Adipo-Clear: Un tessuto metodo di compensazione per l'Imaging tridimensionale del tessuto adiposo

Riepilogo

A causa del contenuto elevato del lipido, tessuto adiposo è stato impegnativo per visualizzare usando i metodi istologici tradizionali. Adipo-Clear è un tessuto tecnica che permette di etichettatura robusto e imaging fluorescente volumetrica ad alta risoluzione del tessuto adiposo di compensazione. Qui, descriviamo i metodi per la preparazione del campione, pretrattamento, colorazione, compensazione e montaggio per l'imaging.

Abstract

Tessuto adiposo gioca un ruolo centrale nell'omeostasi energetica e termoregolazione. Esso è composto da diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, vasi sanguigni e le proiezioni del nervo. Sebbene il controllo molecolare di specifica del tipo di cellula e come interagiscono queste cellule sono state sempre più delineate, una comprensione più completa di queste cellule adiposo-residente si può visualizzare la loro distribuzione e architettura durante l'intero tessuto. Approcci attuali di immunoistochimica e immunofluorescenza per analizzare l'istologia adiposa si basano su sezioni sottili di paraffina. Tuttavia, sezioni sottili catturano solo una piccola porzione di tessuto; di conseguenza, le conclusioni possono essere prevenute da quale parte del tessuto è analizzato. Abbiamo quindi sviluppato un tessuto adiposo compensazione tecnica, Adipo-Clear, per consentire la completa visualizzazione tridimensionale di modelli cellulari e molecolari in tessuti adiposi interi. Adipo-Clear è stato adattato da iDISCO / iDISCO +, con specifiche modifiche apportate a rimuovere completamente il lipido immagazzinato nel tessuto, preservando la morfologia del tessuto nativo. In combinazione con microscopia di fluorescenza di luce-foglio, dimostriamo qui l'uso del metodo Adipo-Clear per ottenere immagini ad alta risoluzione volumetriche di un intero del tessuto adiposo.

Introduzione

Fino a poco tempo, il tessuto adiposo fu concepito come un insieme amorfo di cellule adipose. Negli ultimi decenni, la nostra comprensione è cresciuta più sofisticato, con grasso ora riconosciuta per essere un organo complesso contenente diversi tipi di adipociti, così come precursori degli adipociti, cellule immunitarie, fibroblasti, il sistema vascolare e proiezioni del nervo. Interazioni tra queste cellule adiposo residenti hanno pronunciato effetti sul tessuto adiposo e organismal fisiologia e patofisiologia¹. Anche se gli studi emergenti hanno dipanato importanti meccanismi molecolari alla base di determinate interazioni, una comprensione più completa richiede affidabile analisi strutturale del tessuto intero in tre dimensioni (3D).

Nostra attuale conoscenza della morfologia del tessuto adiposo è in gran parte basata sull'analisi istologica di sezioni sottili (5 μm) con formazione immagine relativamente ad alto ingrandimento (più di 10 volte)^2,3. Tuttavia, questo approccio presenta diverse limitazioni significative. Prime, intricate strutture filamentose quali nervi simpatici e il sistema vascolare, che sono conosciuti per svolgere un ruolo importante nella funzione adiposa^4,5,6,7, sono difficili da valutare attraverso sezioni sottili. In secondo luogo, grazie alla sua forma apparentemente amorfo e la mancanza di unità strutturali rappresentativi di concentrarsi su, è difficile apprezzare il tessuto adiposo strutture basate solo sulla sezione macchiatura. In terzo luogo, il tessuto adiposo ha un contenuto di lipidi molto alta, la creazione di sfide nell'ottenere sezioni di serie coerente che sono adatte per 3D ricostruzione anatomica, un metodo convenzionale utilizzato per studiare il cervello intero morfologia⁸. Considerati questi fattori, c'è un grande bisogno di un approccio di intero-monta che può fornire una visualizzazione 3D di un intero deposito adiposo ottenendo ancora cellulare ad alta risoluzione.

