un gene d'attivazione apoptosi inducibile che può essere attivato da postinjection di stimolazione farmacologica, fornendo così un approccio di salvataggio se iniettato le cellule producono i teratomas. Questo approccio, tuttavia, soffre di notevoli inconvenienti, tra cui gli effetti delle modificazioni genetiche di sportelli unici e il potenziale per uno sviluppo graduale di farmaco resistenza16fuori bersaglio. Un simile approccio utilizza piccole molecole per indurre la morte selettiva delle cellule degli sportelli unici via l'inibizione di anti-apoptotici vie17. Altri gruppi hanno preso di mira la morte delle cellule degli sportelli unici usando gli anticorpi contro marcatori di pluripotenza superficie, come Podocalixina-come proteina-1 (PODXL)18. I tempi di consegna della piccolo-molecola o anticorpo si trova ad avere un impatto significativo sul potenziale terapeutico degli sportelli unici, se consegnato troppo presto e può alcuna efficacia terapeutica, se consegnato troppo tardi. Inoltre, non sono stati studiati gli effetti sistemici di piccole molecole e gli anticorpi usati in questo modo.

Un approccio alternativo per il trattamento di questi tumori si basa sull'utilizzo di radioterapia esterna del fascio (EBRT). Radioterapia esterna è una delle modalità primaria attualmente impiegata nel trattamento di tumori solidi19. Innovazioni nella radioterapia esterna, compreso lo sviluppo del fascio di protoni e radiosurgery di stereotactic, hanno permesso l'ottimizzazione avanzata delle strutture patologiche, evitando danni al tessuto normale, rendendo conformal EBRT ideale per affrontare il teratoma formazione in strutture anatomicamente sensibili20. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale delle cellule staminali, che sono entrambi irto di ulteriore sicurezza clinica e l'efficacia riguarda15. Infine, gli avanzamenti in micro-irradiatori hanno permesso l'applicazione di EBRT in roditori21.

In questo articolo, dimostriamo come creare un modello di piccoli animali di formazione di teratoma iniettando iPSCs umane in topi. Abbiamo quindi illustrato come applicare EBRT per sradicare selettivamente questi tumori in vivo con minimo danno al tessuto circostante. Questo approccio fornisce una terapia mirata per i teratomas PSC-derivati, evitando gli effetti fuori bersaglio della consegna sistemica di molecole biologiche e peptidi e la manipolazione genetica degli sportelli unici. Ai fini d'investigazione, offriamo un passaggio facoltativo per trasdurre cellule staminali con geni reporter di monitorare la risposta del tumore alla radioterapia via bioluminescenza imaging (BLI).

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Protocollo

Questo esperimento sugli animali è stato approvato ed eseguito sotto l'Institutional Review Board e il pannello di amministrazione su Laboratory Animal Care presso la Stanford University.

1. cella cultura di iPSCs

  1. Crescere umano iPSCs derivate riprogrammando lentivirali su piastre da 6 pozzetti rivestite con matrice della membrana basale (ad es., matrigel, indicato come matrice hereon).
  2. Cambio quotidiano di media di iPSCs con terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) incubando a 37 ° C e 5% CO2.
  3. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza di 80 – 90% (circa ogni 4 giorni), aggiungere 1 mL di enzima ricombinante cella-dissociazione (Vedi Tabella materiali) al pozzetto ed incubare a 37 ° C per 5 min.
  4. Dopo 5 min, dissociare le cellule dal pozzo di pipettaggio, trasferirli in una provetta da 15 mL e centrifugare a 300 x g.
  5. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) arricchita con inibitore di Y27632 ad una diluizione di 1:1,000.
  6. Eseguire un conteggio delle cellule delle cellule dissociate e replate le celle rivestite con matrice piastre da 6 pozzetti ad una densità di 2 x 105 a 4 x 105.

