Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

Riepilogo

Qui, presentiamo i protocolli per l'utilizzazione del insetto cella e baculovirus proteina espressione sistema per produrre grandi quantità di proteine vegetali secernuta per cristallizzazione della proteina. Un vettore di espressione di baculovirus è stato modificato con GP67 o insetto hemolin peptide di segnale per espressione di secrezione della proteina vegetale in cellule di insetto.

Abstract

È stata una sfida per gli scienziati di esprimere proteine eucariotiche secretive ricombinanti per studi strutturali e biochimiche. Il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto è uno dei sistemi utilizzati per esprimere proteine secretorie eucariotiche ricombinante con alcune modificazioni post-traduzionali. Le proteine secretorie devono essere instradati attraverso le vie secretive per glicosilazione della proteina, la formazione di legami disolfuro e altre modificazioni post-traduzionali. Per migliorare l'espressione delle cellule dell'insetto esistente di proteine secretorie vegetali, un vettore di espressione di baculovirus viene modificato con l'aggiunta di sia un GP67 o una sequenza del peptide segnale hemolin tra il promotore e il multiplo-clonazione siti. Questo sistema di nuova concezione modificate vettoriale prodotto con successo una resa elevata di proteine recettori solubili ricombinante pianta secreta di Arabidopsis thaliana. Due delle proteine espresse pianta, domini extracellulari dei recettori di membrana plasmatica di Arabidopsis TDR e PRK3, sono state cristallizzate per studi cristallografici dei raggi x. Il sistema vector modificate è un strumento migliorato che potenzialmente può essere utilizzato per l'espressione di proteine ricombinanti secretive nel Regno animale pure.

Introduzione

È indispensabile per un laboratorio di ricerca essere in grado di produrre grandi quantità di proteine ricombinanti omogenei per le caratterizzazioni biochimiche e biofisiche, soprattutto per studi cristallografici dei raggi x. Ci sono molti sistemi di espressione eterologa affermati quali Escherichia coli, lieviti, cellule di insetto, cellule di mammifero, cellule vegetali, ecc tra loro, il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto è uno dei più comunemente utilizzato tecniche per produrre grandi quantità di proteine eucariotiche ricombinanti grandi strutturalmente piegate per proteina cristallizzazione¹.

I vettori di espressione del sistema di espressione di baculovirus sono progettati per contenere una forte polyhedrin o promotore di P10 per produrre un rendimento elevato di proteine intracellulari ricombinanti^2,3. Per rendere un baculovirus ricombinanti, il gene di interesse è clonato in un insetto vettore contenente il locus polyhedrin (polh) del genoma di multi-nucleopolyhedroviral Autographa californica . Il costrutto risultante è quindi sequenziato e verificato il suo telaio di lettura aperto corretta (ORF). Il costrutto corretto è quindi introdotto nella cellula ospite dell'insetto attraverso il processo di trasfezione. Il gene di interesse viene inserito nel genoma virale di ricombinazione omologa. Questo evento provoca la produzione del genoma virale ricombinante, che poi replicati per produrre ricombinante germogliato virus particelle¹.

Le cellule di insetto che sono più comunemente utilizzate nel sistema di espressione sono Sf9 e alta cinque celle (Hi5). SF9 cellule sono un isolato clonale di Sf21, derivati dalle cellule ovariche pupale di Spodoptera frugiperda, e Hi5 cellule sono un isolato clonale derivato da parentale Trichoplusia ni ovarico delle cellule linea TN-368^4,5. Co-transfezioni, amplificazione di virus e le analisi di placca sono condotto su cellule Sf9, mentre le cellule Hi5 in genere sono selezionate per produrre maggiori quantità di proteine ricombinanti⁶. Vale la pena notare che le cellule di Hi5 non sono adatte per la generazione e l'amplificazione della progenie di virus a causa della loro tendenza a produrre virus mutante. Tradizionalmente, una gamma di temperatura di 25-30 ° C è considerata di essere buono per la coltivazione di cellule di insetto. Tuttavia, è stato segnalato che il 27-28 ° C è la temperatura ottimale per l'insetto cella crescita e infezione^7,8.

