Sintesi, caratterizzazione e applicazione di nanosondanti di ossido di ferro superparamagnetico per il rilevamento della tubercolosi extrapolmonare

Riepilogo

Per migliorare i test diagnostici sierologici per gli antigeni della tubercolosi Mycobacterium, abbiamo sviluppato nanosondie di ossido di ferro superparamagnetico per rilevare la tubercolosi extrapolmonare.

Abstract

Una sonda di imaging molecolare composta da nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIO) e anticorpo superficiale Mycobacterium tuberculosis (MtbsAb) è stata sintetizzata per migliorare la sensibilità all'imaging per la tubercolosi extrapolmonare (ETB). Un nanosonda SPIO è stato sintetizzato e coniugato con MtbsAb. La nanosonda SPIO-MtbsAb purificata è stata caratterizzata utilizzando TEM e NMR. Per determinare la capacità di targeting della sonda, le nanosonda SPIO-MtbsAb sono state incubate con Mtb per analisi di imaging in vitro e iniettate nei topi inoculati da Mtb per l'indagine in vivo con risonanza magnetica (MR). La riduzione del miglioramento del contrasto sulla risonanza magnetica (MRI) delle cellule Mtb e THP1 ha mostrato proporzionale alla concentrazione di nanosonda SPIO-MtbsAb. Dopo 30 minuti di iniezione di nanosonda SPIO-MtbsAb per via endovenosa in topi infettati da Mtb, l'intensità del segnale del sito di granulomatous è stata migliorata di 14 volte nelle immagini MR ponderate T2 rispetto a quella dei topi che ricevono l'iniezione PBS. Le nanosonda MtbsAb possono essere utilizzate come nuova modalità per il rilevamento ETB.

Introduzione

A livello globale, la tubercolosi extrapolmonare (ETB) rappresenta una percentuale significativa di casi di tubercolosi (TB). Tuttavia, la diagnosi di ETB è spesso mancata o ritardata a causa della sua presentazione clinica insidiosa e delle scarse prestazioni sui test diagnostici; I falsi risultati includono squali esatti negativi per bacilli acido-veloce, mancanza di tessuto granulomatoso sulla istopatologia, o fallimento della cultura Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Rispetto ai casi tipici, ETB si verifica meno frequentemente e comporta poca liberazione del Bacilli Mtb. Inoltre, di solito è localizzato in siti di difficile accesso, come linfonodi, pleura e aree osteoarticolari¹. Pertanto, le procedure invasive per l'ottenimento di adeguati campioni clinici, che rendono la conferma batteriologica rischiosa e difficile, sono essenziali^2,3,4.

I test di rilevamento degli anticorpi disponibili in commercio per l'ETB sono inaffidabili per il rilevamento clinico a causa della loro vasta gamma di sensibilità (0,00-1,00) e della specificità (0,59-1,00) per tutti i siti extrapolmonari combinati⁵. I saggi dell'immunospot indicizzato all'enzima (ELISPOT) per l'interferone-z, la proteina filtrante della coltura (CFP) e il bersaglio antigenico venoso precoce (ESAT) sono stati utilizzati per diagnosticare la tubercolosi e latb attiva. Tuttavia, i risultati variano tra diversi siti di malattia per la diagnosi di ETB^6,7,8. Inoltre, la PPD cutanea (derivata della proteina purificata) e QuantiFERON-TB hanno spesso fornito risultati falsi negativi⁹. QuantiFERON-TB-2G è un saggio di reattività immunitaria del sangue intero, che non richiede un campione dall'organo interessato e questo può essere uno strumento diagnostico alternativo^6,10,11. Altri metodi diagnostici tipicamente utilizzati per la meningite da TB, come la reazione a catena della polimerasi, sono ancora troppo insensibili per escludere con fiducia la diagnosi clinica^12,13. Questi test convenzionali dimostrano informazioni diagnostiche insufficienti per scoprire il sito di infezione extrapolmonare. Pertanto, sono richieste clinicamente nuove modalità diagnostiche.

L'imaging molecolare mira a progettare nuovi strumenti in grado di vagliare direttamente specifici obiettivi molecolari dei processi di malattia in vivo^14,15. L'ossido di ferro superparamagnetico (SPIO), un agente di contrasto NMR ponderato T2, può migliorare significativamente la specificità e la sensibilità dell'imaging a risonanza magnetica (MR) (MRI)^16,17. Questa nuova modalità di imaging funzionale può disegnare con precisione i cambiamenti dei tessuti a livello molecolare attraverso interazioni ligando-recettore. In questo studio, è stata sintetizzata una nuova sonda di imaging molecolare, che comprende nanoparticelle SPIO, per coniugare con l'anticorpo superficiale Mtb (MtbsAb) per la diagnosi di ETB. Le nanosondpio SPIO sono minimamente invasive per tessuti e corpi in esame^18,19. Inoltre, queste nanosonde possono dimostrare immagini REM precise a basse concentrazioni a causa delle loro proprietà paramagnetiche. Inoltre, le nanosonda SPIO appaiono suscitare reazioni meno allergiche perché la presenza di ioni di ferro fa parte della fisiologia normale. In questo caso, la sensibilità e la specificità delle nanosonde SPIO-MtbsAb rivolte a ETB sono state valutate sia nei modelli cellulari che in quelli animali. I risultati hanno dimostrato che le nanosonda erano applicabili come agenti di imaging ultrasensibili per la diagnosi di ETB.

