In Vitro Metodo di controllo delle concentrazioni di gas alogenati in cellule epiteliali alveolari coltivate

Riepilogo

Descriviamo un protocollo facile specificamente progettato per raggiungere le concentrazioni precise e controllate del sevoflurano o isoflurano in vitro al fine di migliorare la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nel danno epiteliale polmonare e per testare il romanzo terapie per la sindrome da distress respiratorio.

Abstract

Sindrome da distress respiratorio (ARDS) è una sindrome di ferita alveolare diffusa con lo spazio fluido alveolare alterato e infiammazione severa. L'uso di agenti alogenati, quali sevoflurano o isoflurano, per la sedazione di pazienti in unità di cure intensive (ICU) può migliorare lo scambio di gas, ridurre l'edema alveolare e attenuare l'infiammazione durante ARDS. Tuttavia, mancano dati sull'uso di agenti inalati per continuo sedazione in terapia intensiva per trattare o prevenire danni ai polmoni. Per studiare gli effetti degli agenti alogenati su cellule epiteliali alveolari in condizioni "fisiologiche", descriviamo un facile sistema di cellule di coltura all'interfaccia aria-liquido e li espongono agli agenti alogenati per fornire le frazioni preciso "aria" e concentrazioni di "medium" per questi agenti. Abbiamo sviluppato una camera sigillata ermeticamente in cui piastre con cellule immortalizzate epiteliali alveolari umane potrebbero essere esposti a una frazione di precisa, controllata del sevoflurano o isoflurano utilizzando un flusso continuo di gas fornito da un circuito di macchina dell'anestetico. Le cellule sono state esposte al 4% del sevoflurano e 1% di isoflurane per 24 ore. Spettrometria di massa di gas è stata effettuata per determinare la concentrazione di agenti alogenati dissolto nel mezzo. Dopo la prima ora, le concentrazioni di sevoflurano e isoflurano in mezzo erano 251 mg/L e 25 mg/L, rispettivamente. Le curve che rappresentano le concentrazioni di sevoflurano e isoflurano dissolto nel medium ha mostrato corsi simili nel corso del tempo, con un plateau raggiunto ad un'ora dopo l'esposizione.

Questo protocollo è stato specificamente progettato per raggiungere le concentrazioni precise e controllate del sevoflurano o isoflurano in vitro per migliorare la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nel danno epiteliale polmonare durante ARDS e testare nuove terapie per la sindrome.

Introduzione

Sindrome da distress respiratorio (ARDS) è una sindrome clinica caratterizzata da danno alveolare diffuso, l'edema polmonare e guasto respiratorio hypoxemic. Anche se ARDS rappresenta più del 10% dei ricoveri in unità di cure intensive (ICU) e quasi il 25% dei pazienti di ICU che richiedono ventilazione meccanica, è ancora una sfida sotto-riconosciuto per i medici, con un tasso di mortalità di ospedale di 35-45%¹. Nonostante l'intenso lavoro di ricerca, l'identificazione di un'efficace terapia farmacologica di ARDS o di prevenzione non ha data. Due caratteristiche principali contribuiscono alla mortalità nell'ARDS: alterato lo spazio fluido alveolare (AFC) (cioè, l'alterato riassorbimento del fluido edema alveolare da spazi aerei polmonari distali) e grave infiammazione². Poiché ARDS la mortalità rimane alta, iniziative in corso dovrebbero includere anche la prevenzione primaria; Tuttavia, una sfida chiave consiste nell'identificare pazienti a rischio nel quale ARDS è probabile sviluppare e che potrebbero trarre vantaggio se ARDS sono stati impediti.

Anestetici alogenati volatili, quali sevoflurano e isoflurano, sono ampiamente utilizzati per fornire anestesia generale in sala operatoria. In tutto il mondo, più di 230 milioni i pazienti sottoposti a chirurgia maggiore ogni anno richiedono l'anestesia generale e ventilazione meccanica³e complicanze polmonari postoperatorie influenzano negativamente gli esiti clinici e sanitario utilizzazione⁴ . L'uso del sevoflurano invece di propofol è stata associata con infiammazione polmonare migliorata nei pazienti sottoposti a chirurgia toracica e diminuzioni significative negli eventi avversi, quali ARDS e complicanze polmonari postoperatorie⁵. Similmente, il pretrattamento con isoflurano hanno avuti effetti protettivi sulla meccanica respiratoria, l'ossigenazione ed emodinamica in modelli sperimentali animali di ARDS^6,7. Anche se ulteriori studi sono autorizzati ad per affrontare l'impatto degli agenti inalati sui risultati in chirurgia del noncardiac, una simile diminuzione nelle complicazioni polmonari è stato recentemente osservata in una meta-analisi, dimostrando che inalato agenti anestetici — come si oppose all'anestesia endovenosa — sono significativamente associati con una riduzione della mortalità per cardiochirurgia⁸.

