Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per fabbricare un rene corteccia extracellulare derivata matrice idrogel per mantenere la composizione strutturale e biochimica del rene nativo di matrice extracellulare (ECM). Il processo di fabbricazione e le sue applicazioni sono descritte. Infine, una prospettiva sull'utilizzo questo idrogel per supportare la bioingegneria e la rigenerazione cellulare e tessutale del rene-specifici è discussa.

Abstract

Matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti segnali biochimici e biofisici per mantenere l'omeostasi del tessuto. Corrente idrogel sintetico offrono robusto supporto meccanico per in vitro colture cellulari ma manca la composizione proteica e ligando necessaria per suscitare fisiologico comportamento dalle cellule. Questo manoscritto descrive un metodo di fabbricazione per un rene corteccia ECM-derivato idrogel con adeguata robustezza meccanica e solidale composizione biochimica. L'idrogel è realizzato meccanicamente omogeneizzazione e solubilizzanti corteccia del rene umano decellularizzati ECM. La matrice mantiene rapporti di proteina di Natale del rene corteccia ECM consentendo anche gelificazione a rigidità meccanica fisiologica. L'idrogel funge da un substrato su cui rene cellule derivate da corteccia possono essere mantenute in condizioni fisiologiche. Inoltre, la composizione di idrogel possa essere manipolata per modellare un ambiente malato che consente lo studio futuro di malattie renali.

Introduzione

Matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti segnali biochimici e biofisici per mantenere l'omeostasi del tessuto. La composizione molecolare complessa disciplina proprietà strutturali e funzionali del tessuto. Proteine strutturali forniscono cellule con consapevolezza spaziale e permettono di adesione e migrazione¹. Associato ligandi interagiscono con recettori di superficie per controllare il comportamento di cella². Rene ECM contiene una miriade di molecole la cui composizione e la struttura varia a seconda della posizione anatomica, fase inerente allo sviluppo e malattia stato^3,4. Ricapitolando la complessità di ECM è un aspetto fondamentale nello Studio in vitrodi cellule derivate dal rene.

I precedenti tentativi di replicare microambienti ECM si sono concentrati sul tessuto decellularizing tutto per creare impalcature in grado di ricellularizzazione. Decellularizzazione è stata eseguita con detergenti chimici come sodio dodecil solfato (SDS) o detergenti non ionici, e utilizza sia organo intero aspersione o immersione e agitazione metodi^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13}. I ponteggi presentati qui preservare gli spunti strutturali e biochimici trovati in tessuto nativo ECM; Inoltre, ricellularizzazione con cellule del donatore-specific ha rilevanza clinica in chirurgia ricostruttiva^{14,15,16,17,18, 19}. Tuttavia, queste impalcature mancano di flessibilità strutturale e pertanto non sono compatibili con molti dispositivi a corrente utilizzati per gli studi in vitro . Per ovviare a questa limitazione, molti gruppi hanno ulteriormente elaborato decellularizzati ECM in idrogel^{20,21,22,23,24}. Questi idrogeli sono compatibili con bioink e stampaggio ad iniezione ed eludere micrometro scala spaziale i vincoli che decellularized ponteggi posto sulle cellule. Inoltre, composizione molecolare e rapporti trovati in nativo ECM vengono mantenuti^3,25. Qui dimostriamo un metodo per fabbricare un idrogel derivato dalla corteccia del rene ECM (kECM).

Lo scopo del presente protocollo è quello di produrre un idrogel che replica il microambiente della regione corticale del rene. Tessuto del rene corteccia è decellularized in una soluzione di SDS 1% sotto costante agitazione per rimuovere la materia cellulare. SDS è comunemente usato per decellularize del tessuto a causa della sua capacità di rimuovere rapidamente immunologici cellulari materiale^6,7,9,26. Il kECM è quindi soggetto a omogeneizzazione meccanica e liofilizzazione^5,6,9,11,26. Solubilizzazione in un acido forte con pepsina si traduce in un finale idrogel soluzione stock^20,27. KECM nativo di proteine che sono importanti per strutturale supportano e segnale di trasduzione sono conservate^3,25. L'idrogel può anche essere gelificato all'interno di un ordine di grandezza di Natale del rene umano corteccia^28,29,30. Questa matrice fornisce un ambiente fisiologico che è stato utilizzato per mantenere la quiescenza delle cellule del rene-specifici rispetto a idrogeli da altre proteine della matrice. Inoltre, composizione di matrice possa essere manipolati, ad esempio, attraverso l'aggiunta di collagene-I, per ambienti di malattia di modello per lo studio della fibrosi renale ed altri malattie di rene^31,32.

