Scelta e analisi biologiche No-scelta per studiare l'impupamento preferenza e il successo di emersione di Ectropis grisescens

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la preferenza di impupamento delle larve mature di Ectropis grisescens in risposta a fattori di terreno (ad es., substrato tipo e contenuto di umidità) utilizzando analisi biologiche scelta. Presentiamo anche un protocollo di analisi biologiche no-scelta per determinare i fattori che influenzano i comportamenti di impupamento e sopravvivenza di E. grisescens.

Abstract

Molti insetti vivono sopra la terra come larve e adulti e come pupate sotto terra. Rispetto alle fasi sopra-terra dei loro cicli di vita, meno attenzione su influenza di fattori ambientali come questi insetti quando si impupano all'interno del suolo. Il looper di tè, Ectropis grisescens Warren (Lepidoptera: Geometridae), è una grave peste di piante da tè e ha causato le perdite economiche enormi in Cina del sud. I protocolli descritti qui proponiamo di indagare, attraverso analisi biologiche a scelta multipla, se maturo ultimo-instar E. grisescens larve possono discriminare variabili del suolo come il contenuto di tipo e l'umidità del substrato e determinare, attraverso no-scelta le analisi biologiche, l'impatto del contenuto substrato tipo e umidità sui comportamenti impupamento e il successo di emersione del E. grisescens. I risultati sarebbero migliorare la comprensione dell'ecologia impupamento di E. grisescens e possono portare intuizioni tattiche di gestione del suolo per la soppressione E. grisescens popolazioni. Inoltre, queste analisi biologiche possono essere modificate per studiare le influenze di vari fattori sui comportamenti impupamento e sopravvivenza dei parassiti del terreno-pupating.

Introduzione

Rispetto agli stadi larvali e adulti di insetti, stadio pupale è altamente vulnerabile a causa della limitata capacità mobile delle pupe, che non possono sfuggire rapidamente da situazioni pericolose. Pupating sotto la terra è una strategia comune utilizzata da diversi gruppi di insetti (ad es., negli ordini Diptera^1,2,3,4,⁵di coleotteri, imenotteri⁶, Tisanotteri⁷e lepidotteri^8,9,10,11,12) per proteggerli dai predatori fuoriterra e pericoli per l'ambiente. Molti di loro sono gravi agricolo e forestale parassiti^{1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12}. Le larve mature di questi insetti del suolo-pupating solitamente lasciano loro padroni di casa, cadono a terra, vagano per trovare un sito idoneo, traforare il suolo e costruire una camera di pupal per pupating^8,10.

Il looper di tè, Ectropis grisescens Warren (Lepidoptera: Geometridae), è uno dei più significativi defogliatore parassiti del tè pianta Camellia sinensis L.¹³. Anche se questa specie venne descritta nel 1894, è stato erroneamente identificato come Ectropis obliqua Prout (Lepidoptera: Geometridae) in passato decenni^14,15. Le differenze nella morfologia, biologia e distribuzione geografica tra le due specie di pari livello sono stati descritti in alcuni recenti studi^14,15,16. Per esempio, Zhang et al. ¹⁵ riferito che obliquo E. si è verificato principalmente ai confini di tre province (Anhui, Jiangsu e Zhejiang) della Cina, mentre E. grisescens ha una distribuzione molto più ampia rispetto ai obliquo E.. Pertanto, le perdite economiche causate da E. grisescens sono in gran parte trascurate, e la conoscenza di questo parassita deve essere ampiamente rivista e rinnovata^16,17,18,19 . Nostri studi precedenti hanno mostrato che E. grisescens preferiscono pupate all'interno del terreno, ma potrebbe anche pupate quando il terreno non è disponibile (no-impupamento-substrato condizioni)^11,12.

Questo documento fornisce una procedura dettagliata per (1) determinare la preferenza di impupamento di E. grisescens in risposta a fattori quali il tipo di substrato e umidità contenuti utilizzando analisi biologiche a scelta multipla e (2) determinare l'impatto dei fattori abiotici sui comportamenti di impupamento e successo di emersione di E. grisescens utilizzando analisi biologiche no-scelta. Tutte queste analisi biologiche sono condotte in condizioni di laboratorio ben controllato. Inoltre, queste analisi biologiche sono adattate per valutare l'influenza di altri fattori sui comportamenti impupamento e la sopravvivenza di diversi insetti del suolo-pupating.