Protocollo

Tutto il protocollo relativo all'esperimento sugli animali segue le procedure operative standard per l'allevamento degli animali da laboratorio in conformità con i National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals (8a edizione, 2011) ed è approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.

1. Sintesi di nanoparticelle SPIO

1. Preparare le nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite dextran mescolando vigorosamente una miscela di soluzioni Dextran T-40 (5 mL; 50% w/w) e aquese FeCl₃x 6H₂O (0,45 g; 2,77 mmol) e FeCl₂x 4H₂O (0,32 g; 2,52 mmol) soluzioni a temperatura.
2. Aggiungere rapidamente NH₄OH (10 mL; 7,5% v/v).
3. Mescolare ulteriormente la sospensione nera per 1 h; successivamente, centrifugare a 17.300 x g per 10 min e quindi rimuovere gli aggregati.
4. Separare gli ultimi prodotti SPIO dal T-40 dextran non legato dalla cromatografia a filtrazione in gel²⁰.
5. Caricare la miscela di reazione (volume totale 5 mL) in una colonna di 2,5 cm x 33 cm ed elutare con una soluzione tampone contenente 0,1 M di acetato di Na e 0,15 M NaCl a pH 7,0.
6. Raccogliere le nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro rivestite di dextran nel volume vuoto e valutare che la colonna si elusi per ferro e dextran a 330 e 490 nm utilizzando rispettivamente l'acido cextrallorico e i metodi di fenolo/acido fenolo/solforico²⁰.

2. Sintesi SPIO-MtbsAb

1. Synthesize SPIO-coniugato EDBE utilizzando metodi precedentemente segnalati^21,22.
2. Sintetizzare l'anidride succinico SPIO-EDBE (SA).
   1. Mescolare una soluzione alcalina (5 M NaOH; 10 mL)) di SPIO-EDBE e SA (1 g; 10 mol) a temperatura ambiente per 24 h.
   2. Dialisi la soluzione con 20 cambi di 2 L di acqua distillata utilizzando tubi a membrana porosa molecolare (12.000-14.000 MW cutoff). 6 h per ogni cambiamento.
3. Infine, aggiungere 100 L di SPIO-EDBE-SA (4 mg/mL di Fe) a 400 idrossibenzotriazole e (benzotriazolo-1-yloxy) tripyrrolidinophosphosphonium hexafluorofosfato come catalizzatori e mescolare la soluzione a temperatura ambiente per 24 h.
4. Infine, separare le soluzioni dall'anticorpo non legato attraverso la cromatografia della filtrazione del gel.
5. Caricare la miscela di reazione (5 mL) su una colonna di 2,5 cm x 33 cm ed eluire utilizzando un buffer PBS. Confermare il complesso Ab-nanoparticle (cioè nanosonda) utilizzando un kit di analisi delle proteine dell'acido bicinchoninico²³.

3. Osservazione della morfologia delle particelle e misurazione del livello di rilassamento

1. Esaminare la dimensione media delle particelle, la morfologia e la distribuzione delle dimensioni utilizzando il microscopio elettronico di trasmissione ad una tensione di 100 kV.
   1. Getta la dispersione composita su una griglia di rame a 200 maglie e l'aria si asciuga a temperatura ambiente prima di caricarla al microscopio.
2. Misurare i valori del tempo di rilassamento (T₁ e T₂) delle nanosondazioni utilizzando il rilassante NMR a 20 MHz e 37,0 c .
   1. Calibrare il relaxometer prima di ogni misurazione.
   2. Registrare i valori r₁ e r₂ degli otto punti dati generati tramite inversione-recupero e la sequenza di impulsi Carr-Purcell-Meiboom-Gill, rispettivamente, per determinare r₁ e r₂ rilassantità²⁰.