Imaging 3D volumetrico di un intero organo è impegnativo a causa degli effetti di oscuramento della dispersione della luce. Delle principali fonti di dispersione della luce nei tessuti biologici proviene da interfacce del lipido-acquosa. Anche se gli sforzi per eliminare dispersione rimuovendo i lipidi sono in corso da oltre un secolo, ci sono stati un gran numero di recenti innovazioni⁹. Un tale metodo di recente sviluppato del tessuto-schiarimento è abilitato immunolabeling imaging 3D degli organi solvente-deselezionata (iDISCO / iDISCO +)^10,11. Tuttavia, il tessuto adiposo presenta una sfida particolare, data il suo alto livello di lipidi e di conseguenza, ulteriori modifiche per il iDISCO / iDISCO + protocollo sono necessaria per estrarre completamente i lipidi, proteggendo il tessuto dal collasso. Il protocollo modificato che abbiamo sviluppato, ora chiamato Adipo-Clear, impiega basate su metanolo/diclorometano delipidizzazione del tessuto adiposo per ottenere trasparenza ottima per imaging volumetrico ad alta risoluzione¹². Perché la delipidizzazione passo in gran parte placa in modo endogeno espresse proteine fluorescenti come GFP e RFP, visualizzazione di tali proteine dovrà essere raggiunti da immunolabeling. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare organizzazione di livello del tessuto delle cellule adiposo-residente, l'analisi di lignaggio di cellule progenitrici degli adipociti e adiposa morfogenesi durante lo sviluppo.

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Protocollo

Sperimentazione e cura degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal comitato di utilizzo presso la Rockefeller University e istituti di cura degli animali.

1. tessuto preparazione

1. Eseguire standard perfusione intracardiaca con ~ 20 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS) a 4 ° C fino a quando il sangue viene completamente rimosso dal tessuto.
2. Passare il perfusato ~ 20 mL di soluzione fissante (4% paraformaldeide (PFA) in PBS 1X) a 4 ° C fino a quando il collo e la coda sono notevolmente irrigidito.
   Attenzione: PFA è tossico. Evitare il contatto con pelle, occhi e mucose. Soluzioni dovrebbero essere fatto all'interno di una cappa aspirante.
3. Sezionare i rilievi grassi di interesse attentamente per rimuovere il cuscinetto di grasso intero senza danneggiarlo. Utilizzare forcipe smussato-conclusa per evitare di pizzicare o comprimendo il tessuto. Evitare di contaminare il tessuto dissecato con qualsiasi pelliccia.
4. Post-fissare il tessuto in 4% PFA in PBS 1X durante la notte a 4 ° C. Per ogni rilievo grasso, post-fissare con ~ 10 mL di soluzione di fissazione in una provetta conica da 15 mL.
5. Lavare il tessuto 3 volte (1 h ciascuna) con 1x PBS a temperatura ambiente (TA).
6. Conservare il tessuto per a breve termine (fino a 2 settimane) in PBS 1X a 4 ° C e al riparo dalla luce. Per l'archiviazione a lungo termine (ad es., 1-2 anni), passare il buffer 1X PBS sodio azide 0.05% (come conservante).
   Attenzione: La sodio azide è altamente tossica se ingerito per via orale o assorbito attraverso la pelle. Concentrato di soluzioni (almeno 5% o superiore) devono essere gestite sotto una cappa di sodio azide.

