Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro

Riepilogo

Descriviamo tre metodi sperimentali per la valutazione dell'attività di hypopigmentation di sostanze chimiche in vitro: quantificazione del contenuto di attività e melanina 2) 1) cellulare tirosinasi e 3) misurazione della melanina di melanina cellulare colorazione e analisi delle immagini.

Abstract

Questo studio presenta metodi di laboratorio per la quantificazione di hypopigmentation attività in vitro. Melanina, il pigmento più importante nei melanociti, è sintetizzata in risposta a più fattori cellulari e ambientali. Melanina protegge le cellule della pelle da danno ultravioletto, ma ha anche funzioni biochimiche e biofisiche. Eccessiva produzione o accumulo di melanina nei melanociti possa causare problemi dermatologici, come lentiggini, macchie scure, melasma e talpe. Di conseguenza, il controllo della melanogenesi con agenti di ipopigmentazione è importante in individui con esigenze cliniche o cosmetici. Melanina è sintetizzata principalmente nei melanosomi dei melanocytes in un complesso processo biochimico chiamato melanogenesi, che sono influenzata dalla estrinseca e fattori intrinseci, quali ormoni, l'infiammazione, l'età e l'esposizione alla luce ultravioletta. Descriviamo tre metodi per determinare l'attività di ipopigmentazione dei prodotti chimici o sostanze naturali nei melanociti: misura della attività della tirosinasi 1) cellulare e contenuto 2) della melanina e melanina cellulare 3) colorazione e quantificare con immagine analisi.

Nella melanogenesi, tirosinasi catalizza la tappa limitante che converte L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (l-dopa) e poi in Dopachinone. Di conseguenza, l'inibizione della tirosinasi è un meccanismo primario hypopigmentation. In melanociti coltivati, attività della tirosinasi può essere quantificato l'aggiunta di l-dopa come substrato e misurando dopachinone produzione mediante spettrofotometria. Melanogenesi possono anche essere misurata da quantificare il contenuto di melanina. La frazione cellulare melanina-contenenti è estratta con NaOH e melanina è misurata spettrofotometricamente. Infine, il contenuto di melanina può essere quantificato mediante analisi d'immagine seguendo Fontana-Masson colorazione della melanina. Anche se i risultati di queste analisi in vitro non possono essere sempre riprodotto in pelle umana, questi metodi sono ampiamente utilizzati nella ricerca di melanogenesi, soprattutto come il passo iniziale per identificare potenziali attività di ipopigmentazione. Questi metodi possono essere utilizzati anche per valutare l'attività dei melanociti, la crescita e la differenziazione. Risultati coerenti con i tre diversi metodi garantiscono la validità degli effetti.

Introduzione

Melanina svolge un ruolo critico nella fisiologia, patologia e tossicologia di diversi organi tra cui la pelle, occhi e cervello¹. Le principali funzioni di melanina sono effetti foto-screening e biochimici. Melanina assorbe la luce visibile e vicino infrarosso, così come la radiazione ultravioletta (UV), con tassi di assorbimento aumentato a lunghezze d'onda più corta della luce; così, melanina protegge i tessuti dai danni causati dalla luce visibile o UV radiazione². Melanina è un antiossidante e ha un'affinità per metalli e altre sostanze chimiche tossiche; di conseguenza, può proteggere tessuti dallo stress ossidativo e chimica³. Tuttavia, l'eccessiva produzione di melanina provoca problemi dermatologici.

La quantità e qualità di melanina nella pelle e iris sono le determinanti più importanti del colore dell'iride e della pelle. Gli individui possono avere preferenze di colore di pelle differente; alcuni favoriscono la pelle abbronzata, mentre altri preferiscono colori più chiari di pelle. A seconda di questi profili di consumo, ipopigmentazione cosmetici sono stati sviluppati per soddisfare i singoli mercati per pelle favorito colori⁴. Di conseguenza, gli studi di attività, l'ipopigmentazione e anti-melanogenic sono importanti sia scientificamente e praticamente.