L'introduzione di una sequenza di segnale forte precede il gene è necessario per l'alta espressione di proteine secrete. La sequenza del segnale in modo efficiente guiderebbe la proteina ricombinante tradotta in reticolo endoplasmico per la secrezione della proteina e modificazioni post-traduzionali necessarie per il corretto ripiegamento e stabilizzazione³. Sequenze di peptide segnale, come il baculovirus avvolgono proteina GP64/67, honeybee melittin e altri, sono stati scelti per facilitare l'espressione di proteine ricombinanti secretive in baculovirus-mediata espressione sistemi³. L'introduzione del peptide segnale di GP67 ha dimostrato di migliorare la resa di espressione di una proteina ricombinante secreta, in confronto con il peptide di segnale intrinseco del gene bersaglio⁹. Hemolin è una proteina di emolinfa della falena gigante seta Hyalophora cecropia, indotta a seguito di infezione di batteri¹⁰. A causa del relativamente alto livello di espressione indotta, la sequenza del peptide di segnale del gene utilizzabile per mediare l'espressione di secrezione delle proteine ricombinanti nel sistema di cellule di insetto baculovirus.

Il a. thaliana Tracheary elemento di differenziazione inibitorio fattore recettore (TDR) e polline del ricevitore della chinasi 3 (PRK3) entrambi appartengono alla famiglia pianta Leucine-rich Repeat Kinase Receptor-like (LRR-RLK) di proteine^11,12 . Al fine di studiare la struttura e la funzione di questa famiglia di recettori proteine vegetali, nonché per facilitare la caratterizzazione biochimica e strutturale di altre proteine vegetali secernuta, il sistema di espressione di baculovirus-insetto cella è stato modificato per migliorare la resa di qualità e produzione di proteina. I domini extracellulari di TDR e di PRK3 sono state espresse con successo utilizzando due vettori di espressione modificata nel sistema di espressione di baculovirus-insetto cellule. Entrambi i domini extracellulari delle proteine TDR e PRK3 sono stati cristallizzati. Questo articolo segnala l'espressione e purificazione di grandi quantità di proteine ricombinanti vegetali secrete con vettori di espressione di baculovirus modificate due incorporando un GP67 o una sequenza di segnale hemolin tra il promotore e clonazione più siti.

Protocollo

Nota: Viene utilizzato un sistema di insetto cella/baculovirus con vettori di espressione modificate per l'espressione della proteina secretoria pianta e cristallizzazione.

1. modifica di un vettore di espressione di Baculovirus con il Peptide di segnale GP67 per espressione di secrezione della proteina vegetale

1. Sintetizzare un frammento di DNA contenente un 5' BglII taglio sito¹³, la sequenza di segnale di secrezione GP67 e un sito multi-clonazione con NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI e XhoI (Figura 1A).
   Nota: Poiché sia BglII e BamHI digerito DNA ha provocato la stessa estremità adesive, il vettore linearizzato può legare per il frammento di DNA digerito, mentre BglII sia BamHI siti nella sequenza di legatura ricotto saranno mutati ad una sequenza che non è spaccabili da BglII o BamHI¹⁴.
2. Digest 4 µ g di DNA con BglII e XhoI e 4 µ g di un vettore di espressione del DNA con BamHI e XhoI¹⁴. Mescolare 10 unità di ciascun enzima di restrizione con il DNA in un 1 x concentrazione tampone di reazione (acetato di potassio 50 mM, 20 mM Tris-acetato, acetato di magnesio 10 mM e 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 a 25 ° C) e incubare la miscela a 37 ° C per 4 h.
   1. Purificare il frammento di DNA asportato e il vettore linearizzato DNA da un DNA estrazione gel kit¹⁵.
3. Mix 100 ng del vettore linearizzato DNA con 400 ng di DNA digerito frammento in una miscela di reazione di legatura 10-µ l contenente 1x tampone di reazione T4 DNA ligasi (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl₂, ATP di 1 mM e 10 mM DTT, pH 7.5 a 25 ° C) e 5 unità di T4 DNA ligasi. Incubare la miscela di reazione a 16 ° C per 16 h.
4. Trasformare 5 µ l di miscela la legatura in 100 µ l di cellule competenti DH5α seguendo un protocollo standard di trasformazione e selezionare le colonie risultante su una piastra di agar ampicillina-LB¹⁶. Prendere 5-10 colonie e crescere ogni colonia in 2 mL di terreno LB contenente 100 ampicillina µ g/mL a 220 giri/min e 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 16 h.
5. Estrarre ogni DNA plasmidico con un DNA miniprep kit¹⁷ e confermare i cloni di sequenziamento del DNA con un primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
6. PCR-amplificare il gene TDR di a. thaliana frammento codifica residui 30-642 da un gene sintetico TDR costruire (forward primer: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, reverse primer: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Amplificare il DNA per 30 cicli in un buffer di reazione della polimerasi del DNA che contiene una miscela del dNTP 0,5 mM, 0,2 µ m di primer, 0.1 µ g di DNA campione, 0,4 mM MgCl₂e 1 unità di reazione della polimerasi del DNA.
   1. Per i passaggi del ciclo PCR, impostare la denaturazione iniziale a 95 ° C per 30 s e poi 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s, ricottura a 55 ° C per 30 s e l'estensione a 72 ° C per 1 min, con un'estensione finale a 72 ° C per 5 min.
7. Digerire il frammento della PCR sia il vettore modificato con gli enzimi di endonucleasi di restrizione NotI e BamHI. Legare il frammento genico con il vettore linearizzato. Mix 100 ng del vettore linearizzato DNA con 400 ng di DNA digerito frammento in una miscela di reazione di legatura 10-µ l contenente tampone di reazione di T4 DNA ligasi e 5 unità di T4 DNA ligasi. Incubare la miscela di reazione a 16 ° C per 16 h.
8. Trasformare 5 µ l di miscela la legatura in 100 µ l di cellule competenti DH5α seguendo un protocollo standard di trasformazione e selezionare le colonie risultante su una piastra di agar ampicillina-LB¹⁶. Confermare il corretti cloni di sequenziamento del DNA.