Mancano dati prospettici specifici circa l'uso di agenti volatili per la sedazione di pazienti in terapia intensiva per prevenire o curare i danni ai polmoni. Tuttavia, parecchie prove ora supportano l'efficacia e la sicurezza del sevoflurano inalato per la sedazione di pazienti in terapia intensiva, e gli studi preclinici hanno dimostrato che il sevoflurano inalato e isoflurano^7,9 migliorare lo scambio di gas, ridurre l'edema alveolare e attenuare l'infiammazione nei modelli sperimentali di ARDS. Inoltre, sevoflurano mitiga tipo II delle cellule epiteliali danno¹⁰, considerando che isoflurano mantiene l'integrità della barriera alveolo-capillare attraverso la modulazione della stretta della giunzione proteina¹¹. Tuttavia, ulteriori studi sono necessari per verificare in quale misura la prova sperimentale di protezione dell'organo da sevoflurano inalato e isoflurano può essere tradotto in esseri umani. Un primo singolo centro controllato-studio randomizzato (RCT) dal nostro gruppo trovato che uso precoce di sevoflurano inalato in pazienti con ARDS è stato associato con una migliore ossigenazione, ridotti livelli di alcuni indicatori pro-infiammatori ed epiteliale polmonare ridotta danni, come valutato dai livelli della forma solubile del recettore per i prodotti finiti avanzati di glycation (sRAGE) nel plasma e alveolare fluid¹².

Presi insieme, gli effetti benefici di sevoflurano e isoflurano sulla lesione del polmone potrebbero puntare a più vie biologiche o processi funzionali che dipendono la via di rabbia, vale a dire lo spazio fluido alveolare (AFC), lesioni epiteliali, traslocazione del fattore nucleare (NF)-κB e l'attivazione del macrofago. Inoltre, sevoflurano può influenzare l'espressione della proteina rabbia stessa. Poiché la ricerca precedente dal nostro team di ricerca e altri supporta ruoli cardine per RAGE in alveolare infiammazione e lesioni/riparazione epiteliale del polmone durante ARDS, abbiamo progettato un modello sperimentale per fornire una comprensione traslazionale dei meccanismi di sevoflurano in polmone lesione e riparazione^13,14,15. Sono stati studiati gli effetti in vitro del sevoflurano e isoflurano in una romanzo umano alveolare primaria linea cellulare epiteliale specificamente progettata per studiare la barriera aria-sangue del polmone periferico, hAELVi (LentiVirus epiteliale alveolare umano immortalata), con caratteristiche di tipo alveolare-come cui giunzioni strette funzionale¹⁶.

Mentre si prepara il design delle nostre indagini in vitro (ad esempio, colture di cellule epiteliali alveolari all'interfaccia aria-liquido con l'esposizione a "inalazione" sevoflurano o isoflurano, abbiamo capito da precedentemente pubblicati studi che frazioni di sevoflurane sono state valutate solo a "aria" interfaccia^17,18,19 utilizzando monitor standard (simili a quelli usati in una regolazione clinica). Le concentrazioni di alogenati agente solitamente sono stati scelti in base ai valori di concentrazione minima alveolare (MAC) (per esempio, in esseri umani, per sevoflurano, 0,5, 1.1 e 2.2 vol %, che rappresenta 0,25, 0,5 e 1 MAC, rispettivamente; per isoflurano, 0.6, 0.8, e vol 1,3% che rappresenta 0,25, 0,5 e 1 MAC, rispettivamente)²⁰. Infatti, le concentrazioni di sevoflurano e isoflurano mai sono state studiate nel terreno di coltura, limitando così la validità dei modelli/strumenti sperimentali precedenti. Inoltre, maggior parte degli esperimenti utilizzato un vaso anaerobico che è stato sigillato dopo l'aria miscela contenente sevoflurano era stato svuotato all'interno. Come il nostro obiettivo era di studiare le cellule epiteliali alveolari in condizioni "fisiologiche", abbiamo creduto che tale stato anaerobico potrebbe non essere ottima e non sarebbe compatibile con durate lunghe sperimentale. Pertanto, abbiamo sviluppato il nostro sistema a celle di cultura all'interfaccia aria-liquido ed esporli ad agenti alogenati (sevoflurano e isoflurano) con l'obiettivo di fornire precisa controllata frazioni "aria" e "medie" concentrazioni per questi agenti. A nostro parere, questa fase sperimentale, che non è stata segnalata finora nella letteratura, è obbligatoria prima di eventuali ulteriori indagini in vitro di sevoflurano e isoflurano.