2. trasduzione di iPSCs con un Gene Reporter Double-fusione

  1. Passaggio iPSCs in piastre da 6 pozzetti secondo routine e aggiungere il terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) contenente bromuro di hexadimethrine µ g/mL 6.
    Nota: Il formato della Colonia ideale è di 200 – 400 cellule/Colonia per produrre la massima efficienza di trasduzione.
  2. Concentrarsi self-inattivazione dei lentivirus che trasportano firefly luciferase e verde proteina fluorescente (FLuc-eGFP) guidata da ubiquitina umana promotor-C mediante centrifugazione di sedimento con un rotore SW-29 a 50.000 x g per 2 ore a 4 ° C.
  3. Aggiungere il concentrato virale iPSCs in una piastra a 6 pozzetti ad una molteplicità di infezione (MOI) di 10 e incubare per una notte a 37 ° C 5% CO2.
    Nota: La molteplicità di infezione è stata determinata l'espressione della proteina monomerica fluorescenza analizzata da una cella di fluorescenza-attivato l'ordinamento di scansione (FACS).
  4. Il giorno seguente, rimuovere il virus mediante centrifugazione delle piastre 6 pozzetti iPSC a 300 x g per 6 min a temperatura ambiente.
  5. Cambiare il supporto quotidiano con terreno di coltura arricchito (Vedi Tabella materiali) e passaggio secondo il protocollo. Utilizzare un microscopio a fluorescenza per determinare l'efficienza di trasduzione approssimativo per eGFP.
  6. Un'efficienza del 30 – 40% è sufficiente per l'ordinamento di FACS. Procedere al FACS di hiPSCs che esprimono eGFP se almeno 30 – 40% delle cellule esprimono eGFP.
  7. Per confermare il FLuc attività ex vivo, le cellule che esprimono GFP filtrate FACS ad una densità di 5.000 cellule per pozzetto della piastra.
  8. Incubare le cellule trasdotte e non trasdotte cellule (che serviranno come controllo negativo) con il reporter di bioluminescenza sonda D-luciferina (100 μmol/L) per 6 h. misurare la bioluminescenza con una micropiastra spettrofluorimetro.

3. trapianto degli sportelli unici in versante dorsale per la formazione di Teratoma in topi immunodeficienti

  1. Aggiungere 1 mL di miscela enzima ricombinante cella-dissociazione per piastra 6 pozzetti contenenti umano iPSCs trasformata con un gene reporter di doppio-fusione (FLuc-GFP) nella cultura (cfr. sezione 2) e incubare per 5 min.
  2. Dopo il periodo di incubazione, disperdere le cellule mediante pipetta aspirazione ed espressione. Aggiungere un volume equivalente di terreno di coltura e poi Centrifugare a 250 x g per 4 min.
  3. Al termine della centrifugazione, aspirare il supernatante, risospendere il pellet cellulare in 30 µ l di matrice e posizionarlo sul ghiaccio per preservare la sua redditività prima dell'iniezione. Confermare un raccolto di 1 x 106 celle utilizzando un emocitometro.
  4. Se utilizzando double-fusione reporter-gene-transfettati, sospendere le cellule di FACS double-positive (dalla sezione 2) in 30 µ l di matrice.
  5. Indurre l'anestesia in topi nudi athymic di 8-10 settimane con 2% isoflurance 1L/min di ossigeno e quindi utilizzare manutenzione 2% isoflurane con 1L/min di ossigeno.
  6. Utilizzando una siringa di 28,5 G, iniettare la miscela di cellula/matrice (Vedi Tabella materiali) sospensione nello spazio sottocutaneo al fianco, con l'obiettivo per un'iniezione di totale 5 x 10 da3 a 5 x 106 cellule (circa 100 ul per iniezione).
  7. Prendere in considerazione un sito di iniezione più caudale se intendono mantenere topi per periodo prolungato e anticipando la crescita del tumore di grandi dimensioni.
  8. Sono ammessi animali anestetizzati per recuperare su un pad riscaldato fino al deambulatorio (tipicamente < 1h) con monitoraggio della frequenza respiratoria, il colore della pelle delle dita dei piedi fino al deambulatorio.

