Induzione e la valutazione di Inbreeding croci utilizzando la formica, Vollenhovia Emeryi

Riepilogo

In questo protocollo, vengono descritti metodi per lo svolgimento di consanguineità croci e per valutare il successo di quelle croci, per la formica Vollenhovia emeryi. Questi protocolli sono importanti per esperimenti volti a comprendere le basi genetiche dei sistemi di determinazione del sesso in imenotteri.

Abstract

Le componenti genetiche e molecolari della cascata della determinazione del sesso sono stati studiati estesamente nell'ape da miele, mellifera di Apis, un organismo di modello dell'ordine dei Hymenoptera. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa i meccanismi di determinazione del sesso trovati altri taxa dell'ordine dei Hymenoptera non-modello, quali le formiche. A causa della natura complessa dei cicli di vita che si sono evoluti in specie dell'ordine dei Hymenoptera, è difficile da mantenere e condurre incroci sperimentali tra questi organismi in laboratorio. Qui, descriviamo i metodi per lo svolgimento di consanguineità croci e per valutare il successo di quelle croci in formica Vollenhovia emeryi. Indurre la consanguineità in laboratorio utilizzando V. emeryi, è relativamente semplice a causa della biologia unica della specie. In particolare, questa specie produce androgenetica maschi e femminile coevoluzione polimorfismo di ala, che semplifica l'identificazione dei fenotipi in incroci genetici per mostre. Inoltre, valutare il successo di consanguineità è semplice come i maschi possono essere prodotte continuamente di consanguineità croci, mentre maschi normali appaiono solo durante la stagione riproduttiva ben definita nel campo. Il nostro protocollo consentono utilizzando V. emeryi come un modello per studiare la base genetica e molecolare del sistema di determinazione del sesso nella specie di formiche.

Introduzione

Taxa eusociali artropodi, come le formiche e le API, hanno evoluto un sistema di sesso-determinazione di haplodiploid in cui gli individui che sono eterozigoti alla determinazione del sesso complementare uno o più loci (CSD) diventano femmine, mentre quelli che sono omo - o hemizygous diventare maschi (Figura 1A)¹.

Componenti genetiche e molecolari coinvolti nella cascata di determinazione del sesso sono state ben studiate nell'ape da miele, mellifera di Apis, un modello dell'ordine dei Hymenoptera organismo^2,3,4. Genomica comparativa le indagini recenti suggeriscono che le formiche e le API da miele condividono molti presunti omologhi nella via di determinazione del sesso, come ad esempio il gene di determinazione del sesso iniziale, csd⁵. Tuttavia, la prova per la conservazione funzionale di questi omologhi di manca ancora in formiche.

Per risolvere questo problema, linee di consanguineità devono essere sviluppate come essi sono essenziali per la mappatura genetica e gli studi molecolari. Tuttavia, è difficile da mantenere e condurre incroci sperimentali tra questi organismi in laboratorio a causa della natura complessa dei cicli di vita che si sono evoluti.

Qui, usiamo Vollenhovia emeryi come modello per studiare le basi genetiche e molecolari del sistema di determinazione del sesso in formiche^6,7. Le linee di consanguineità di questa specie sono state sviluppate in precedenza per il mapping del sollevatore di loci di carattere ereditario quantitativo (QTL) per tratti relazionati alla determinazione del sesso per la prima volta in formiche⁶. Inoltre, la cascata molecolare di determinazione del sesso è stato indagato⁷. Questa specie si è evoluto un sistema di riproduzione insolita che impiega sia gynogenesis e androgenesis (Figura 1B)^8,9. La maggior parte delle nuove regine e i maschi sono clonally prodotte dai genomi materni e paterni, rispettivamente. Inoltre, i lavoratori e alcune regine sono prodotti sessualmente⁸. Questo sistema di riproduzione è particolarmente adatto per studi genetici, perché le croci di consanguineità prodotte utilizzando sessualmente produssero regine ed i maschi sono geneticamente equivalenti a un reincrocio classico. Dato che sessualmente prodotte regine differiscono morfologicamente da queens prodotta da genomi materno¹⁰ (Figura 1B), lo svolgimento e la valutazione di consanguineità croci è notevolmente semplificata utilizzando questo metodo.

In questo articolo, i metodi per la creazione di colonie di laboratorio per test di attraversamento, applicazione di consanguineità attraversa utilizzando coppie di pieno-sib e valutare il successo di quelle traverse mediante genotipizzazione dei membri della Colonia e la dissezione della prole maschio gli organi genitali sono descritti in V. emeryi.

Indipendentemente dal sistema di riproduzione impiegato, applicazione di consanguineità croci è spesso il primo passo essenziale in qualsiasi indagine di sistemi di determinazione del sesso negli imenotteri. Ad esempio in Cardiocondyla obscurior, la quasi completa assenza di maschi diploidi dopo 10 generazioni di pieno-sib accoppiamento in laboratorio dimostra assenza di CSD locus¹¹. È possibile prevedere il numero di loci CSD dal rapporto tra maschi prodotta in consanguineità croci^6,12,13.