2. modifica di un vettore di espressione di Baculovirus con il Peptide di segnale Hemolin insetto per espressione di secrezione della proteina vegetale

1. Sintetizzare un frammento di DNA contenente un 5' BglII taglio sito¹³, la sequenza di segnale di secrezione dell'insetto hemolin e un sito multi-clonazione con NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI e XhoI (Figura 1B).
2. Digest 4 µ g di DNA con BglII e XhoI e 4 µ g di un vettore di espressione del DNA con BamHI e XhoI¹⁴. Mescolare 10 unità di ciascun enzima di restrizione con il DNA in un 1 x concentrazione tampone di reazione (acetato di potassio 50 mM, 20 mM Tris-acetato, acetato di magnesio 10 mM e 100 µ g/mL BSA, pH 7.9 a 25 ° C) e incubare la miscela a 37 ° C per 4 h.
   1. Purificare il frammento di DNA asportato e il vettore linearizzato DNA da un DNA estrazione gel kit¹⁵.
3. Mix 100 ng del vettore linearizzato DNA con 400 ng di DNA digerito frammento in una miscela di reazione di legatura 10-µ l contenente 1x tampone di reazione T4 DNA ligasi (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl₂, ATP di 1 mM e 10 mM DTT, pH 7.5 a 25 ° C) e 5 unità di T4 DNA ligasi. Incubare la miscela di reazione a 16 ° C per 16 h.
4. Trasformare 5 µ l di miscela la legatura in 100 µ l di cellule competenti DH5α e selezionare le colonie su una piastra di agar di ampicillina-LB. Prendere 5-10 colonie e crescere ogni colonia in un medium LB 2 mL contenente 100 µ g/mL di ampicillina a 220 giri/min e 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 16 h.
5. Estrarre il DNA plasmidico con un DNA miniprep kit¹⁷ e confermare i cloni di sequenziamento del DNA con un primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
6. PCR-amplificare a. thaliana polline del ricevitore della chinasi 3 (PRK3) gene frammento di codifica residui 20-237 da una costruzione di gene PRK3 sintetica (forward primer: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, reverse primer: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Amplificare il DNA per 30 cicli in un buffer di reazione della polimerasi del DNA che contiene una miscela del dNTP 0,5 mM, 0,2 µ m di primer, 0.1 µ g di DNA campione, 0,4 mM MgCl₂e 1 unità di reazione della polimerasi del DNA.
   1. Per i passaggi del ciclo PCR, impostare la denaturazione iniziale a 95 ° C per 30 s e poi 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 30 s, ricottura a 55 ° C per 30 s e l'estensione a 72 ° C per 30 s all'interno di ogni ciclo e l'estensione finale a 72 ° C per 5 min.
7. Digerire il frammento della PCR sia il vettore modificato con gli enzimi di endonucleasi di restrizione NotI e BamHI. Legare il frammento genico con il vettore linearizzato. Mix 100 ng del vettore linearizzato DNA con 400 ng di DNA digerito frammento in una miscela di reazione di legatura 10-µ l contenente tampone di reazione di T4 DNA ligasi e 5 unità di T4 DNA ligasi. Incubare la miscela di reazione a 16 ° C per 16 h.
8. Trasformare 5 µ l di miscela la legatura in 100 µ l di cellule competenti DH5α seguendo un protocollo standard di trasformazione e selezionare le colonie risultante su una piastra di agar ampicillina-LB¹⁶. Confermare il corretti cloni di sequenziamento del DNA.