2. delipidizzazione e permeabilizzazione

Timing: 1-2 giorni

1. Preparare il 20%, 40%, 60% e 80% di pendenza metanolo con B1n buffer (tabella 1) (v/v), ad esempio, per il 20% metanolo/B1n buffer, mescolare 20 mL di metanolo e 80 mL di tampone B1n. Memorizzare tutti i buffer a 4 ° C. Cristalli di glicina precipiterà dal buffer di metanolo/B1n 60% e 80% a causa della saturazione. Evitare di rimuovere i cristalli; utilizzare la soluzione liquida per i seguenti lavaggi.
   Attenzione: Il metanolo è volatile, irritante ed infiammabile. Evitare il contatto di occhio e pelle.
2. Rimuovere delicatamente i capelli dal campione sotto un microscopio di dissezione. Tutti i capelli, pelucchi o detriti attaccato al campione causerà ombre durante la formazione immagine. Trasferire il campione pulito in una nuova provetta.
3. Eseguire tutti i passaggi seguenti in ghiaccio o a 4 ° C se non diversamente indicato. Per i piccoli campioni (ad es., posteriore cuscinetti adiposi sottocutanei/perigonadal da giovani topi magri), è possibile utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1,6 mL della soluzione. Per campioni di grandi dimensioni o campioni con un contenuto lipidico elevato (ad es., cuscinetti adiposi da topi obesi), è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione.
   1. Disporre le provette contenenti i campioni orizzontalmente su agitatore orbitale a ~ 100 giri/min. Assicurarsi che i campioni possono muoversi liberamente all'interno del tubo.
4. Disidratare il campione in una serie graduata di 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanolo/B1n tampone per il tempo indicato (tabella 2). Ridurre al minimo la soluzione di riporto.
5. Delipidate il campione con 100% diclorometano (DCM) (3 volte), ciascuno con il tempo di incubazione indicato nella tabella 2. Il campione dovrebbe affondare sul fondo del tubo all'estremità dei lavaggi DCM secondo e terzi. Se non, estendere il tempo di incubazione per garantire delipidizzazione completo (ad esempio, si estendono da 30 min a 1-2 h).
   Attenzione: DCM dovrebbe essere gestito all'interno di una cappa aspirante. Utilizzare contenitori di vetro per deposito e microcentrifuga tubi che sono realizzati in polipropilene per le incubazioni. La microcentrifuga non dovrebbe essere utilizzato per l'archiviazione a lungo termine di DCM. Capsule di Petri e pipette sierologiche che sono realizzati in polistirene non sono compatibili con DCM. DCM è altamente volatile. Trasferire il campione nella soluzione fresca rapidamente per evitare la disidratazione.
6. Lavare due volte con 100% di metanolo per il tempo indicato (tabella 2).
7. Opzionale: Se il campione non è ben irrorato, il colore dell'emoglobina dai globuli rossi restanti potrebbe causare forte autofluorescenza. Candeggiare con 5% H₂O₂ in metanolo (1 volume di 30% H₂O₂ fino a 5 volumi di metanolo) durante la notte a 4 ° C.
8. Reidratare il campione in una serie di buffer di metanolo/B1n invertita: 80%, 60%, 40%, 20% metanolo/B1n e 100% B1n tampone (2 volte) per il tempo indicato (tabella 2).
9. Lavare il campione con un tampone di PTxwH (tabella 1) per 2 h a TA.
10. Conservare il campione di delipidated nel buffer di PTxwH a 4° C (fino a 1 anno) o procedere immediatamente con il passaggio di immunostaining.

3. l'intero Monte Immunostaining

Timing: 8-10 giorni

Nota: Tutti i passaggi seguenti dovrebbero essere eseguiti presso RT se non diversamente indicato, con agitazione e protezione dalla luce. Per i piccoli campioni, utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1.6 mL di soluzione. Per campioni di grandi dimensioni, è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione. Si consiglia di convalidare prima gli anticorpi su piccoli pezzi di tessuti o sezioni di tessuto metanolo-trattati.