Protocollo

1. umidità-scelta le analisi biologiche per determinare impupamento preferenza di E. grisescens

1. Come ottenere mature ultimo-instar larve di E. grisescens
   1. Tagliare i germogli freschi (30-40 cm di lunghezza) di piante di tè (Camellia sinensis L.). Inserire 25-30 germogli in un matraccio da triangolare a 250 mL. Riempire il pallone con acqua del rubinetto. Mettere 3-4 boccette (con germogli di tè) in una bacinella di plastica (lato superiore: 51 cm di diametro; lato inferiore: diametro 40 cm; altezza: 16 cm).
   2. Rilasciare le larve di 1.000-2.000 (secondo al quinto instar) della Colonia laboratorio di E. grisescens sulle foglie dei germogli di tè in ogni bacino. Mantenere queste larve alle condizioni di laboratorio controllate [un fotoperiodo di 14 h di luce seguita da 10 h di buio (14:10 L:D), 60-90% di umidità relativa (RH) e 24-28 ° C]. Trasferire con cautela le larve su foglie fresche di mano ogni 1-2 d. Ogni giorno rimuovere feci e detriti dal fondo dei bacini.
   3. Selezionare mature ultimo-instar larve che cadono dalle foglie dei germogli tè e vagano attivamente sul fondo del bacino. Ottenere almeno 240 larve mature per garantire che abbastanza larve sono disponibili per le analisi biologiche.
      Nota: Selezionare solo le larve attivamente errante per gli esperimenti. Non selezionare le larve che rimangono sulle foglie, perché queste non sono pronte a pupate. Inoltre, non selezionare membranose con attività limitate mobile perché essi non attivamente cerca le giuste condizioni dopo essere stato rilasciato in arene analisi biologica.
2. Preparazione del substrato
   1. Raccogliere e identificare 4 tipi di substrato (ad es., sabbia, terriccio sabbioso 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) utilizzando il metodo di Idrometro²⁰. Sterilizzare il terreno e la sabbia a 80 ° C forno essiccatore per > 3 d e quindi asciugare completamente il terreno e la sabbia a 50 ° C per diverse settimane fino a quando il peso a secco dei campioni substrato non cambia piu ' nel tempo.
   2. Terreno il terreno asciutto con mortai e pestelli di legno. Setacciare la sabbia e il terreno con messa a terra attraverso un setaccio di 3 mm e conservarle in sacchetti di plastica sigillabili.
   3. Calcolare il contenuto di umidità di ogni substrato (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 o limo terriccio) come segue²:
      
   4. Aggiungere la quantità necessaria di acqua distillata in sacchetti di plastica sigillabili contenente il terreno asciutto o sabbia per preparare 5%-, 20%-, 35%-, 50%, 65% e 80%-umidità del substrato. Mescolare bene l'acqua distillata e il terreno o sabbia.
3. Preparazione di analisi biologica arena
   1. Dividere equamente i contenitori in polipropilene (lato superiore: 20,0 cm di lunghezza x 13.5 cm in larghezza, lato inferiore: 17,0 cm di lunghezza x 10.0 cm di larghezza, altezza: 6,5 cm) in 6 camere con lenzuola impermeabile cloruro di polivinile (PVC) (altezza: 3,5 cm). Difficoltà i fogli di PVC e sigillare le fessure con colla a caldo.
      Nota: Sigillare completamente ogni crepa per evitare acqua permeazione.
   2. Per ogni test, riempire le 6 camere utilizzando lo stesso tipo di substrato con contenuto di umidità differenti (5%-, 20%-, 35%-, 50%, 65% e 80% umidità) (Figura 1a).
      Nota: Utilizzare solo 1 tipo di substrato del contenuto di umidità in ogni test. Assegnare in modo casuale l'ordine delle sezioni che contengono il substrato con il contenuto di umidità 6.
   3. Incollare 4-6 pezzi di foglie di tè fresco usando piccoli pezzi di nastro per coprire la superficie interna dei coperchi dei contenitori in polipropilene (Figura 1b).

Figura 1: esempi di arene di analisi biologica per i test scelta. (un) impermeabile fogli di cloruro di polivinile (PVC) vengono utilizzati per dividere equamente i contenitori in polipropilene in 6 camere. Fogli di PVC sono fissati con colla a caldo, e tutte le crepe sono accuratamente sigillate. In questo esempio, terriccio sabbioso 2 con contenuto di umidità differenti (5%, 20%, 35%, 50%, 65% e 80% umidità) vengono utilizzati per riempire le camere negli ordini assegnati in modo casuale. (b) il tè fresco foglie vengono incollate sul lato interno delle palpebre dove il maturo Ectropis grisescens larve saranno rilasciate. (c) PVC fogli vengono utilizzati per dividere equamente i contenitori in polipropilene in 4 alloggiamenti, che sono pieni di 4 tipi di substrati (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) al 50% di umidità. Questa figura è stata modificata da Wang et al. ¹¹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Impostazione di analisi biologica e registrazione dati
   1. Versione 30 mature ultimo-instar larve (ottenute al passaggio 1.1.3) sulle foglie di tè fresco incollate sul coperchio del contenitore in polipropilene. Capovolgere con cautela il coperchio e coprire ermeticamente il contenitore in polipropilene.
   2. Ripeti ogni prova 8x. Mantenere le arene di analisi biologica in un ambiente di camera ambientale presso un fotoperiodo di 14:10 (L:D) e 26 ° C.
   3. Il giorno 5, contare il numero di pupe sulla superficie del terreno in ogni camera. Inoltre, smantellare le analisi biologiche e contare il numero di pupe all'interno del substrato.
      Nota: Solo contare le pupe dal vivo su o all'interno del substrato. Verificare la fattibilità di pupe osservando movimenti addominali dopo aver toccato le pupe usando il forcipe.
5. Analisi dei dati
   1. Per ogni test, calcolare la percentuale di pupe trovato in ogni alloggiamento di ogni replica. Trasferire i dati di percentuale per il rapporto di log utilizzando il metodo fornito da Kucera e Malmgren²¹.
   2. Compara la percentuale delle pupe (dati trasformati) in ogni camera usando un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). Impostare i livelli di significatività a α = 0.05 per ogni test.