Melanogenesi sono il processo di biosintesi di melanina attraverso una serie di reazioni chimiche spontanee e non enzimatici nei melanociti. Un Melanocita è circondato da circa 36 cheratinociti e melanociti sono le fabbriche di sintesi di melanina che distribuiscono il loro prodotto ai keratinocytes vicini. In pelle, la melanina prodotta e memorizzati nel vano melanosomal dei melanociti è trasportata ai keratinocytes vicini nell'epidermide tramite dendriti.

L-tirosina serve come il substrato iniziale per melanogenesi e l'enzima tirosinasi catalizza due reazioni consecutive che convertono L-tirosina in 3,4-diidrossifenilalanina (DOPA) e poi in Dopachinone. Queste reazioni sono la tappa limitante nella melanogenesi^5,6. Di conseguenza, ipopigmentazione attività prima può essere misurata valutando attività tirosinasica cellulare direttamente. Per farlo, gli estratti di melanociti contenente tirosinasi sono incubati con DOPA e il dopachinone prodotta nei campioni può essere misurata mediante spettrofotometria a 475 nm. I valori sono normalizzati dalle concentrazioni di proteine dei campioni e delle sostanze con risultato di attività di hypopigmentation in meno formazione dopachinone rispetto ai comandi.

In secondo luogo, ipopigmentazione attività può essere quantificato misurando la melanina in melanociti coltivati direttamente. Dopo trattando le cellule con il materiale di prova, la melanina viene estratto in condizioni alcaline e il contenuto di melanina è quantificato mediante spettrofotometria a 400 nm. Un agente di ipopigmentazione si tradurrà in un minor contenuto di melanina che la controlli⁷.

Infine, l'attività di ipopigmentazione può essere quantificata dalla Fontana-Masson melanina macchiatura e analisi delle immagini successive. Nella macchiatura di Fontana-Masson, granuli di melanina riducono il nitrato di ammoniaca-argento allo stato metallico nero visibile e le zone nere delle cellule in immagini microscopiche rappresentano la quantità di melanina.

Un agente di hypopigmentation dà solitamente risultati coerenti e comparabili con questi tre metodi, che conferma che l'attività della sostanza è valido. In alternativa, può essere utile misurare l'espressione di geni chiave e proteine nella melanogenesi in risposta alla sostanza in esame per esaminare l'attività di ipopigmentazione. Oltre alla tirosinasi, proteine tirosinasi (TRP-1) e tautomerase del dopachrome (TRP-2) sono enzimi critici nella melanogenesi⁸. Il fattore di trascrizione microftalmia-collegata di fattore di trascrizione (MITF) è un regolatore matrice nella melanogenesi e quantificazione dei suoi livelli di espressione di proteina/del gene o un'analisi di attività del promotore è utilizzabile anche per valutare l'attività di ipopigmentazione.