4. bioluminescenza (BLI) di Imaging delle cellule trapiantate per valutare la sopravvivenza delle cellule e la crescita di Teratoma

  1. Timepoints desiderato dopo l'inoculazione, eseguire un'iniezione intraperitoneale (IP) di 375 mg/kg della sonda del reporter D-luciferina in topi.
  2. 10 min dopo un'iniezione di IP, immagine la bioluminescenza segnale negli animali anestetizzati (eseguite come descritto nel passo 3.5) per 30 min utilizzando windows acquisizione 1min a intervalli di 5 min.
    Nota: Acquisizioni di immagine settimanale sono raccomandati. L'anestesia è effettuata durante la formazione immagine fornendo inalato isoflurano tramite un cono di naso.
  3. Per l'analisi dei dati, disegnare una regione di interesse (ROI) sopra il segnale BLI e, quindi, normalizzare per il tempo di acquisizione quantificare le emissioni in unità di massime fotoni al secondo per centimetro quadrato per steradiante (/sr fotoni/s/cm2).

5. teratoma irradiazione utilizzando un irradiatore preclinici di immagine-guida (Figura 1)

  1. Anestetizzare un mouse nella finestra di atterramento utilizzando 2% isoflurane in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 L/min. Dopo che il mouse è completamente anestetizzato, trasferirlo al letto di un irradiatore pre-clinica guidata da immagini (Vedi Tabella materiali). Mantenere l'anestesia da 2% isoflurane continuamente tramite un cono di naso.
  2. Acquisire immagini micro-CT come un insieme di 400 immagini di proiezione oltre 360° utilizzando un 40 kVp, fascio di raggi x 2 mA e ricostruire quelle in immagini volumetriche con una dimensione di pixel isotropo di 0,2 mm.
  3. Pianificare un trattamento di radiazione usando le immagini di micro-CT usando il pacchetto di software di RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) ed eseguire il trattamento.
    Nota: Il piano di trattamento utilizzato è costituito da fasci di raggi x due 225 kVp, orientati a passare attraverso il teratoma superficiale destinazione mentre costeggiando la superficie del resto del mouse e con parsimonia i visceri sottostanti. I tempi di esposizione per le travi vengono regolati in base il trimestrale dei dati di calibrazione di sistema affinché la dose al centro del tumore bersaglio era 6 Gy.
  4. Ripetere il processo di trattamento per tre giorni consecutivi di consegnare un totale di 18 Gy al tumore di destinazione.
  5. Mantenere standard di post-trattamento cura degli animali.

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Risultati

Topi iniettati in genere dimostrerà la formazione di teratoma crescita dopo 4 – 8 settimane come confermato da BLI imaging (Figura 2). I tumori si ridurranno drasticamente quando irradiati con una dose cumulativa di 18 Gy dato un mese dopo la consegna delle cellule, provocando una diminuzione significativa nel segnale di luciferasi (Figura 2). D'importanza, tessuti normali prelevati 5 mm dal sito irradiato non sembrano avere a...

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Discussione

I dati preclinici e casi aneddotici da vittime del "turismo delle cellule staminali" confermano che il rischio di sviluppare i teratomas è un grave inconveniente associato PSC trattamenti23. Sviluppo di approcci attenti per prevenire e trattare il rischio neoplastico associato a terapie con cellule staminali è, pertanto, un passo importante nel facilitare la traduzione clinica delle terapie rigenerative delle cellule staminali. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo di targeting terapeu...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori vorrei ringraziare la nazionale istituti di salute R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) e 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); e l'Istituto cardiovascolare di Stanford (ASL) per il loro sostegno.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Induced Pluripotent Stem Cell Control LineStanford UniversityNguyen LabCell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234Fisher ScientificCB-40234Cell culture of iPSC
Essential 8 culture mediumATCC-The global bioresource center30-2203Cell culture of iPSC
Tryple EGibco12605-036Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)Fisher ScientificS104950MGCell culture of iPSC
LentivirusCyagenP170721-1001cjnTransduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection ReagentMillipore SigmaTR-1003-GTransduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoterStanford UniversitySam Gambhir labTransduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferinPerkin Elmer122799Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)BD Biosciences FACSAriaTransduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)Promega Bio Systems, Sunnyvale, CAGM2000Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer124262BLI
IsofluraneSigma-AldrichCDS019936irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator Precision X-ray Inc., North Branford, CTX-Rad SmARTirradiation
RT_Image software packageStanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)RT_Image v0.2βIrradiation

Riferimenti

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