3. produzione e amplificazione di Baculovirus costruisce Harboring la cassetta di espressione di proteine ricombinanti

1. Uso 100 ng di plasmide costrutto per trasformare 40 µ l di cellule competenti di DH10Bac seguendo il protocollo del baculovirus espressione sistema¹. Incubare le piastre di trasformazione a 37 ° C per 48 h.
2. Prendi due colonie bianchi da ogni piatto di trasformazione, inoculare ogni colonia in 2 mL di terreno LB contenente kanamicina di 50 µ g/mL, 7 µ g/mL Gentamicina e la tetraciclina di 10 µ g/mL. Seguire il protocollo del baculovirus espressione sistema¹ per estrarre e verificare la bacmid del DNA. Aliquotare ogni DNA in due tubi con 20 µ l ciascuna e conservare i capillari a-20 ° C.
   Nota: Le operazioni seguenti richiedono un'operazione asettica.
3. Crescere un monostrato di cellule Sf9 in terreni di coltura con 10% siero bovino fetale (FBS) e 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL) antibiotici penicillina-streptomicina a 27 ° C a 80% confluenza in una piastra a 6 pozzetti. Una stima della percentuale di confluenza sulla base della percentuale di area coperta sulla piastra di coltura del tessuto.
4. Preparare le seguenti soluzioni in due provette da 1,5 mL sterile.
   1. Filmato 1: Per ogni trasfezione, diluire 20 µ l di bacmid DNA in 100 µ l di terreno di coltura cellulare Sf9 senza aggiunte senza antibiotici. Mescolare delicatamente la diluizione, spostando il lato del tubo.
   2. Filmato 2: Per ogni trasfezione, diluire 8 µ l di reagente di transfezione di lipidi in 100 µ l di terreno di coltura cellulare Sf9 senza aggiunte senza antibiotici. Mescolare accuratamente la diluizione pipettando su e giù per 6 x.
5. Combinare le due soluzioni, mescolarle delicatamente pipettando lentamente su e giù per 3 volte e li Incubare per 20-40 min a temperatura ambiente.
6. Lavare ogni pozzetto di strato monomolecolare Sf9 cellule 2x con 3 mL di terreno di coltura cellulare Sf9 senza aggiunte senza antibiotici. Per ogni trasfezione, aggiungere 0,8 mL di mezzo di coltura cellulare Sf9 senza aggiunte senza antibiotici in ogni provetta contenente la miscela di lipidi-DNA. Mescolare delicatamente il contenuto delle provette pipettando lentamente su e giù per 3 volte. Aspirare i media di lavaggio dalle piastre e i campioni con la miscela di transfezione di sovrapposizione.
7. Dopo l'aggiunta della miscela di transfezione, incubare la piastra trasfettata per 5 ore a 27 ° C. Sostituire il supporto di transfezione con il mezzo di coltura cellulare Sf9 completo contenente 10% FBS e 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL) antibiotici penicillina-streptomicina. Incubare la piastra trasfettata a 27 ° C per 4 d.
8. Raccogliere e amplificare il baculovirus ricombinanti.
   1. Raccogliere il surnatante della piastra infetto in una provetta conica sterile di 15 mL dopo 4D di incubazione. Girare il supernatante a 1010 x g per 5 min rimuovere i detriti cellulari. Scartare il pellet e decantare il supernatante in una provetta pulita e conservarla a 4 ° C fino a 1 anno.
      Nota: Questo è il virus di P0. Può essere aliquotati e conservati a-80 ° C per un periodo di tempo più lungo.
   2. Per amplificare ogni virus ricombinante, crescere un monostrato di cellule Sf9 su una zolla di 150 mm fino a 80% confluenza. Aspirare i media dalla piastra, aggiungere 2 mL di virus P0 per l'aderente di cellule alla piastra e incubare la piastra per 1h in un'incubatrice di 27 ° C. Per mescolare il mezzo con le cellule della roccia la piastra ogni 15 min.
      1. Aggiungere 25 mL di media di Grace completo contenente 10% FBS e 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL) antibiotici penicillina-streptomicina. Incubare la piastra per 3 d in un'incubatrice di 27 ° C per ottenere il virus di passaggio P1.
   3. Raccogliere il surnatante della piastra infetto in una provetta conica sterile da 50 mL e spin a 1010 x g per 5 min rimuovere i detriti cellulari. Decantare il supernatante in una provetta pulita e conservarla a 4 ° C fino a 1 anno.
      Nota: Il virus P1 può essere aliquotati e conservati a-80 ° C per un periodo di tempo più lungo.
   4. Per amplificare il virus da P1 a P2 passaggio, crescere un monostrato di cellule Sf9 su una zolla di 150 mm fino a 90% confluenza, aspirare il supporto della piastra, aggiungere 2 mL di virus P1 alla piastra e incubare per 1 h in un'incubatrice di 27 ° C.
   5. Ripetere i passaggi da 3.8.2 e 3.8.3 per ottenere i passaggi P2 e P3 dei virus. Non conservare il virus P3 per più di 2 mesi.

