Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento delle cellule leucemiche dal midollo osseo di leucemia pazienti e l'analisi del loro stato metabolico. Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria potrebbe contribuire a caratterizzare meglio la domanda di cellule primarie e potrebbe portare alla medicina più personalizzata.

Abstract

Il requisito metabolico delle cellule tumorali possa influenzare negativamente la sopravvivenza e l'efficacia del trattamento. Al giorno d'oggi, targeting farmaceutici delle vie metaboliche è testato in molti tipi di tumori. Così, la caratterizzazione dell'installazione metabolica delle cellule di cancro è inevitabile al fine di mirare la via corretta per migliorare il risultato complessivo dei pazienti. Purtroppo, nella maggior parte dei cancri, le cellule maligne sono abbastanza difficili da ottenere in numeri più alti e la biopsia del tessuto è richiesta. La leucemia è un'eccezione, dove un numero sufficiente di cellule leucemiche possa essere isolato dal midollo osseo. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule leucemiche dal midollo osseo di leucemia pazienti e l'analisi successiva del loro stato metabolico mediante Analizzatore di flusso extracellulare. Le cellule leucemiche sono isolate dal gradiente di densità, che non pregiudica la loro sopravvivenza. Il prossimo passo di coltivazione li aiuta a rigenerare, così lo stato metabolico misurato è lo stato delle cellule in condizioni ottimali. Questo protocollo permette di ottenere risultati costanti e ben standardizzati, che potrebbero essere utilizzati per la terapia personalizzata.

Introduzione

Il profilo metabolico è una delle caratteristiche principali delle cellule e bioenergetica alterato sono ormai considerati uno dei tratti distintivi di cancro^1,2,3. Inoltre, cambiamenti nel setup metabolico potrebbero essere utilizzati nel trattamento di cancro targeting per vie di trasduzione del segnale o macchinario enzimatico di cancro cellule^4,5,6. Conoscendo la predisposizione metabolica delle cellule tumorali è così un vantaggio e può contribuire a migliorare la terapia corrente.

Ci sono un sacco di metodi già consolidati che può valutare l'attività metabolica delle cellule in coltura. Per quanto riguarda la glicolisi, l'assorbimento del glucosio può essere misurata mediante la marcatura radioattiva, con 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) o livelli di lattato extracellulare enzimaticamente misurato^7,8. Velocità di ossidazione dell'acido grasso è un altro parametro metabolico misurato dal palmitato isotopicamente etichettato^9,10. Tasso di consumo di ossigeno è un metodo ampiamente utilizzato per determinare l'attività mitocondriale in cellule^11,12, insieme con la membrana mitocondriale potenziale valutazione^13,14, ATP/ADP (adenosina 5 '-trifosfato di adenosina 5 '-difosfato) rapporto misura¹⁵ o totale intracellulare ATP misura¹⁶. Conosciuta per regolare i processi metabolici di vie di segnalazione potrebbero essere determinata da quantificazioni di proteina e possono migliorare la comprensione delle misure metaboliche^17,18,19.

Tuttavia, tutti questi metodi misurano solo uno o, nella migliore delle ipotesi, alcuni parametri metabolici in uno campione contemporaneamente. Misura simultanea del tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) importante, può essere ottenuta per l'analisi di flusso extracellulare da, ad esempio, Seahorse XFp Analyzer. OCR è un indicatore della respirazione mitocondriale ed ECAR è principalmente il risultato della glicolisi (non possiamo ignorare CO₂ produzione possibilmente elevare ECAR delle cellule con attività elevata fosforilazione ossidativa)²⁰. Finora, i vari tipi di cellule sono stati studiati utilizzando questi analizzatori^21,22,23.

Qui descriviamo il protocollo per l'analisi di flusso extracellulare di primarie blasti (cellule di leucemia derivate dal palco ematopoietica immaturo) da pazienti affetti da leucemia. Al meglio della nostra conoscenza, un protocollo specifico per esplosioni primarie non è ancora disponibile.

Protocollo

Tutti i campioni sono stati ottenuti con il informed consent dei genitori o tutori dei bambini e l'approvazione del comitato etico dell'Università del Charles a Praga, Repubblica Ceca, lo studio no. NV15-28848A.