1. Diluire l'anticorpo primario nel buffer di PTxwH per la concentrazione consigliata. Centrifugare la soluzione di anticorpo diluito a ~ 20.000 x g per 10 min impedire l'introduzione dell'anticorpo precipitati o aggregazioni.
2. Incubare il campione di delipidated con la soluzione di anticorpo primario per il tempo indicato (tabella 2).
3. Lavare il campione con il tampone di PTxwH in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2h, 4h e pernottamento.
4. Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di PTxwH per la concentrazione consigliata. Centrifugare la soluzione di anticorpo diluito a ~ 20.000 x g per 10 min impedire l'introduzione dell'anticorpo precipitati o aggregazioni.
   Nota: Per evitare l'alta priorità bassa causata da tessuto autofluorescenza, anticorpi secondari coniugati con fluorofori che emettono luce nelle regioni rosse e da' raccomanda. A seconda del numero di linee laser disponibili su un microscopio, fino a 3-4 marcatori possa essere imaged simultaneamente in un campione.
5. Incubare il campione con la soluzione di anticorpo secondario per il tempo indicato (tabella 2).
6. Esempio di lavare con buffer di PTxwH in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1 h, 2h, 4h e pernottamento.
7. Facoltativo: Per i tipi di tessuto che sono fragili, fissare il tessuto macchiato con 4% PFA in 1X PBS durante la notte a 4 ° C per aiutare a preservare la morfologia del tessuto.
   Nota: Questo passaggio può aumentare la formazione immagine di sfondo. Non è necessario eseguire questo passaggio per il tessuto adiposo.
8. Lavare il campione con PBS 1X in una serie di fasi di incubazione: 5 min, 10 min e 30 min.
9. Rimuovere delicatamente il panno dal campione sotto un microscopio di dissezione.

4. tessuto schiarimento

Timing: 1-2 giorni

1. Opzionale: Incorporare il campione in agarosio per facilitare il montaggio del campione per microscopia luce-foglio.
   Nota: Questo passaggio è fortemente consigliato per il tessuto adiposo stabilizzare la sua forma durante la formazione immagine.
   1. Preparare la soluzione di incasso con 1% di agarosio in 1X PBS (w/v). Raffreddare la soluzione incorporamento a ~ 40 ° C per evitare di esporre il campione ad un calore eccessivo.
   2. Posizionare il campione pulito in uno stampo (per esempio, capsula di Petri o barca di pesatura) e disporlo nella posizione desiderata. Evitare qualsiasi residuo liquido. Delicatamente e versare la soluzione incorporamento sopra il campione. Evitare eventuali bolle d'aria.
   3. Lasciate che l'agarosio solidificare completamente alla RT. Cut un blocco contenente il campione.
      Nota: Tutti i passaggi seguenti, tra cui le incubazioni overnight dovrebbe essere eseguiti alla RT, con agitazione e protezione dalla luce. Per i piccoli campioni, utilizzare provette microcentrifuga da 2 mL con 1.6 mL di soluzione. Per campioni di grandi dimensioni, è possibile utilizzare provette da 5 mL con 4 mL di soluzione.
2. Disidratare il campione sfumatura di metanolo con H₂o: 25%, 50%, 75% e 100% (3 volte) per il tempo indicato (tabella 2).
   Nota: Il campione può essere lasciato durante la notte presso il passo di 100% di metanolo.
3. Incubare il campione in DCM 100% per 1 h con agitazione (3 volte). Campione dovrebbe affondare sul fondo del tubo alla fine di ogni lavaggio DCM. In caso contrario, estendere il tempo di incubazione per assicurare la completa rimozione del metanolo. Campione può essere lasciato durante la notte presso il passo di DCM 100%.
4. Incubare il campione in dibenzyl etere (DBE) durante la notte con lieve agitazione per ottenere l'indice di rifrazione di corrispondenza.
   Nota: Esempio finirà per diventare trasparente alla luce visibile.
   Attenzione: DBE è pericoloso. Evitare il contatto con la pelle. Essere gestito all'interno di una cappa aspirante con guanti a doppio strato. Scartare i guanti, non appena fosse stato contaminato da DBE. Utilizzare contenitori di vetro per tubi deposito e microcentrifuga (polipropilene) per le incubazioni. La microcentrifuga non dovrebbe essere utilizzato per l'archiviazione a lungo termine di DBE. Capsule di Petri e pipette sierologiche che sono realizzati in polistirene non sono compatibili con DBE. Pulire qualsiasi fuoriuscita con etanolo al 100%.
5. Incubare il campione con DBE fresco con lieve agitazione per 2 h. Store il campione a temperatura ambiente al buio o procedere direttamente all'imaging.
   Nota: I campioni sono raccomandati per essere imaged entro un mese. Anche se alcuni fluorofori sono più stabili rispetto ad altri, stoccaggio a lungo termine dei campioni in questa fase non è raccomandato.