Protocollo

Reni umani sono stati isolati da LifeCenter Northwest seguendo linee guida etiche impostate per l'associazione delle organizzazioni di approvvigionamento dell'organo. Questo protocollo segue animale linee guida cultura cura e cella delineate dalla Università di Washington.

1. preparazione del tessuto del rene umano

1. Preparazione della soluzione di decellularizzazione
   1. Sterilizzare un becher da mL 5000 e un ancoretta 70 x 10 mm.
   2. Mescolare 1: 1000 (peso: volume) sodio dodecil solfato (SDS) in acqua deionizzata in autoclave nel becher. Lasciare la soluzione su un piatto di mescolare a circa 200 rpm per 24 ore o fino a quando la SDS è completamente sciolto.
      Nota: In genere, 2500 mL di soluzione 1% SDS è sufficiente per decellularize un singolo rene umano.
   3. Trasferire la soluzione in un filtro vuoto sterile da 500 mL e filtrarlo in contenitori sigillabili sterilizzati.
2. Elaborazione del tessuto del rene
   1. Lavaggio ed autoclave un paio di pinze, pinza emostatica due morsetti, un paio di forbici di grado di servizio generale, due manici per bisturi lama, un becher da 1000 mL coperto con foglio di alluminio e un ancoretta 36 x 9 mm.
   2. Una cappa di coltura del tessuto con underpad la linea. Posizionare il bicchiere, un piatto di sterili per coltura (150 x 25 mm) e l'organo intero rene nel cofano. Riempire il becher con 500 mL di soluzione 1% SDS.
      Nota: I reni umani sono stati ricevuti sul ghiaccio da LifeCenter NorthWest.
   3. Riporre il rene nel piatto sterile coltura tissutale (Figura 1A). Rimuovere tutto il grasso perirenale radendosi leggermente intorno alla capsula renale con un bisturi (Figura 1B).
   4. Fare un'incisione superficiale 8-10 cm con il bisturi, appena abbastanza in profondità per rompere la capsula renale senza danneggiare il tessuto sottostante di corteccia, attraverso l'estremità superiore del rene. Rimuovere la capsula renale da peeling lontano il tessuto di corteccia con due pinze pinza emostatica (Figura 1).
   5. Bisecare il rene lungo il piano corona utilizzando il bisturi lungo il lato laterale del rene (Figura 1). Isolare il tessuto di corteccia da entrambe le metà di ritagliarsi la regione midollare con il bisturi (Figura 1E) e tagliare a dadini il tessuto di corteccia in pezzi di cm 0,5³ (Figura 1F). Rimuovere qualsiasi grandi vasi visibili.
3. Isolamento della matrice extracellulare
   1. In una cappa di coltura del tessuto, riempire un bicchiere da 1000 mL con 500 mL di soluzione 1% SDS. Posizionare la barra di tessuto e mescolate a dadini corteccia nel becher contenente la soluzione di SDS. Coprire il becher con un foglio di alluminio in autoclave e metterlo su un piatto di mescolare a circa 400 giri esterno della cappa di coltura del tessuto.
   2. Dopo il tessuto di corteccia è stato sulla piastra stir per 24 h, portare il becher in un cappuccio di coltura del tessuto e aggiungere un filtro sterile cella 40 µm realizzato con maglia di nylon. Riempire un becher da mL 1000 separata con 200 mL di candeggina e collocarlo nella cappa di coltura del tessuto.
   3. Dispensare la soluzione SDS attraverso il filtro delle cellule nel becher contenente candeggina. Pipettare fuori tutta la soluzione SDS finché non solo tessuti decellularizzati e del filtro cella rimangono nel becher.
      Nota: Il filtro cella deve evitare qualsiasi tessuto da essere rimosso durante l'aspirazione di soluzione.
   4. Lasciare il filtro cella nel becher e riempire con 500 mL di soluzione fresca di SDS. Coprire il becher con la stessa carta stagnola e mettere in un piatto mescolare alla stessa velocità come prima.
   5. Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.3 ogni 24 ore con soluzione fresca di SDS per un totale di cinque giorni.
   6. Sciacquare il tessuto decellularizzato con autoclave DI acqua ogni 24 ore, per un totale di 3 giorni, seguendo la tecnica descritta nella procedura 1.3.1-1.3.3.
   7. Sciacquare decellularizzato tessuto con acqua di grado di cultura cellulare ogni 24 h per totale di 2 giorni, seguendo la tecnica descritta nella procedura 1.3.1-1.3.3.
   8. Ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.2. Trasferire il tessuto decellularizzato (denominato kECM da questo punto in su) in un 30 mL self standing e tubo conico e riempirlo con acqua di grado di cultura cellulare fino a quando tutto il tessuto è sommerso.