Protocollo

1. preparazione del Medium, composti e reagenti

1. Preparare mezzo completo di sviluppo di B16F10. Supplemento Dulbecco per volta mezzo di Eagle (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina (PEST).
   1. Per fare 500 mL di terreno completo, mix 445 mL di mezzo di Eagle di Dulbecco modificato (DMEM) con 50 mL di FBS e 5 mL di PEST in una bottiglia di vetro sterilizzati 1 L. Dopo aver mescolato delicatamente, filtrare il mezzo attraverso un filtro di parte superiore della bottiglia da 0,2 µm per una nuova bottiglia di vetro sterilizzati e poi conservare a 4 ° C.
      Attenzione: Tutte le tecniche di coltura cellulare dovrebbero essere intrapresa in sicurezza microbiologica mobile utilizzando una tecnica asettica per garantire la sterilità.
2. Preparare il tampone di lisi: 20 mM Tris (idrossimetil) amminometano contenente 0,1% Triton X-100 (v/v) tampone a pH 7,5 (pH regolato con HCl). Questo buffer può essere utilizzato per 3 mesi se conservato a temperatura ambiente (TA). Aggiungere gli inibitori della proteasi per il buffer di lisi bene prima dell'uso.
3. Preparare il tampone di dosaggio inibitore della tirosinasi. Preparare 1 M NaH₂PO₄ (monobasico) e 1 M Na₂HPO₄ (bibasici) soluzioni di riserva. Mescolare 46,3 mL di Na₂HPO₄ e 53,7 mL di NaH₂PO₄ per preparare un volume finale di tampone fosfato di sodio 0.1 M (pH 6,8).
   1. Diluire la miscela risultante di 1 L (volume finale) con H₂O. regolare il pH della soluzione finale a 6,8. Questo buffer può essere utilizzato per 1 mese se conservati a 4 ° C.
4. Preparare la soluzione di substrato di tirosinasi: 0,1% 3,4-diidrossi-L-fenilalanina (DOPA, p/v) dissolto in tampone di dosaggio inibitore della tirosinasi (Vedi punto 1.3).
   Attenzione: Tenere il ghiaccio mentre è in uso.
5. Facoltativamente, preparare tirosinasi fungo di 100 U/mL. Sciogliere la tirosinasi fungo liofilizzata in tampone di dosaggio inibitore della tirosinasi. Questa soluzione può essere utilizzata per 2 mesi se conservato a – 20 ° C. L'attività della tirosinasi fungo così come attività tirosinasica cellulare vengono calcolati in presenza di materiali di cella.
   Attenzione: La soluzione è aliquotata prima congelamento così ripetuto congelamento e scongelamento può essere evitato. Mantenere la soluzione sul ghiaccio mentre è in uso.
6. Preparare la soluzione di NaOH N 1. Pesare 4 g di NaOH in un matraccio tarato e scioglierlo nell'acqua distillata per portare 100 mL.
7. Preparare la soluzione di fissaggio (10% formalina). Diluire 27 mL di formaldeide al 37% con 73 mL di acqua distillata. Preparare freschi ogni giorno.
8. Preparare soluzione d'argento ammoniacale. Preparare 5 mL di soluzione di nitrato d'argento 10% in un matraccio tarato. Aggiungere goccia a goccia, la soluzione di idrossido di ammonio fino alla completa dissoluzione del precipitato. Aggiungere 200 μL di soluzione di nitrato d'argento (10%). La soluzione diventerà leggermente nuvolosa.
   Attenzione: Evitare il contatto e l'inalazione. Utilizzare una cappa aspirante.
9. Preparare soluzione d'argento ammoniacale. Diluire 2,5 mL della soluzione d'argento ammoniacale con 7,5 mL di acqua distillata. Utilizzare una sola volta e poi scartare.
   Attenzione: Evitare il contatto e l'inalazione. Utilizzare una cappa aspirante.
10. Preparare cloruro 0,1% d'oro. Preparare 1 mL di cloruro 10% oro e aggiungere 99 mL di acqua distillata in un matraccio tarato. Preparare freschi ogni giorno.
11. Preparare la soluzione salina tampone fosfato (PBS). Aggiungere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na₂HPO₄ e 0,24 g di KH₂PO₄ in 800 mL di acqua distillata. Aggiustare il pH a 7.4 con HCl. Diluire la miscela risultante di 1 L (volume finale) con acqua distillata.
12. Preparare la soluzione di tiosolfato di sodio 5% (p/v) disciolto in acqua distillata.