4. protein Expression, purificazione con NiNTA e cristallizzazione

1. Coltura in 1 L di cellule di insetto Hi5 in terreni di coltura con 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL) antibiotici penicillina-streptomicina ad una densità di 2 x 10⁶ a 100 giri/min in uno shaker incubatore di 27 ° C. Rotazione verso il basso le cellule a 570 x g per 5 min, decantare il supernatante, risospendere le cellule in 20 mL di recente prodotte P3 virus e tenerlo a temperatura ambiente per 1 h. Agitare delicatamente la bottiglia di spin per risospendere le cellule 1 x ogni 15 min.
2. Trasferire le cellule a 1 L di antibiotici penicillina-streptomicina cultura media con 100 µ g/mL (o 100 I.U./mL), coltura le cellule a 100 giri/min in uno shaker incubatore di 27 ° C per 72 h. Spin giù le cellule a 1.010 x g per 5 min e raccogliere il surnatante.
3. Strisce indicatrici di pH di uso regolare il pH del surnatante a 8.0 aggiungendo 0.1 M HCl o NaOH M 0.1 e aggiungere buffer di associazione ad una concentrazione finale, contenente 20 mM di tampone Tris pH 8.0, NaCl 100 mM e imidazolo di 5 mM. Aggiungere una certa quantità di resina NiNTA (10-40 mL) basata sul rendimento stimato della proteina ricombinante His-tag espressa.
   1. Miscelare la soluzione su scalpore magnetico con bassa velocità a 4 ° C per 1 h. lavare la resina ed eluire la proteina associata seguendo la norma NiNTA purificazione protocollo¹⁸.
4. Sottoporre la proteina purificata a scambio ionico e gel cromatografia di filtrazione, così come altri metodi di purificazione di proteine, per ottenere un campione omogeneo.
   Nota: Per il ectodomain TDR, 20 mM Tris, pH 8, NaCl 100 mM sono stati usati come buffer di gel filtrazione. Per il ectodomain di PRK3, 20 mM bis-Tris, pH 6, NaCl 100 mM sono stati usati come il buffer di comodo gel filtrazione.

Risultati

Come illustrato nella Figura 1, due vettori di espressione del baculovirus pFastBac1 modificate sono stati utilizzati per esprimere le proteine secrete con la GP67 o la sequenza segnale hemolin per sostituire la sequenza segnale intrinseco del gene target. il GP67 virale ed i geni di hemolin dell'insetto sono stati dimostrati per avere i livelli di espressione di alta secrezione nelle cellule. Proteine di fusione con uno di questi due sequenze di segnale si p...

Discussione

L'eterogeneità nella dimensione e nella stabilità delle migliaia di proteine presenti nei sistemi biologici, è spesso empirico per una ricerca di laboratorio per decidere quale sistema di espressione eterologa deve essere scelto per l'espressione di una proteina specifica. Il sistema di espressione di e. coli è spesso la prima scelta per l'espressione della proteina a causa del breve ciclo di vita dei batteri, basso costi dei terreni di coltura e relativa facilità di scalare fino¹⁹. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator shaker	VWR	Model Excella E25	27 oC
Incubator	VWR	Model 2005	27 oC
Centrifuge	BECKMAN	Model J-6	with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600677-51	For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler	BIO-RAD	Model C1000 Touch	For PCR amplification of DNA
Incubator shaker	New Brunswick Scientific	Model I 24	For growing baceria culture
Customer DNA synthesis	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Restriction Endonuclease
BglII	New England Biolabs	R0144S	Restriction Endonuclease
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restriction Endonuclease
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202T	DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose	Thermo Fisher Scientific	15510-019	For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell	Invitrogen	18-258-012	For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibiotics
Tetracycline	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibiotics
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells	Thermo Fisher Scientific	10361-012	For making bacmid DNA
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362-101	Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System	Thermo Fisher Scientific	10359-016	Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Baculorirus expression vector
Sf9 cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 monolayer cells
Hi5 cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM	Thermo Fisher Scientific	10486025	Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
FBS Certified	Thermo Fisher Scientific	16000-044	500 ml
6-well plates	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B	Flat-bottom
150 mm plates	Thermo Fisher Scientific	353025	100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	1415-2500	500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1475-0511	25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes	USA Scientific	1500-1211	25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA resin
pH-indicator strips	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14