1. preparazione dei reagenti

1. Preparare 500 mL di PBS sciogliendo 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM KH₂PO₄, ddH₂O. regolare il pH a 7.4 con HCl. sterilizzare in autoclave.
2. Preparare 100 mL di terreno RPMI: medium RPMI-1640 con L-alanil-glutammina completato con 10% siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL).
3. Preparare 50 mL di 0.1 M NaHCO₃ in acqua distillata. Aggiustare il pH a 8.1, filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a 4 ° C.
   Nota: Per due piastre di analizzatore di flusso 8 pozzetti extracellulare, preparare 250 μL di 0.1 M NaHCO₃ pH 8.1.
4. Preparare 1 mL di 2 M D-glucosio in acqua distillata. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.
5. Preparare 100 μL di 1 mM Oligomycin A in etanolo. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.
6. Preparare 250 μL di 1 M 2-deoxy-D-glucosio (2DG) in DMEM Minimal (medio dell'Aquila di Dulbecco per volta). Riscaldare a 37 ° C e regolare il pH a 7,4 (effettuare misurazioni di pH a 37 ° C). Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.
7. Preparare 100 μL di 1mm FCCP (Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone) in DMSO. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.
8. Preparare 100 μL di 1mm Rotenone in etanolo. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.
9. Preparare 100 μL di 1mg/mL Antimycin A in etanolo. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.
10. Appena prima dell'uso, preparare 10 mL di mezzo di prova di stress di glicolisi. Caldo DMEM minimo a 37 ° C in un bagno d'acqua e regolare il pH a 7,4 (effettuare misurazioni di pH a 37 ° C).
11. Prima dell'uso, preparare 10 mL di mezzo di prova di stress di cella Mito con BSA. Supplemento minimo DMEM con 2 mM L-Glutammina, 10 mM D-glucosio, 1 mM HEPES (pH 7.4), piruvato di 1 mM e 0,1% BSA (albumina di siero bovino). Riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua e regolare il pH a 7,4 (effettuare misurazioni di pH a 37 ° C).
12. Prima dell'uso, preparare 10 mL di mezzo di test di stress cellulare Mito senza BSA. Supplemento minimo DMEM con 2 mM L-Glutammina, 10 mM D-glucosio, 1 mM HEPES (pH 7,4) e piruvato di 1 mM. Caldo di mezzo di prova di stress cellulare Mito senza BSA a 37 ° C in un bagno d'acqua e regolare il pH a 7,4 (effettuare misurazioni di pH a 37 ° C).
    Nota: BSA viene aggiunto al mezzo di test di stress cellulare Mito perché le cellule rispondono meglio a FCCP quando il mezzo è completato con BSA (circostanze differenti sono stati provati). Mezzo di test di stress cellulare Mito senza BSA viene utilizzato per il caricamento le porte come il produttore non è consigliabile utilizzare BSA nel mezzo.

2. isolamento delle cellule mononucleari dal midollo osseo

Nota: Idealmente, misurazione della condizione metabolica delle cellule di leucemia primaria dovrebbe iniziare subito dopo l'isolamento di raccolta e delle cellule del midollo osseo. Tuttavia, dati rilevanti potrebbero essere ottenuti anche da cellule isolate dopo trasporto da altri Ematologia centri nella Repubblica Ceca. Eseguire tutti i passaggi secondari in un cappuccio sterili per coltura.

1. Scaldare a PBS ed il mezzo di gradienti di densità a temperatura ambiente.
2. Diluire il campione di midollo osseo del paziente di leucemia con PBS, in un rapporto di 1:1. Assicurarsi che il campione contenga almeno l'80% di blasti leucemici.
3. Determinare la percentuale di blasti da citometria a flusso utilizzando marcatori di CD specifici per la caratterizzazione di immunophenotype di tipi delle cellule. Dopo la separazione di gradienti di densità, è possibile rilevare eventi positivi di acido nucleico con un colorante nucleare al fine di stabilire il conteggio complessivo delle cellule.
4. Quindi, determinare le cellule di leucemia utilizzando marcatori di CD specifici per ogni tipo di leucemia: B-ALL (CD19, CD45), LAL-T (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) e AML (CD45, CD33 e specifici marcatori mieloidi)²⁴. Dividere il numero delle cellule di leucemia positive per gli indicatori specifici di CD di tutte le cellule nucleari per determinare la percentuale delle cellule di scoppio di leucemia.
   Nota: Il midollo osseo deve essere raccolto in provette con anticoagulanti.
5. Con attenzione strato 6 mL del campione diluito del midollo osseo oltre 6 mL del mezzo gradiente di densità in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 400 x g per 35 min a 4 ° C in un rotore basculante senza il freno.
   Nota: Il più grande volume del campione potrebbe essere diviso in più aliquote o provetta conica da 50 mL può essere utilizzato con la maggiore quantità di mezzo di gradienti di densità.
6. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire con cautela lo strato di interfase che consiste delle cellule mononucleari (Figura 1) per un nuovo tubo conico da 50 mL con 5 mL di PBS. Centrifugare a 400 × g per 10 min a 4 ° C in un rotore basculante.
   Nota: Trasferire tutti gli strati di cellule mononucleari in una provetta conica di singolo 50 mL con 5 mL di PBS.
7. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di PBS sterile. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
   Nota: Il numero di cellule di leucemia in un mL di midollo osseo aspirato differisce significativamente tra i pazienti²⁵.