2. analisi biologiche substrato-scelta per determinare la preferenza di impupamento di E. grisescens

1. Ripetere il passaggio 1.1 ottenere mature ultimo-instar larve e passo 1.2 per preparare il substrato con contenuto di umidità diversi. Questa volta, sono necessari solo 20%, 50% e 80%-umidità del substrato.
2. Preparazione delle arene analisi biologica
   1. Simile al punto 1.3.1, ugualmente dividere i contenitori in polipropilene in 4 sezioni utilizzando teli in PVC. Difficoltà i fogli di PVC e sigillare le fessure con colla a caldo.
   2. Per ogni test, riempire le camere con i 4 tipi di substrati (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) che hanno lo stesso contenuto di umidità (20%, 50% o 80% umidità) con casualmente assegnato ordini (Figura 1C). Ripetere il passaggio 1.3.3 per preparare i coperchi.
3. Ripetere il passaggio 1.4 per impostare analisi biologiche e registrare i dati e passo 1,5 per analizzare i dati.

3. No-scelta le analisi biologiche per determinare il comportamento del suolo-burrowing e il successo di emersione di E. grisescens

1. Ripetere il passaggio 1.1 per ottenere le larve di ultimo-instar mature e passo 1.2 per preparare i 4 substrati (sabbia, sabbia terriccio 1, sabbia terriccio 2 e limo del terriccio) alle 3 contenuto di umidità (20%, 50% e 80% umidità).
2. Impostazione di analisi biologica
   1. Aggiungere il substrato in un contenitore di plastica (lato superiore: 11,5 cm di diametro; lato inferiore: 8,5 cm di diametro; altezza: 6,5 cm) ad una profondità di 3 cm. In totale, assicurarsi che non ci saranno 12 trattamenti (le combinazioni di 4 tipi di substrato e 3 contenuti di umidità). Ripetere ogni trattamento 7 x.
   2. Versione 15 mature ultimo-instar larve sul substrato di ogni arena di analisi biologica. Sigillare i contenitori ermeticamente coprendo i coperchi. Mantenere le analisi biologiche in un ambiente di camera ambientale presso un fotoperiodo di 14:10 (L:D) e 26 ° C.
      Nota: Non ci sarà alcun bisogno di incollare le foglie di tè fresco sui coperchi come accennato nelle analisi biologiche scelta.
3. Analisi e registrazione dei dati
   1. Il giorno 3, contare il numero di pupe e qualsiasi larve morte sulla superficie del substrato di ogni replica. Calcolare la percentuale di individui E. grisescens che scavava nel substrato come segue:
      
   2. Registrare il numero di adulti emergenti ogni giorno fino a quando non più adulto è emerso per 15 d. calcolare il successo di emergere come segue:
      
   3. Confrontare la percentuale di individui rintanati e il successo di emergere tra i trattamenti utilizzando One-way ANOVA. Impostare i livelli di significatività a α = 0.05.

Risultati

Le analisi biologiche di umidità-scelta ha mostrato che significativamente più individui E. grisescens popolate su o entro il 5% e 35% umidità sabbia rispetto alla sabbia umidità del 80% (Figura 2a). Tuttavia, significativamente più individui preferiscono pupate su o all'interno del suolo (terriccio sabbioso 1 e 2 e del terriccio limo) che aveva un contenuto di umidità intermedia (figure 2b - 2d).

Discussione

Preferenze di impupamento rispondendo alle variabili differenti del terreno sono state studiate in pochi parassiti^6,9,22,23. Ad esempio, per studiare la preferenza delle larve mature di Bactrocera tryoni (Froggatt) (Diptera: Tephritidae) tra condizioni di umidità del terreno, Hulthen e Clarke²² set contenente 9 contenitori riempiti con un design del latino-Piaz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triangular flask	Bomex Chemical (Shanghai) Co., LTD	99	250 mL
Plastic basin	Chahua, Fuzhou, China	100	upper side: 51 cm in diameter; bottom side: 40 cm in diameter; height: 16 cm
Zip lock bags	Glad, Guangzhou, China	126/133
Polypropylene containers	Youyou Plastic Factory, Taian, China	139/155/160/161/190	upper side: 20.0 cm [L] × 13.5 cm [W], bottom side: 17.0 cm [L] × 10.0 cm [W], height: 6.5 cm
Waterproof polyviny chloride sheet	Yidimei, Shanghai, China	141
Tape	V-tech, Guangzhou, China	VT-710
Oven drier	Kexi, Shanghai, China	KXH-202-3A
Environmental chamber	Life Apparatus, Ningbo, China	PSX-280H