2. fabbricazione di soluzione Stock di idrogel

1. Lavorazione meccanica del tessuto decellularizzato
   1. In una cappa di coltura del tessuto, omogeneizzare meccanicamente il kECM all'interno del tubo conico con un omogeneizzatore del tessuto per 2 min.
      Nota: KECM omogeneizzato dovrebbe assomigliare ad una soluzione opaca senza le parti visibili di ECM.
   2. Immergere il tubo conico contenente il kECM in azoto liquido fino a quando non è più bollente che circonda il tubo persiste. Conservare il kECM a-4 ˚ c durante la notte.
2. Liofilizzazione del tessuto congelato decellularizzato
   1. Allentare leggermente il tappo del tubo conico per consentire lo scambio di gas e posizionare il tubo in una macchina di liofilizzazione. Lyophilize la kECM per tre giorni o fino a che assomiglia ad una polvere bianca fine. Archivio a-4 ˚ c.
3. Digestione chimica e solubilizzazione di gel
   1. Autoclave una fiala di scintillazione 20ml e tappo, un ancoretta 15,9 x 7,9 mm e un paio di belle-punta forcipe.
   2. Pesare il kECM liofilizzato e calcolare il volume di HCl e massa di pepsina necessaria per solubilizzare il kECM per una soluzione di 3% (30 mg/mL) utilizzando le seguenti equazioni, dove m_pepsina è la massa di pepsina, _tessuto di m è la massa del tessuto liofilizzato e V_HCl è il volume di 0.01 N HCl:
      
      
   3. In una cappa di coltura del tessuto, aggiungere l'ancoretta, 0.01 N HCl e pepsina gastrica suina nella fiala di scintillazione e lasciarlo su una zolla di mescolare a circa 500 giri/min fino a sciolta tutti la pepsina. Trasferire la kECM liofilizzato nel flaconcino di scintillazione e lasciare la soluzione su un piatto di mescolare a circa 500 giri/min per tre giorni.

3. idrogel gelificazione

1. Preparazione di idrogel di rene ECM
   1. Gel l'idrogel mescolando la soluzione madre di idrogel di kECM con 1 N NaOH, 10 x Media supplemento (M199) e terreni di coltura delle cellule. Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio.
      Nota: Le concentrazioni di gel finale di 7,5 mg/mL sono state utilizzate per la coltura cellulare. 1 mL di gel di kECM era sufficiente per esperimenti di coltura cellulare presentati.
   2. Determinare il volume di lavorabile kECM gel prodotto e volume di stock kECM idrogel necessari utilizzando l'equazione seguente, dove V_finale è il volume del gel creato, V_{kECM stock} è il volume di idrogel di stock kECM necessario, C_{stock kECM} è la concentrazione dell'idrogel di stock kECM e C_finale è la concentrazione del gel finale:
      
   3. Determinare il volume dei reagenti necessari utilizzando le seguenti equazioni, dove V_NaOH è il volume di 1 N NaOH di neutralizzazione, V_{10 X} è il volume di M199 supplemento 10 X media, e V_{1 X} è la volume di terreno di coltura delle cellule:
      
      
      
   4. In una cappa di coltura del tessuto, dispensare i reagenti neutralizzanti (NaOH, M199 e terreni di coltura delle cellule) in una sterile 30ml self standing e tubo conico. Miscelare la soluzione di reagente neutralizzante con un microspatula.
   5. Utilizzare una siringa sterile da 1 mL per trasferire il volume appropriato di stock kECM idrogel per la soluzione di reagente neutralizzante. Utilizzare un microspatula per miscelare la soluzione fino ad ottenuta un impasto omogeneo in soluzione di idrogel di colore.
      Nota: Evitare di introdurre bolle d'aria mescolando lentamente e delicatamente.
   6. Per incorporare le cellule nell'idrogel di kECM, sottrarre 10 µ l di terreno di coltura cellulare (V_{1 X}) i calcoli di volume di soluzione neutralizzante nel passaggio 3.1.1.3.
      1. Sospendere le cellule in 10 µ l di terreno di coltura delle cellule. Determinare il numero di cellule in sospensione utilizzando l'equazione seguente, dove #_cellule implica il numero delle cellule di sospendere e_finale V è il volume del gel creato:
         