3. durante la notte coltivazione delle cellule mononucleari

Nota: Eseguire tutti i passaggi secondari in un cappuccio sterili per coltura.

1. Preparare due T75 beute con 20 mL di RPMI. A ciascuna beuta, aggiungere 30 x 10⁶ isolato cellule mononucleari. Incubare le cellule con il pallone in piedi per 16 – 24 h a 5% CO₂ e 37 ° C.

4. preparazione delle piastre rivestite con adesivo cellulare

1. Cappotto due piastre di analizzatore di flusso 8 pozzetti extracellulare.
   Nota: Eseguire il rivestimento in un cappuccio sterili per coltura.
2. Aggiungere 2,2 μL di adesivo cellulare (densità: 2,54 mg/ml) a 250 μL di 0.1 M NaHCO₃, pH 8.1 e pipetta immediatamente 12.5 μL della soluzione in ogni pozzetto.
   Nota: Soluzioni stock adesive delle cellule può differire nella loro densità, regolare il volume aggiunto a NaHCO₃ di conseguenza.
3. Lasciate che le piastre sedersi nella cappa per circa 20 min, poi aspirare l'adesivo cellulare e lavare ogni ben due volte utilizzando 200 μL di acqua sterile. Lasciate riposare nella cappa con il coperchio aperto fino a quando i pozzi sono asciutti.
4. Utilizzare le piastre subito o salvare fino a 1 settimana a 4 ° C con il cerchio avvolto in film di paraffina per evitare la condensa. Assicurarsi che le piastre vengono riscaldate fino a temperatura ambiente (per circa 20 min) nella cappa prima della semina delle cellule.

5. idratazione della cartuccia sensore

Nota: Idratare due cartucce di analizzatore di flusso 8 pozzetti extracellulare.

1. Separare la piastra di utilità e la cartuccia sensore. Capovolgere la cartuccia sensore sul banco di laboratorio.
2. Riempire ogni bene della piastra utilità con 200 μL calibratore. Riempire ogni fossato intorno alla parte esterna dei pozzi con 400 μL di calibratore.
3. Restituire la cartuccia sensore alla piastra di utilità che contiene ora il calibratore.
4. Posizionare la cartuccia in un non-CO, umidificata₂, incubatore 37 ° C durante la notte.
5. Accendere l'analizzatore di flusso extracellulare e lasciarlo calda a 37 ° C durante la notte.

6. cellule in piastre rivestite con adesivo cellulari di semina

Nota: Per test di stress di glicolisi, utilizzare mezzo di prova di stress di glicolisi. Per test di stress cellulare Mito, utilizzare mezzo di prova di stress cellulare Mito con BSA.

1. Cellule di seme per il test di stress di glicolisi e il test di stress cellulare Mito in piatti separati. Per ogni test, è possibile utilizzare celle da una boccetta con cultura durante la notte.
2. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno appropriato e contarli.
3. Aggiungere 4 x 10⁶ di cellule vive al volume finale di 400 μL (uso medio appropriato).
4. Piastra 50 μL della sospensione delle cellule nei pozzetti B-G. Garantire 500.000 cellule sono seminate in un pozzetto.
   Nota: È fondamentale per seme esattamente 500.000 cellule per pozzetto come viene eseguita alcuna normalizzazione di altre. In questo modo, i risultati da diversi pazienti possono essere confrontati. Il numero ottimale di ripetizioni è sei, come è descritto qui. Utilizzando meno repliche non è raccomandato poiché le cellule primarie potrebbe comportarsi a volte erroneamente.
5. Aggiungere 180 μL del mezzo appropriato nei pozzetti A e H (questi pozzi servirà come una correzione del fondo).
6. Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente con freno impostato su 1.
7. Aggiungere 130 μL di mezzo appropriato a pozzetti B-G in due piastre di analizzatore di flusso 8 pozzetti extracellulare lentamente e con attenzione. Confermare visivamente che le cellule siano rispettate stabilmente il fondo dei pozzetti di visualizzazione al microscopio.
8. Posizionare la piastra in un non-CO, umidificata₂, incubatore a 37 ° C per 30 min.