Protocollo

1. la cultura delle cellule epiteliali alveolari (hAELVi)

1. Lo scongelamento
   1. Dispensare 4 mL di medium di coltivazione ready-to-use umano alveolare epiteliali (huAEC) in un tubo di plastica da 15 mL e scongelare rapidamente il flacone in un bagno di acqua preriscaldata (37 ° C).
   2. Trasferire la sospensione cellulare scongelati in una provetta di plastica di 15 mL contenente 4 mL di terreno prima centrifugazione il tubo a 200 x g per 5 min.
   3. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 5 mL di medium di coltivazione. Quindi, è possibile trasferire le cellule in un pallone di T25.
   4. Coltivare le cellule in condizioni standard (5% CO₂, 95% umidificata aria, 37 ° C)
2. Scissione
   1. Controllare lo stato delle cellule microscopicamente. Quando le cellule sono 80-90% confluenti, dividere le celle, 1.2.2 attraverso 1.2.10 come segue.
   2. Aspirare i media di coltura delle cellule con una pipetta sterile.
   3. Lavare le cellule una volta con 4 mL di Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) ed aspirare il DPBS.
   4. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina/EDTA (TE) per le cellule prima dell'incubazione a 37 ° C per 3 minuti fino a quando le cellule iniziano a staccare; Verifica per distacco sotto un microscopio.
   5. Risospendere le cellule con 2 mL di terreno di coltura e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min. Quindi, aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare nuovo con 3 mL di medium di coltivazione.
   6. Utilizzare il test di esclusione del colorante blu trypan per determinare la vitalità delle cellule. Prendere 30 µ l di sospensione cellulare e aggiungere 30 µ l di una soluzione di 0,4% di trypan blu in un tubo. Dopo di che, efficacemente miscelare la soluzione 3 - 5 volte usando una pipetta 100 µ l. Prendere 10 µ l della soluzione e lo mettiamo sotto il vetrino coprioggetto dell'emocitometro.
   7. Contare il numero totale di cellule vitali sia il numero di cellule morte (blu) nelle aree dell'emocitometro. Quindi, calcolare l'attuabilità delle cellule [%] utilizzando l'equazione: vitalità cellulare = 100 – (100 / numero totale di cellule x numero di cellule morte)
   8. Trasferire l'aliquota con il pellet cellulare sedimento un matraccio di T25 di cultura cellulare nuovo o una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere il mezzo di coltura le cellule per raggiungere un totale di 5 mL di medium di coltivazione nel matraccio T25, o 1 mL per ciascun pozzetto della piastra di ben 6.
   9. Coltivare le cellule in un incubatore in condizioni standard (5% CO₂, 95% umidificata aria, 37 ° C)
   10. Una volta che le cellule sono completamente confluenti, sono pronti per l'esperimento.

2. preparazione di una camera stagna

Nota: Il piano di costruzione per la camera di tenuta d'aria è raffigurato in Figura 1.

1. Utilizzare una scatola ermetica in polipropilene con una capacità di 6,5 L. La lunghezza, la larghezza e l'altezza sono 30 x 20 x 15,5 cm, rispettivamente. Siete pregati di notare che il volume della scatola è inferiore al volume teorico a causa gli angoli arrotondati.
2. Praticare un foro del diametro di 2,5 cm sul lato inferiore della parete laterale.
3. Inserire un tubo corrugato con un contrassegno verde, che servirà come il tubo di ingresso miscela gas-aria e sigillare con silicone.
4. Praticare un foro di diametro 2,5 cm secondo sul lato superiore della parete laterale opposta.
5. Inserire un altro tubo corrugato con un contrassegno rosso e collegarlo con un filtro di carbone di legna, che servirà come il tubo di uscita miscela gas-aria e sigillare con silicone.
6. Praticare un foro di diametro 4mm stretto al centro della parete media della scatola.
7. Inserire tubo infusione breve collegato ad un collettore con un rotante maschio luer-lock, che sarà collegato in un analizzatore di gas e sigillare con silicone.
8. Posto un termometro/igrometro digitale all'interno della camera stagna.