Protocollo

1. raccolta e manutenzione delle colonie di V. Emeryi nel laboratorio di campo

Nota: Nidi di V. emeryi si trovano in putrefazione decadente caduti foreste secondarie branchesin albero in tutto il Giappone e registri. Questa specie presenta due tipi di colonie, vale a dire, (1) colonie producendo solo regine dalle ali lunghe e (2) le colonie producono principalmente breve-alato regine oltre al piccolo numero di regine dalle ali lunghe^8,14. In questo protocollo, abbiamo raccolto quest'ultimo tipo di colonie nella Prefettura di Ishikawa, Giappone.

1. Raccogliere V. emeryi colonie durante l'inizio dell'estate.
   Nota: Per ottenere un numero sufficiente di individui sessuali durante la stagione riproduttiva, le colonie che contengono più di 300 individui sono preferite.
2. Trasferire gli esemplari di formica dai rami raccolti per un nido di gesso artificiale con una copertura di vetro utilizzando un aspiratore (Figura 2, sinistra).
3. Mantenere colonie nel nido artificiale a 25 ° C in un ciclo di luce/buio di 16:8 h. Fornire l'acqua del rubinetto con una spruzzetta per bagnare l'intonaco.
   1. Aggiungere circa 100 mg di polvere secca Grillo avvolta in carta stagnola e una punta di acqua zucchero di canna (20 µ l punta) ogni altro giorno fino a quando emergono nuove coevoluzione (F₁ alato-regine e F₁ maschi).

2. sperimentale laboratorio croci

Nota: Nuovi coevoluzione iniziano ad emergere dalla tarda estate all'autunno (Figura 3). Long-alato regine sono prodotte sessualmente, e breve-alato regine sono prodotti clonally ed hanno il genoma materno (Figura 1). Utilizzare lungo-alato regine e maschi per consanguineità croci.

1. Per fermare le persone da spostare, inserire colonie in camera un ambiente costante a 4 ° C per 15 min.
2. Rimuovere la metà gambe di 30 lavoratori utilizzando pinze sotto un microscopio stereoscopico e trasferirli nel nuovo nido intonaco più piccolo (Figura 2, destra) per consanguineità croci.
   Nota: Le gambe vengono rimossi per distinguere i lavoratori presenti da parte dei lavoratori che saranno prodotte dalle croci successivi incroci.
3. Aggiungere 3-4 larve o pupe in un nido di gesso contenente i lavoratori.
   Nota: I lavoratori mostrano attività esplorativa della colonia di regine-meno di₀ F. Larve o pupe possono efficacemente attrarre questi lavoratori e coevoluzione di nuovi al centro della Colonia durante test di incrocio. Di conseguenza, conservare le condizioni della Colonia sperimentale vicino alla colonia normale.
4. Trasferire una regina dalle ali lunghe e un uomo in un nido di gesso preparato nel passaggio 2.3 per consanguineità croci.
5. Mantenere colonie a 25 ° C in un ciclo luce/buio 16:8 h con cibo e acqua fornita come descritto al punto 1.3 fino a quando la Regina perde le sue ali e deporre le uova.
   Nota: Questo richiede una settimana a un mese.
6. Verificare la Colonia sperimentale ogni giorno sotto un microscopio stereoscopico. Dopo esecuzione di consanguineità attraversa tra la prole di₁ F, uova possono essere osservate sotto un microscopio stereoscopico.
7. Dopo la F₁ Regina inizia a deporre le uova, togliere i maschi di F₁ e larve o pupe aggiunti nel passaggio 2.3 dal nido per evitare il mescolamento della generazione₁ F (maschi e femmine utilizzate per consanguineità croci) e la generazione di₂ F (prole prodotto da incroci di consanguineità).
   Nota: Se ci sono pochi maschi nella Colonia, è possibile indurre consanguineità croci utilizzando un maschio e 1-3 queens nella stessa colonia sperimentale.
8. Mantenere colonie sotto il conditionsas stesso descritto al punto 1.3, fino a quando emergono prole₂ F.
   Nota: Trasferimento F₁ Regina e prole₂ F in nuovo nido intonaco più grande (Figura 2, sinistra) per la conservazione a lungo termine di Colonia.