2. cultura e trattamento delle cellule

1. Utilizzare cellule B16F10 commercialmente disponibili. Mantenere le cellule B16F10 in sostanza completa. Mantenere il matraccio di cultura delle cellule in un umidificata, 5% CO₂ atmosfera incubatore a 37 ° C.
2. Preparare le sostanze da testare, controllo positivo dell'inibitore e campioni di controllo negativo.
   1. Sciogliere le sostanze in esame nei solventi appropriati. Sciogliere i composti solubili in acqua in acqua bidistillata. Sciogliere acqua composti insolubili in solvente organico adeguato, ad es., DMSO.
   2. Qui, utilizzare arbutina disciolto in acqua bidistillata (125 μg/mL) come controllo positivo per valutare l'attività di hypopigmentation rispetto ai residui della prova o un controllo negativo. Come controllo negativo (controllo veicolo-trattato), utilizzare le soluzioni o i buffer utilizzati nel campione da analizzare, ad esempio, acqua bidistillata, DMSO, etanolo.
3. Semina delle cellule e trattamento
   1. Cellule B16F10 seme a 5 × 10⁴ cellule/pozzetto in piastre di coltura 24 pozzetti utilizzando terreno completo e incubare in incubatore a CO₂ per 24 h. Dopo l'incubazione, aspirare la sostanza completa.
   2. Incubare le cellule con il mezzo di DMEM (senza FB e 1% di penicillina/streptomicina) contenente sostanze da testare, un controllo di inibitore o un controllo negativo in un'incubatrice di CO₂ per celle di 72 h. Check ogni 24h sotto il microscopio. Dopo questo passaggio, passare alla procedura 3-5 per ulteriori esperimenti.
      Attenzione: La miscela della sostanza in esame e DMEM media dovrebbe essere filtrata attraverso un filtro di 0,2 μm.

3. misurazione dell'attività della tirosinasi cellulare

1. Utilizzando il metodo descritto nel passaggio 2, rimuovere i supporti e sciacquare le cellule due volte con 300 µ l di PBS freddo.
2. Mettere la piastra di coltura delle cellule sul ghiaccio. Aggiungere 300 μL di tampone di lisi e incubare per 5 min. Raccogliere l'utilizzando un raschietto di cella lysate delle cellule, quindi trasferire il lysate delle cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
3. Omogeneizzare il lysate delle cellule con un omogeneizzatore di cella a 14.500 giri/min per 2 s, 3 volte sul ghiaccio per ottenere tirosinasi intracellulare. Utilizzare la specifica condizione ottimale per l'omogeneizzatore.
4. Centrifugare per 10 min a 12.000 × g a 4 ° C e trasferire il surnatante delle cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Tenere il ghiaccio mentre è in uso.
5. Trasferimento 70 μL del surnatante in una micropiastra 96 pozzetti chiaro polistirolo.
6. Aggiungere 140 µ l di una soluzione contenente substrato tirosinasi (DOPA) di una micropiastra 96 pozzetti chiaro polistirolo, agitare delicatamente e incubare per 2 ore a 37 ° C.
7. Opzionale, aggiungere 70 μL di soluzione di tirosinasi fungo 100 U/mL ad ogni pozzetto e incubare per 2 ore a 37 ° C.
8. Misurare l'attività della tirosinasi alla lunghezza d'onda di 475 nm utilizzando il lettore di micropiastre.
9. Normalizzare l'attività della tirosinasi alla concentrazione di proteina di ciascun campione. Misurare la concentrazione di proteina di ciascun campione da un'analisi di Bradford.

4. misurare il contenuto di melanina

1. Utilizzando il metodo descritto nel passaggio 2, rimuovere i supporti e sciacquare le cellule due volte con 300 µ l di PBS freddo.
2. Mettere la piastra di coltura delle cellule sul ghiaccio. Aggiungere 300 μL di tampone di lisi e incubare per 5 min. Raccogliere l'utilizzando un raschietto di cella lysate delle cellule, quindi trasferire il lysate delle cellule in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
3. Centrifugare per 10 min 12.000 × g a 4 ° C.
4. Trasferire il surnatante in una concentrazione di proteine totali di nuovo tubo e misura per la normalizzazione. Misurare la concentrazione di proteina di ciascun campione da un'analisi di Bradford.
5. Aggiungere 300 μL di 1 N NaOH ad ogni pellet e incubare a 60 ° C per 1 h.
6. Centrifugare la soluzione disciolta per 10 min a 12.000 × g a 4 ° C.
7. Trasferire 200 μL del surnatante in una micropiastra a 96 pozzetti.
8. Misurare il contenuto di melanina ad una lunghezza d'onda di 400 nm.
9. Normalizzare il contenuto di melanina per la concentrazione nella proteina.