5. microscopia

1. Imaging con un microscopio di luce-foglio che è compatibile con DBE.
   Nota: Solo gli obiettivi che sono approvati per l'imaging di solvente organico e abbinati con l'indice di rifrazione di DBE utilizzabile come immersione obiettivi nell'imaging DBE-immerso.
   1. Montare il campione dell'agarosi-incastonato su un supporto che possa impedire il movimento durante la formazione immagine. Immergere il campione in una camera piena di DBE.
   2. Raccogliere uno z-stack che copre la totalità del campione (ad es., ingrandimenti di 1-2) per ottenere tutto-tessuto distribuzione/struttura del marcatore di interesse.
   3. Passare a un obiettivo con ingrandimento maggiore (ad es., ingrandimento X 4-12) per ingrandire le regioni di interesse all'immagine dettagliata strutture.
      Nota: Il collagene è un contributore importante alla matrice extracellulare del tessuto adiposo, che circonda tutte le cellule di grasso¹³. Il collagene ha un tipico spettro di emissione che vanno circa 400 nm a 550 nm¹⁴. Il campione con la linea di 488 laser (verde) di imaging e raccogliendo la luce emessa ad una gamma di lunghezza d'onda che si trova all'interno dello spettro di emissione del collagene (ad es., 525-550 nm) fornirà il segnale di autofluorescenza del tessuto, che precedentemente è stato indicato per delineare il contorno delle cellule grasse e complessivo tessuto architettura¹².
2. Imaging con un invertito confocale o un microscopio a due fotoni.
   1. Inserire l'esempio dell'agarosi-incorporato in una diapositiva di camera con un fondo di vetro senza toccare le parti in plastica (o altra camera imaging DBE-compatibile che può sigillare). Assicurarsi di che DBE non fuoriuscire.
   2. Scegliere gli obiettivi con distanze di lavoro più a lungo per ottenere una penetrazione più profonda.
      Nota: La formazione immagine dovrebbe essere fatto con un microscopio invertito confocale o due fotoni attraverso il fondo di vetro della diapositiva da camera. Evitare il contatto diretto tra il campione e obiettivi che non sono suggeriti per acquisizione di immagini basata su DBE di immersione.

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Risultati

Adipo-Clear preparato intero grasso pastiglie possono essere imaged in 3D per analizzare come interazioni cellulari e morfologia del tessuto sono interessate negli stati magri ed obesi. Questo metodo può essere applicato facilmente per analizzare la struttura adiposa generale raccogliendo il segnale di autofluorescenza del tessuto nel canale verde. Precedentemente abbiamo indicato che l'autofluorescenza segnale in overlay adiposo favorevolmente con perilipina macchiatura, un indicatore c...

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Discussione

Adipo-Clear è un metodo semplice e robusto per l'eliminazione del tessuto adiposo, che può essere facilmente eseguito in una configurazione di laboratorio regolari. In confronto ad altri metodi di schiarimento solvente come iDISCO / iDISCO +^10,11,12, Adipo-Clear è particolarmente ottimizzata per la rimozione del tessuto adiposo e altri tessuti con alto contenuto di grassi. Il passo di delipidizzazione rimuove completamente i ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparin	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270991
Hydrogen peroxide 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzyl ether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Sodium azide	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 dilution
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1	R&D Systems	AF3628	Final concentration of 2 µg/mL
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Final concentration of 2 µg/mL
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Final concentration of 5-10 µg/mL
Imaging chamber	ibidi	80287
Light sheet microscope	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Imaging software	LaVision BioTec	Imspector software
Microscopy visualization software	Bitplane	Imaris