3. valutazione del successo di Inbreeding

1. Estrazione del DNA e la genotipizzazione della generazione parentale (F₀)
   1. Rimuovere una gamba di una regina di₀ F usando il forcipe e trasferire la gamba in una microprovetta 1,5 mL contenente 100 µ l di agente di chelazione.
   2. Microscopio stereoscopico, sezionare un addome femminile in piatto di vetro riempito con 300 µ l di acqua ultrapura usando il forcipe e isolare la spermateca contenenti lo sperma dai maschi accoppiati.
   3. Togliere il tessuto della spermateca e isolare lo sperma dal tessuto della femmina mediante spilli entomologici.
      Nota: Per facilitare l'estrazione dello sperma dalla spermateca, conservare esemplari femminili in 100% EtOH per più di un giorno prima della dissezione.
   4. Usando una micropipetta, trasferire lo sperma in una microprovetta 1,5 mL contenente 100 µ l di agente di chelazione.
   5. Incubare i campioni della Regina₀ F e spermatozoi preparati al punto 3.1.1 e 3.1.3, rispettivamente, a 95 ° C per 20 min. Flash Centrifugare la provetta e conservare a 4 ° C.
   6. Genotipo tutti i campioni usando il metodo descritto altrove⁴.
2. Estrazione del DNA dalla coppia di formiche utilizzate per consanguineità Croci (F₁)
   1. Dopo conferma la produzione di uova da sib accoppiato Regina₁ F, è possibile estrarre il DNA della Regina usando le sue ali di capannone o una metà gamba e genotipo con stesso metodo descritto nella sezione 3.1 sopra.
   2. Estrarre il DNA di F₁ maschio utilizzando una gamba e genotipo li utilizzando stesso metodo descritto nella sezione 3.1 sopra.
      Nota: I campioni possono essere conservati in 100% EtOH prima dell'estrazione del DNA e DNA nell'agente di chelazione può essere conservato per due mesi a 4 ° C.
3. Valutazione della fertilità maschile nei maschi prodotta da consanguineità croci
   Nota: I maschi diploidi prodotti da incroci di consanguineità sono spesso sterili.
   1. La dissezione interni organi riproduttivi in un piatto di vetro con 400 µ l di soluzione di PBS usando il forcipe.
   2. Rimuovere PBS e aggiungere 4% paraformaldeide (PFA) utilizzando una micropipetta.
   3. Difficoltà il tessuto incubando in PFA per 30 min a temperatura ambiente (15-25 ° C).
   4. Lavare il tessuto 5 volte con 400 µ l di PBS utilizzando una micropipetta.
   5. Diluire la soluzione (DAPI) 6-diamidino-2-phenylindole a 1 µ g/mL in PBS, 4'.
   6. Rimuovere PBS e aggiungere circa 300 µ l di questa soluzione diluita di colorazione DAPI al tessuto.
   7. Incubare per 15 minuti sotto condizione di buio a temperatura ambiente (15-25 ° C).
   8. Lavare il tessuto 5 volte con 400 µ l di PBS e trasferimento del tessuto sul centro di vetro diapositiva usando il forcipe.
   9. Montare del tessuto sul montaggio Media contenente falloidina TRITC tetrametilrodamina-coniugati.
   10. Osservare i campioni utilizzando 20x o 63 X lenti dell'obiettivo del microscopio a scansione confocale del laser.
   11. È possibile utilizzare un laser di eccitazione 405 nm e un rivelatore ibrido a 410-530 nm per il rilevamento di DAPI.
   12. È possibile utilizzare un laser di eccitazione 561 nm e un rivelatore ibrido a 565-650 nm per il rilevamento di TRITC.
   13. Utilizzare una velocità di scansione di 400 Hz (400 linee/s) a una risoluzione a 1024 × 1024 pixel.
   14. Catturare immagini utilizzando una piattaforma software.

Risultati

Analisi del microsatellite utilizzando F₀ e F₁ generazioni è emerso che la consanguineità croci sono state prodotte con successo (Figura 4)⁶. Come risultato di consanguineità croci, regine accoppiate sono state ottenute entro un mese di stabilire colonie incrocio sperimentale. Un quarto (27,1 ± 8,91% SD) di tutta la prole (F₂) dalle croci di consanguineità era maschio, mentre il resto era donna (la...

Discussione

Questo articolo viene illustrato protocolli che possono essere utilizzati per indurre la consanguineità croci e valutare l'avvenimento di inincroci avvenuti nella formica V. emeryi. Negli esperimenti, genotipizzazione degli individui utilizzati per gli incroci è necessaria garantire che la consanguineità Croci hanno avuto successo. Tuttavia, l'efficacia di questi test di incrocio è chiaramente evidente come maschi diploidi possono essere prodotta durante tutto l'anno, mentre i maschi aploidi possono essere p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plaster powder	N/A	N/A	Any brand can be used
Charcoal, Activated, Powder	Wako	033-02117,037-02115
Slide glass	N/A	N/A	Any brand can be used
Dry Cricket diet	N/A	N/A	Any brand can be used
Brown shuger	N/A	N/A	Any brand can be used
Styrene Square-Shaped Case	AS ONE	Any size	Size varies by number of ants
Incbator			Any brand can be used
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1B	TAITEC	0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottom	WATSON	131-715CS
Ethanol (99.5)	Wako	054-07225
Stereoscopic microscope	N/A	N/A	Any brand can be used
Forseps	DUMONT	0108-5-PO
Chelex 100 sodium form	SIGMA	11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4	TaKaRa	T9181
Paraformaldehyde	Wako	162-16065
-Cellstain- DAPI solution	Dojindo Molecular Technologies	D523
ABI 3100xl Genetic Analyzer	Applied Biosystems		Directly contact the constructor formore informations.
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATER	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica HyDTM	Leica		Directly contact the constructor formore informations.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Directly contact the constructor formore informations.