5. Fontana – Masson macchiatura

1. Macchiatura di Fontana-Masson
   1. Lavare le cellule due volte con 300 µ l di PBS freddo.
   2. Aggiungere 200 μL di formalina al 10% ad ogni pozzetto e incubare per 1 h a 4 ° C.
   3. Sciacquare con acqua distillata.
   4. Aggiungere 200 μL di pre-riscaldato argento ammoniacale soluzione di lavoro e incubare per 1h a 37 ° C o fino a quando le cellule diventano di colore giallo/marrone.
      Attenzione: Porre soluzione d'argento ammoniacale mescolate in un bagno di acqua 58 – 60° C e consentono un tempo adeguato per la temperatura equilibrare.
   5. Argento ammoniacale soluzione di lavoro di rimuovere e sciacquare con acqua distillata.
   6. Rimuovere l'acqua distillata. Aggiungere 200 μL di cloruro 0,1% oro e incubare per 2 minuti a TA.
   7. 0,1% di soluzione di cloruro di oro di rimuovere e sciacquare con acqua distillata.
   8. Rimuovere l'acqua distillata. Aggiungere 200 μL di soluzione di tiosolfato di sodio (5%, p/v) e incubare per 2 min.
   9. Rimuovere la soluzione di tiosolfato di sodio e sciacquare con acqua distillata.
   10. Rimuovere l'acqua distillata. Aggiungere 200 μL di Nuclear Fast Red e incubare per 5 min.
   11. Nuclear Fast Red di rimuovere e sciacquare con acqua corrente.
   12. Rimuovere l'acqua del rubinetto e osservare le cellule marcate sotto un microscopio.
2. Fontana – Masson macchiatura (soglia analisi usando ImageJ)
   Nota: È riportato un esempio della procedura di analisi di immagine utilizzando il software ImageJ nei materiali supplementari.
   1. Aprire il programma ImageJ.
   2. Selezionare il File di | Aperto | Immagine al microscopio.
   3. Selezionare immagine | Regolare | Soglia di colore.
   4. Per misurare la zona macchiata con Fontana – Masson, impostare la barra della luminosità parametro a zero e regolare la barra della luminosità per trovare il punto in cui tutte le cellule marcate (nero o marrone scuro) sono incluse.
   5. Selezionare analizzare | Analizzare le particelle. Riepiloga la casella nella finestra di particelle analizza e premere OK. Ottenere il risultato di riepilogo e incollare in un foglio di calcolo.
      Nota: La descrizione dei parametri del risultante sono come segue:
      Fetta: Nome di ogni immagine
      Count: Numero di cellule marcate
      Superficie totale: Superficie totale delle cellule contate
      Dimensione media: Area/conteggio totale
      % Di area: Area/totale zona macchiata × 100%; superficie totale viene calcolato automaticamente.
   6. Calcolare la relativa zona macchiata con melanina utilizzando il valore della superficie totale.
      Melanina relativa macchiata zona (%) = valore di superficie cellulare totale dell'area totale del campione/media di test di controllo × 100, vale a dire,

Risultati

Risultati rappresentativi per l'attività di ipopigmentazione dell'arbutina, un anti-melanogenetico compound, in B16F10 melanociti sono riportati di seguito. Figura 1A Mostra che quel arbutina ha soppresso significativamente l'attività della tirosinasi cellulare rispetto al controllo veicolo-trattati. Allo stesso modo, il contenuto di melanina delle cellule stimolate con arbutin è stata ridotta significativamente rispetto ai comandi (Fi...

Discussione

Abbiamo presentato i protocolli per la valutazione dell'attività di ipopigmentazione dei composti di prova utilizzando melanociti coltivati. I risultati rappresentativi hanno mostrato l'effetto di ipopigmentazione dell'arbutina, un inibitore della tirosinasi che ha inibito il contenuto di melanina di attività e cellulare di tirosinasi. Questi metodi sono ampiamente usati nella ricerca di attività anti-melanogenic. Usando queste analisi, abbiamo identificato anche con successo parecchi composti bioattivi che hanno mela...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU