Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Abstract

L'attività elettrica delle cellule nei tessuti può essere monitorata da tecniche elettrofisiologiche, ma questi sono solitamente limitati all'analisi delle singole celle. Poiché un aumento di calcio intracellulare (Ca^{2 +}) nel citosol si verifica spesso a causa dell'attività elettrica, o in risposta ad una miriade di altri stimoli, questo processo può essere monitorato dall'imaging delle cellule caricati con fluorescente calcio sensibili coloranti.  Tuttavia, è difficile per questa risposta in un tipo di cella singola all'interno di intero tessuto di immagine perché questi coloranti sono presi da tutti i tipi di cellule all'interno del tessuto. Al contrario, codificato geneticamente calcio indicatori (GECIs) possono essere espresso da un tipo di cella singola e reagiscono in risposta ad un aumento di Ca intracellulare^{2 +}, permettendo così l'imaging del Ca^{2 +} segnalazione in intere popolazioni di tipi di cellule singole. Qui, applichiamo l'uso di GECIs GCaMP3/6 alla giunzione neuromuscolare del mouse, un tripartito sinapsi tra i neuroni di motore, muscolo scheletrico e terminal/perisinaptici in cellule di Schwann. Dimostriamo l'utilità di questa tecnica nelle preparazioni di tessuto classico ex vivo . Utilizzando un separatore ottico, eseguiamo imaging di doppio-lunghezza d'onda di Ca^{2 +} segnali dinamici e un'etichetta statica della giunzione neuromuscolare (NMJ) in un approccio che può essere facilmente adattato per monitorare due cellula-specifico GECI o tensione codificato geneticamente indicatori (GEVI) contemporaneamente. Infine, si discutono la routine utilizzate per acquisire mappe spaziali di intensità di fluorescenza. Insieme, queste tecniche ottiche, transgeniche e analitiche possono essere impiegate per studiare l'attività biologica delle sottopopolazioni distinte delle cellule alle NMJ in un'ampia varietà di contesti.

Introduzione

La giunzione neuromuscolare, come tutte le sinapsi, è composto da tre elementi: un terminale presinaptico derivato da un neurone, una cellula postsynaptic neurone/effettrici, e un perisinaptici glial cell^1,2. Mentre gli aspetti fondamentali della trasmissione sinaptica in primo luogo sono stati dimostrati a questa sinapsi³, molti aspetti di questo processo rimangano sconosciuti, in parte a causa dell'espressione delle molecole stesse di distinti elementi cellulari di questa sinapsi. Ad esempio, ricevitori per sia l'acetilcolina (ACh) e del purina adenina nucleotide ATP che co-sono rilasciati dai neuroni di motore alle NMJ vertebrati, sono espresse da muscolo, cellule di Schwann e neuroni di motore, così che complica l'interpretazione di qualsiasi funzionale effetto esercitato da queste sostanze (ad es., rilascio del trasmettitore o risposta, generazione di forza muscolare)⁴. Inoltre, sebbene i componenti tripartiti della giunzione neuromuscolare sono semplici rispetto a, per esempio, i neuroni nel sistema nervoso centrale che spesso esibiscono più input sinaptico, se motoneuroni, cellule muscolari o cellule di Schwann variano in risposta a stimoli basato il loro intrinseca eterogeneità (ad es., derivazione embrionale, sottotipo di fibra, morfologia) è poco chiaro. Al fine di affrontare ciascuno di questi problemi, sarebbe vantaggioso per monitorare simultaneamente la risposta di molte cellule all'interno di un elemento sinaptica, così come traccia, allo stesso tempo, tale risposta in uno degli altri elementi separati. Le strategie convenzionali utilizzando coloranti chimici per misurare la segnalazione del calcio non possono raggiungere questi due obiettivi, perché applicati a vasca di tintura è occupata da più tipi di cella dopo l'applicazione del tessuto e tintura intracellulare caricata può essere utilizzata solo per visualizzare coorti di individui o piccoli delle cellule. Qui, utilizzando topi transgenici esprimenti GECIs progettato per misurare la segnalazione del calcio cellula-specifico, insieme a specific Imaging, imaging e software strumenti⁵, dimostriamo il primo di questi due obiettivi globali e discutere come l'aggiunta di nuovi strumenti transgenici aiuterebbe a raggiungere il secondo. Questa tecnica sarà utile per chiunque sia interessato a rilevamento dinamica del calcio o altri cellulari osservabile di eventi di segnalazione attraverso sensori ottici gene-codificato in più popolazioni di cellule allo stesso tempo.

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Protocollo

Zootecnia e gli esperimenti sono stati effettuati conformemente alla istituti nazionali di salute Guida per la cura e uso di animali da laboratorio e il IACUC presso l'Università del Nevada.

1. preparazione dei diaframmi e nervi frenici da topi transgenici

1. Acquisto di topi transgenici e iniettori del oligonucleotide di genotipo questi topi.
   Nota: Gli iniettori sono elencati nella pagina "Informazioni" per ciascuno di questi topi.
   1. Allevare un mouse di 3-6 mesi esprimendo una copia dell'allele appropriato transgenici/knock-in Cre-driver e zero copie dell'allele GCaMP3/6 condizionale con un secondo mouse della stessa età che esprime una o due copie del condizionale GCaMP3 / 6 allele e zero copie dell'allele Cre-driver.
   2. Genotipo i cuccioli e mark quelli che hanno condizionato GCaMP3/6 alleli e Cre — questi sarà d'ora in poi chiamati topi transgenici doppio (ad es., Myf5-Cre, GCaMP3 condizionale)⁶.
      Nota: In questo modo, tutti i dati deriverà da topi che esprimono una copia del condizionale GCaMP3/6 alleli e Cre. Ciò è particolarmente importante quando l'aggiunta di queste croci in altri topi mutanti (ad es., Ko).
2. Quando i topi transgenici doppio sono di età adeguata (ad es., postnatale giorno 0 o 5 [P0 o P5] o adulto), eutanasia i topi di decapitare loro con le forbici (per topi più giovane di P10) o inserendoli in una camera di inalazione isoflurane — quando sono non è più reattivo a pizzicare la coda con un paio di pinze, sono pronti per il sacrificio.
3. Sacrificare l'animale per decapitazione con un paio di forbici.
4. Trasversalmente sezione attraverso l'intero animale appena sotto il fegato e appena sopra il cuore ed i polmoni con le forbici iridectomy.
5. Via sezionare il fegato, il cuore e i polmoni, facendo attenzione a mantenere una lunghezza del nervo frenico che è sufficientemente lungo per essere disegnata in un elettrodo di aspirazione (cioè, 1-2 cm).
   Nota: Il nervo frenico sinistro può essere identificato come un pezzo di tessuto che entra la porzione mediale del diaframma sinistro bianco. Esso non deve essere tagliato quando si rimuovono i polmoni. Il nervo frenico di destra viene eseguito all'interno di un pezzo della fascia che inoltre contiene la vena cava superiore ed è più sottile e più bianca di vena cava. Insieme, entrambi riescono a penetrare il diaframma mediale di destra.
6. Più ulteriormente rimuovere la gabbia toracica e la colonna vertebrale, fatta eccezione per la cresta sottile intorno al diaframma.
7. Posizionare il diaframma e il campione del nervo frenico in un tubo di microfuge con la soluzione di Krebs-soneria con 594-αBTX di 1 µ g/mL per 10 min al buio.
   Nota: Questa concentrazione di 594-αBTX etichette recettori ACh (AChR) senza bloccare la loro funzione (osservazione personale).

2. stimolazione e la registrazione dei potenziali d'azione muscolare

1. Utilizzando minutien perni, immobilizzare il diaframma da appuntare e su un piatto di 6 cm rivestiti con silicone gel dielettrico e pieno di ~ 8 mL di soluzione di Krebs-soneria ossigenato e posizionatelo sopra il tavolino del microscopio. Irrorare il diaframma con più soluzione di Krebs-soneria (8 mL/min) per 30 min.
   Nota: Questo risciacqua il 594-αBTX non associato, nonché equilibra il tessuto dopo la dissezione.
2. Rendere un elettrodo di aspirazione secondo i metodi stabiliti⁷.
   1. Con un ingrandimento 4x, utilizzando un micromanipolatore, spostare l'elettrodo aspirazione sopra il nervo frenico sinistro e aspirare tirando fuori la canna di una siringa 5 mL collegata al tubo che è collegato all'elettrodo di aspirazione.
      Nota: Quando correttamente disegnato nell'elettrodo di aspirazione, il nervo frenico è teso. Accendere lo stimolatore e stimolare il frenico nervo lanciando il manuale passare 1x.
   2. Assicurarsi che il diaframma si contrae in risposta alla stimolazione 1-Hz esaminando visivamente con illuminazione a campo chiaro. In caso contrario, regolare la tensione ruotando la manopola di tensione in modo incrementale per ottenere un impulso agonistica, che può essere verificato da un esame visivo della contrazione muscolare. Se ancora non è visibile, soffiare il nervo con la siringa e tentare di trarre nuovo applicando l'aspirazione.
3. Disattivare la perfusione e aggiungere la miosina del muscolo-specifico inibitore BHC⁶ o la tensione-gated del sodio canale antagonista µ-conotossina⁸ ad una concentrazione finale di 100 µM.
   1. Per rendere 100 µM BHC, 4 µ l di stock di 200 mM in DMSO e prediluire esso in 1 mL di soluzione di Krebs-soneria.
   2. Rimuovere 1 mL di soluzione di Krebs-soneria dal piatto.
   3. Aggiungere il BHC prediluito, al piatto.
      Nota: Questa prediluizione consente di impedire l'induzione di DMSO non diluito di una risposta fluorescente non transitorio in cellule che esprimono GCaMP3.
   4. Attendere 30 min e quindi attivare la perfusione di soluzione di Krebs-soneria fresca per un altro 20-30 min.
4. Preparare l'elettrodo di registrazione.
   1. Indossando guanti, inserire un vetro di borosilicato filamentato con un diametro esterno (OD) di 1 mm e un diametro interno (ID) di 0,4 mm un estrattore micropipetta e serrare le manopole per bloccarlo in posizione. Chiudere lo sportello di estrattore.
   2. Utilizzando un estrattore P-97, programmare la seguente impostazione: calore a 900, pull a 120, velocità a 75, tempo a 250, pressione a 500 e senza ulteriori cicli.
      Nota: Resistance (R) è misurata utilizzando il software di controllo dell'amplificatore: il software di acquisizione dati conferma la resistenza risolvendo la formula V = IR Il controller software passa una corrente nota (I) (in genere 1 nA) attraverso l'elettrodo e misura la variazione di tensione (V), consentendoci così di risolvere per R.
   3. Per membrane embrionali, assicurarsi che la resistenza sia vicino a 60 MΩ e per i più anziani diaframmi, 10-20 MΩ. Caricare l'elettrodo di registrazione con 3M KCl.
5. Ingrandimento 10x, abbassare l'elettrodo nel muscolo, utilizzando un micromanipolatore secondo sul lato opposto del palco come un elettrodo stimolante.
6. Utilizzando software di acquisizione dati elettrofisiologici, attendere che il potenziale di membrana di riposo cambia da 0 a -65 mV o qui sotto.
7. Stimolare a 1 Hz e verificare la presenza di un potenziale di azione muscolare controllando un grande potenziale che esibisce un modesto superamento (potenziale che si erge sopra 0 mV quando inizia il a -65 mV o qui sotto). Non confondere artefatto di stimolazione con un potenziale di azione.
   Nota: Potenziali sono significativamente più lunghi durata (~ 5 ms) di manufatti di stimolazione.

3. formazione immagine di fluorescenza del campione

1. 20 ingrandimenti, individuare il gruppo della piastra laterale al centro del muscolo cercando NMJs 594-αBTX – etichettato sotto eccitazione luce giallo/verde (550 nm). Passare per l'eccitazione di luce blu (470 nm) a immagine Ca^{2 +} risposte nel muscolo, motoneurone o cellule di Schwann.
2. Se lo si desidera, impostare la barra di divisione di immagine con filtri passa-banda e un filtro dicroico tagliente per l'imaging di doppio-lunghezza d'onda.
3. Al fine di calcolare la fluorescenza massima (Fmax) esposta dal tessuto GCaMP3/6-esprimendo, aggiungere 12 µ l 3 M di cloruro di potassio (KCl) per le preparazioni di diaframma⁶.
   1. Esperimenti con la barra della luminosità sulla barra di tabella di ricerca impostato al 110% del livello al quale il tessuto GCaMP3/6-esprimendo esibisce saturazione a 20 ingrandimenti, senza binning in risposta al KCl.
4. Registra a 20 fotogrammi al secondo per non perdere alcun evento veloce.
5. Stimolare con s 1-45 di 20-40 Hz di stimolazione del nervo fornendo un treno di impulsi utilizzando l'elettrodo aspirazione o aggiungere agonisti farmacologici da bagno applicazione o mediante perfusione e raccogliere fluorescente Ca^{2 +} risposte dinamiche nel sottotipo di una cella insieme al segnale NMJ statico 594-αBTX.
   Nota: Se tessuto-specifica rossi o da' GECI o GEVI topi diventano disponibili per l'utilizzo alle NMJ, può essere utilizzati per raccogliere due segnali dinamici che riflettono due distinti elementi cellulari alle NMJ.
6. Quando gli esperimenti elettrofisiologici o di imaging sono finiti perché sono stati raggiunti i risultati desiderati, irrorare d'acqua attraverso le linee di perfusione e succhiare l'acqua 2 x - 3 x attraverso l'elettrodo aspirazione per garantire che i sali non accumulano.

4. esportazione e analisi dei dati di una mappa con deviazione Standard di intensità di fluorescenza (SD_iu16)

1. Registrare sequenze di immagini registrate come pile TIFF 16 bit e caricarli nel sistema di analisi dati di imaging desiderato per l'analisi.
2. Nel menu file del software 8D selezionare la serie di immagini di interesse e fare clic per caricare.
   1. Una volta caricato il video, la scansione attraverso il tempo per identificare una sezione che non ha alcuna attività cellulare fluorescente.
      Nota: Questa regione verrà essere utilizzata per creare un esempio di sfondo.
   2. Tenere premuto MAIUSC e fare clic per disegnare un'area di casella di interesse (ROI) nella zona identificata come l'area del campione di sfondo.
   3. Dopo aver creato la casella, premere la barra spaziatrice per generare un grafico di cambiamento di attività di sfondo.
   4. Pulsante destro del mouse la traccia e selezionare l'opzione assortiti per presentare l'opzione per Eseguire il Dump di ROI come testo per rendere la traccia come file di testo delle coordinate xy.
3. Tornando al video di interesse, rieseguire la scansione per identificare l'area di tempo dove è in corso l'attività di interesse.
   1. Utilizzare il pulsante centrale del mouse, selezionare questa regione di tempo nella casella gialla ora.
   2. Fare clic destro sul video e selezionare Stack OPS e poi Stat mappa opzione 5.
      Nota: Questo genererà una mappa di deviazione standard (SD mappa) nella finestra di sinistra.
   3. Clicca sulla mappa SD e quindi premere il ] tasto 19 x per applicare la mappa di calore del colore appropriato.
   4. Pulsante destro del mouse la mappa SD e selezionare STM caricare e salvare, che presenterà l'opzione salvare stm come tiff per salvare la mappa di SD.
   5. Poi, premere il [ chiave 19 x per tornare alla mappa di colore in scala di grigi.
   6. Premere C e poi D per richiamare strumenti di mappatura di densità. Utilizzando il pulsante sinistro del mouse e il pulsante del mouse di centro, regolare la soglia per includere tutte le attività fluorescente mostrata nella mappa SD.
   7. Premere C per chiudere gli strumenti di densità, mantenendo le impostazioni di soglia.
   8. Pulsante destro del mouse la mappa SD e selezionare STM particelle e quindi Trovare PTCLS.
      Nota: Questo identificherà singole cellule che esprimono attività fluorescente.
   9. Pulsante destro del mouse la mappa SD ancora una volta e selezionare Creare particelle ROIs.
      Nota: Questo a sovrapporre le celle selezionate il video originale di interesse.
   10. Tenendo premuto MAIUSC, fare clic destro su uno qualsiasi della particella ora identificato ROIs il video originale.
   11. Selezionare indicatore ROI e misura Int in ROI.
       Nota: Questo genererà trame attività fluorescente individuale per ogni ROI identificati nel video di interesse. Questi può essere salvati facendo clic destro su uno qualsiasi di questi e selezionando assortiti, seguiti da Dump ROI come testo.
4. Per dettagliate logica alla base di queste operazioni, vedere il file di codice sorgente⁹.

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Risultati

Diversi esempi di cambiamenti di intensità di fluorescenza, mediate da un aumento di Ca intracellulare^{2 +} all'interno di tipi di cella definita della giunzione neuromuscolare, dimostrano l'utilità di questo approccio. Questi risultati sono presentati come mappe di intensità di fluorescenza spaziale, che forniscono la posizione delle cellule risponde, così come l'intensità delle loro risposte, consentendo in tal modo la valutazione di quante cellule rispondono e quanto ogni...

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Discussione

Qui forniamo alcuni esempi di Ca^{2 +} risposte in celle specifiche in tessuto neuromuscolare intatto facendo uso dei topi che esprimono GECI di misura. Per eseguire correttamente questi esperimenti, è imperativo di non ferire il nervo frenico durante la dissezione. Per realizzare l'immagine Ca^{2 +} risposte in cellule di Schwann a potenza alto o basso (cioè, X 20 o 60 X), è necessario utilizzare BHC o µ-conotossina al blocco movimento. Per l'imaging di bassa potenza di Ca^{2 +} risp...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	Drives muscle cell expression as early as E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	Drives expression into all  Schwann cells at E13 but not P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	Drives Schwann cell expression at older ages
Conditional GCaMP3 mice	Jax	#029043	Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ
µ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8
Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins
Minutien pins (0.1mm diameter)	Fine Science Tools	26002-10	Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon	MBA74100	Allows staging and observation of specimen
Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator	Autom8	MXMScr	Allows movement of specimen
Manual micromanipulator	Narishige	M-152	Holds recording and stimulating electrodes
Microelectrode amplifier	Molecular Devices	Axoclamp 900A	Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording
Microelectrode low-noise data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1550	Allows electrophysiological data acquisition
Microelectrode data analysis system	Molecular Devices	PCLAMP 10 Standard	Performs electrophysiological data analysis
Square wave stimulator	Grass	S48	Stimulates nerve to excite muscle
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	Reduces  stimulation artifacts
Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter	Sutter	FG-GBF100-50-15	Impales and records nerve-evoked muscle potentials
Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter	Sutter	BF150-117-15	Lengthened and used for suction electrode
Micropipette Puller	Sutter	P-97	Pulls and prepares recording electrodes
1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera	Photometrics	Prime 95b	Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging
Light Source	Lumencor	Spectra X	Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation
Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm	Nikon	CFI60	Provide long working distances for visualization of specimen
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	Provides illumination for brightfield observation
W-View Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera
Single-band Bandpass Filters  (512/25-25 and 630/92-25)	SemRock	FF01-512/25-25; FF01-630/92-25	Permits dual band imaging
560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging
Imaging data acquisition system	Nikon	NIS Elements - MQS31000	Allows imaging data acquisition
Wavelength control module	Nikon	MQS41220	Module for imaging data acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	Module for imaging data acqusiition
Imaging data analysis system	NA	Volumetry 8D5, Fiji	Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data