         Nota: 300.000 cellule/mL è la concentrazione di celle utilizzate nel gel kECM.
      2. Pipettare i 10 µ l di soluzione di cella sospesa in gel kECM finale dopo la soluzione di riserva di kECM è stata mescolata con soluzione di reagente neutralizzante. Agitare la soluzione con un microspatula fino a quando le cellule sono distribuite uniformemente.
2. Utilizzare una siringa da 1 mL per riempire un cella desiderata cultura dispositivo con l'idrogel di kECM.
3. Lasciare che il gel impostare a 37 ˚ c per 1 h prima di trasferire o cellule di placcatura.

Risultati

L'idrogel di kECM fornisce una matrice per la coltura delle cellule del rene con composizione chimica simile come il microambiente di Natale del rene. Per fabbricare l'idrogel, tessuto del rene corteccia è meccanicamente isolato da un organo rene intero e tagliato a dadini (Figura 1). Decellularizzati con un detersivo chimico (Figura 2A.1-a. 3) seguito da risciacqui con acqua per rimuovere le particelle di deter...

Discussione

Matrici di forniscono importanti indicazioni meccaniche e chimiche che governano il comportamento delle cellule. Idrogeli sintetici sono in grado di supportare complesse patterning 3-dimensionale, ma non riescono a fornire i diversi segnali extracellulari trovati in microambienti matrice fisiologica. Idrogel derivato dal nativo ECM sono materiali ideali per studi sia in vivo che in vitro . Precedenti studi hanno utilizzato decellularizzati ECM idrogeli per rivestire biomateriali sintetici per evitare

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparation of Kidney Tissue
5000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	Z740589
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	436143
Sterile H2O			Autoclaved DI H2O
Stir Bar (70 x 10 mm)	Fisher Science	14-512-128
500 mL Vacuum Filter	VWR	97066-202
Stir Plate	Sigma-Aldrich	CLS6795420D
1000 mL Beaker	Sigma-Aldrich	CLS10031L
Forceps	Sigma-Aldrich	F4642	Any similar forceps may be used
Scissor-Handle Hemostat Clamp	Sigma-Aldrich	Z168866
Dissecting Scissors	Sigma-Aldrich	Z265977
Scalpel Handle, No. 4	VWR	25859-000	Any similar scalpel handle may be used
Scalpel Blade, No. 20	VWR	25860-020	Any similar scalpel blade may be used
Stir Bar (38.1 x 9.5 mm)	Fisher Science	14-513-52
Absorbent Underpad	VWR	82020-845
Petri Dish (150 x 25 mm)	Corning	430597
Autoclavable Biohazard Bag	VWR	14220-026
Sterile Cell Strainer (40 um)	Fisher Science	22-363-547
Cell Culture Grade Water	HyClone	SH30529.03
30 mL Freestanding Tube	VWR	89012-778
Fabrication of ECM Gel
Tissue Homogenizer Machine	Polytron	PCU-20110
Freeze Dryer	Labconco	7670520
20 mL Glass Scintillation Vials and Cap	Sigma-Aldrich	V7130
Stir Bar (15.9 x 8 mm)	Fisher Science	14-513-62
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa	Sigma-Aldrich	P7012
0.01 N HCl	Sigma-Aldrich	320331	Dilute to 0.01 N HCl with cell culuture water
Kidney ECM Gelation
1 N NaOH (Sterile)	Sigma-Aldrich	415413	Dilute to 1 N in cell culture grade water
Medium 199	Sigma-Aldrich	M4530
15 mL Conical Tube	ThermoFisher	339651
Cell Culture Media	ThermoFisher	11330.032	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10082147
Antibiotic-Antimycotic 100X	Life Technologies	15240-062
Insulin, Transferrin, Selenium, Sodium Pyruvate Solution (ITS-A) 100X	Life Technologies	51300-044
1 mL Syringe	Sigma-Aldrich	Z192325
Microspatula	Sigma-Aldrich	Z193208