4. Imaging cellulare

1. Coltivare monociti umani THP-1 in RPMI 1640 con 10% siero bovino fetale, 50 g/mL di gentiluomo gentnamicina solfato, 100 unità/mL penicillin G sodium, 100 g di streptomicina solfato e 0,25 funghi g/mLmizone a 37.
2. Incubare nanosond SPIO-MtbsAb (2 mM) con 10⁶ unità formanti colonia (CFU) di Mycobacterium bovis BCG preincubate con 1 x 10⁷ monociti attivati nei tubi di microcentrifuga (1 mL) in un 5% di CO₂ incubatore a 37 gradi centigradi per 1 h.
3. Centrifuga tubi a 200 x g e scartare il supernatante. Ridissolvere i pellet nel mezzo (200 l).
4. Eseguire la scansione dei campioni utilizzando una sequenza di impulsi eco a gradiente veloce (Tempo di ripetizione (TR) - 500; Ecotime (TE) - 20; Per determinare la specificità e la sensibilità della nanosonda^{da 21,22}.

5. Inoculazione BCG (Bacillus Calmette–Guérin)

1. Ricostituire il vaccino lofilizzato o lo stock batterico nel mezzo di Sauton e quindi diluire lo stock con la salina fino a disperdersi correttamente come descritto in precedenza²⁴.
2. Inoculare un ceppo attenuato vivo di M. bovis BCG, ottenuto da ADIMMUNE (Taipei, Taiwan) (ceppo Connaught; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) a un volume di 0,1 mL/topo (cioè 10⁷ CFU) intradermente nella pelle scapolare dorsale sinistra o destra dei topi, come descritto in precedenza²³. Iniettare la salina nei topi come controllo negativo. Monitorare gli animali ogni giorno dopo l'inoculazione BCG.
3. Sacrificare gli animali 1 mese dopo l'inoculazione batterica utilizzando eutanasia di anidride carbonica. Raccogliere il tessuto dal sito di inoculazione intradermica. Fissare il tessuto in formalina del 10% e incorporare in paraffina per le sezioni seriali a 5-10 m. Sezioni di tessuto macchia con le macchie di ematossia/eosina e ziehl-Neelsen per i batteri^{acidi-veloci 24} e con il blu di Berlino per il ferro ferrico²⁵.

6. Risonanza magnetica in vivo

1. Iniettare chetamina (80 mg/kg di peso corporeo) e xylazina (peso corporeo 12 mg/kg) sottocutaneamente nei topi per l'anestesia animale.
2. Iniettare le sonde SPIO-TbsAb (2 nmol/200) nelle vene posteriori dei topi. Mouse di immagine MR prima e subito dopo l'iniezione della sonda e poi ogni 5 min per 30 min per acquisire immagini spin-eco veloce peso T2 (TR - 3000; TE - 90 ANNI; campo visivo n. 8).
3. Analizza quantitativamente tutte le immagini MR utilizzando l'intensità del segnale (SI), una misura di regioni di interesse definite in posizioni comparabili di un centro di granuloma Mtb e del muscolo posteriore adiacente ad una zona granulomato.
4. Calcolare i miglioramenti relativi del segnale utilizzando la misura SI prima (SIpre; controllo) e 0-3 h dopo l'iniezione (SIpost) degli agenti di contrasto utilizzando la formula
   
   [(SIpost - SIpre)/SIpre]
   
   dove SIpre è la SI della lesione sulla scansione pre-migliorata e SIpost è la SI della lesione sulla scansione post-migliorata^21,22.

Risultati

Sintesi e caratterizzazione della nanosonda SPIO-MtbsAb
Le nanoparticelle SPIO sono state progettate per coniugare con MtbsAb. Il dextran stabilizzato sulla superficie delle nanoparticelle SPIO è stato collegato tramite epichlorohydrin. Le nanoparticelle SPIO sono state successivamente incorporate con EDBE per attivare i gruppi funzionali dell'ammine primario alle estremità del dextran. SA è stata poi coniugata per formare SPIO-EDBE-SA. Le nanosonda SPIO-MtbsAb si sono formate nel passaggio finale ...

Discussione

Analogamente agli studi pertinenti, i nostri risultati relativi alle nanosinde SPIO-MtbsAb hanno dimostrato una specificità significativa per Mtb^27,28. Il granuloma sottocutaneo Mtb è stato trovato 1 mese dopo l'iniezione di TB nei modelli murini. Le tipiche scoperte dell'istoologia granulomatosa della TB includevano l'infiltrazione dei linfociti, la presenza di macrofagi epiteliaidi e la neovascolarizzazione. I bacilli acido-veloci sono stati sparsi nelle lesi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate	Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole	Sigma-Aldrich
dextran(T-40)	GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)	Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate	Fluka
ferrous chloride tetrahydrate	Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG	Pasteur Mérieux	Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI	GE medical Systems	3.0-T, Signa
NH4OH	Fluka
NMR relaxometer	Bruker	NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300	GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25	GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off	Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb	Acris Antibodies GmbH	BP2027
transmission electron microscope	JEOL	JEM-2000 EX II