7. caricamento della cartuccia sensore

1. Per il test di stress di glicolisi, preparare 250 μL ciascuno di 100 millimetri di glucosio, 20 μM Oligomycin A e 1 M 2-DG, nel mezzo di prova di stress di glicolisi.
2. Per il test di stress cellulare Mito preparare 250 μL ciascuno di 20 μM Oligomycin un, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP e una miscela di 10 μM Rotenone e 10 μg/ml Antimycin A, tutti in mezzo, test di stress cellulare Mito senza BSA.
   Nota: Iniettare due concentrazioni di FCCP in un dosaggio è raccomandato poiché non c'è materiale abbastanza pazienti per la titolazione di FCCP. Tuttavia, le concentrazioni devono essere determinate dal ricercatore.
3. Caricare i composti nelle porte appropriato iniettore della cartuccia come segue (tabella 1):

8. configurazione del programma

1. Per il test di stress di glicolisi, impostare il programma come descritto nella tabella 2.
2. Per il test di stress cellulare Mito, impostare il programma come descritto nella tabella 3.
3. Avviare il programma. Sostituire la piastra di calibratore con la piastra di dosaggio (quando richiesto).

9. valutazione e interpretazione dei risultati

1. Nei risultati del test di stress di glicolisi, sottrarre il valore più basso di ECAR dopo iniezione 2-DG da tutti gli altri valori ECAR.
   Nota: Questo valore più basso rappresenta l'acidificazione non glicolitico. Di solito, il valore più basso è da 4 misura di^th .
2. Calcolare l'acidificazione basale, glicolisi, massima glicolisi e glicolitico riserva parametri dalla funzione glicolitici (Figura 2A). Dopo aver sottratto il valore più basso di ECAR, calcolare l'acidificazione basale come mezzo di ECAR dalle prime tre misurazioni (omettere il primo valore ECAR se si differenzia notevolmente dalle altre due), calcolare la glicolisi come mezzo di ECAR da tre misura punti dopo l'iniezione di glucosio e calcolare la massima glicolisi come una media di ECAR dalla misura tre punti dopo Oligomycin un'iniezione. Calcolare Glycolytic riserva come glicolisi massima meno glicolisi.
   Nota: In alternativa, per il calcolo di massima glicolisi, utilizzare il valore più alto di ECAR dai tre punti misurati.
3. Nei risultati del test di stress cellulare Mito, sottrarre il valore di OCR più basso dopo l'iniezione di Rotenone/Antimycin A da tutti gli altri valori di OCR.
4. Calcolare la respirazione basale, produzione di ATP, massima respirazione e parametri di capacità di riserva dalla funzione mitocondriale (Figura 2B). Dopo aver sottratto il più basso valore di OCR, calcolare la respirazione basale come mezzo di OCR dalle prime tre misurazioni.
   Nota: Massima respirazione è il più alto valore di OCR dopo iniezione FCCP.
5. Per il calcolo di produzione di ATP, sottrarre la media dei tre punti di misurazione OCR dopo l'iniezione Oligomycin A da respirazione basale. Calcolare la capacità di riserva come la massima respirazione meno la respirazione basale.
   Nota: Sempre calcolare la massima respirazione dal più alto valore di OCR, indipendentemente dalla concentrazione FCCP usata.

Risultati

La figura 3 Mostra le curve dopo glicolisi stress test e misurazioni di test di stress cellulare Mito di blasti leucemici dal BCP-ALL (B-cellula precursore leucemia linfoblastica acuta) e pazienti LMA (leucemia mieloide acuta). Il calcolo dei parametri metabolici da queste misure è anche indicato. 500.000 cellule per pozzetto sono state seminate e tutte le misurazioni sono state fatte in hexaplicates.

Discussione

Il protocollo sopra descritto consente la misurazione dell'attività metabolica valutati dai valori OCR ed ECAR primario blasti leucemici derivate da pazienti con leucemia linfoblastica acuta (tutta) o leucemia mieloide acuta (AML). Il vantaggio di misura utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare è che consente il rilevamento del profilo metabolico in tempo reale in cellule vive. Essenzialmente, ogni passo nel protocollo fornito può essere regolata a seconda del tipo di cella che si intende studiare. Qui, di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco, ThermoFisher Scientific	61870-010
Fetal Bovine Serum	Biosera	FB-1001/100
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco, ThermoFisher Scientific	15240-062
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-100G
Oligomycin A	Sigma-Aldrich	75351-5MG
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich	D8375-1G
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920-10MG
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-100ML
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875-1G
Antimycin A from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	A8674-25MG
Seahorse XF Base Medium, 100 mL	Agilent Technologies	103193-100
L-glutamine solution, 200 mM	Sigma-Aldrich	G7513-100ML
HEPES solution, 1 M, pH 7.0-7.6	Sigma-Aldrich	H0887-100ML
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280-25G
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153-10G
Ficoll-Paque Plus	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Density gradient medium
Seahorse XFp FluxPak	Agilent Technologies	103022-100
Corning™ Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	ThermoFisher Scientific	CB40240
Seahorse Analyzer XFp	Agilent Technologies	S7802A
Seahorse XFp Cell Culture Miniplate	Agilent Technologies	103025-100