3. esporre le cellule epiteliali alveolari agli agenti alogenati (sevoflurano e isoflurano)

Nota: Lo schema di massima del dispositivo è raffigurato in Figura 2.

Attenzione: Sebbene gli studi sugli animali non hanno rivelato alcuna evidenza di alterata fertilità o di danno fetale, e uno studio molto piccolo durante cesarei non ha mostrato effetti spiacevoli per la madre o il feto, la sicurezza dell'utilizzo di derivati alogenati (ad es., agenti sevoflurano o isoflurano) durante il travaglio e il parto non è stata dimostrata fino ad oggi. Inoltre, i dati non controllati sono stati raccolti durante le gravidanze umane. Pertanto, effettuando esperimenti utilizzando sevoflurane o isoflurano mentre incinte dovrebbero essere fortemente scoraggiate.

1. Lavorare sotto una cappa di laboratorio.
2. Personalizzare un circuito di macchina dell'anestetico per passare la tubazione del gas di ossido di diazoto da anidride carbonica (CO₂).
3. Collegare la camera di tenuta d'aria con il tubo ondulato, verde-contrassegnati il circuito della macchina su misura dell'anestetico. Inserire un umidificatore riscaldato (come quelle utilizzate su ICU ventilatori) nel tubo tra la macchina dell'anestetico e la camera di tenuta d'aria per riscaldare la miscela di flusso del gas a circa 37 ° C
4. Installazione del cilindro aria-stretto su un piatto caldo, fornendo un riscaldamento piastra temperatura di 37° C.
5. Mettere il 6-pozzetti contenenti le cellule hAELVI nella tenuta d'aria dell'alloggiamento e sigillare il coperchio.
6. Regolare la portata del gas (cioè, la miscela di aria e CO₂) per ottenere subito le condizioni standard, definite come 5% di CO₂ e 95% di aria umidificata.
7. Aprire l'evaporatore alogenati agente e scegliere la percentuale desiderata (nello studio presente, la testata concentrazioni di sevoflurano e isoflurano erano 4% e l'1%, rispettivamente).
8. Nota la composizione della concentrazione di miscela e il sevoflurano o isoflurano gas come misurata da un analizzatore di gas esterni e visualizzata sullo schermo.
9. Una volta che vengono raggiunti i valori di destinazione, è possibile ridurre il tasso di flusso di gas fresco a 1 L/min.
10. La camera di tenuta d'aria può essere mantenuta con la portata di gas, il tempo necessario per l'esperimento.

4. misurare il sevoflurano o isoflurano mediante cromatografia

1. Preparazione dei campioni
   1. In diversi momenti, molto brevemente aprire la camera a prendere fuori i campioni studiati (nello studio presente, abbiamo usato una piastra a 6 pozzetti) e chiudere il coperchio. Mantenere gli altri esempi nella finestra. Quindi, aspirare 1 mL di terreno contenuto in ogni campione con una micropipetta regolabile multi-volume.
   2. Inserire il supporto nei flaconi di cromatografia dello spazio di testa da 10 mL, che devono essere avvitati ermeticamente stretto con un tappo in Teflon-sigillato. Congelare le fiale di cromatografia a-20 ° C se non li usate immediatamente.
   3. Preparare una soluzione stock di sevoflurane e un'altra soluzione stock di isoflurane, entrambi a 50 g/L in metanolo. Contemporaneamente, preparare una soluzione stock di cloroformio (standard interno, IS) a 2 g/L in metanolo. Memorizzare tutte le soluzioni standard a-20 ° C.
   4. Preparare soluzioni di lavoro di sevoflurano e isoflurano a 50, 500 e 5000 mg/L in acqua ultrapura/dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). Per standardizzazione interna, la soluzione di lavoro è fissata a 100 mg/L in metanolo.
2. Analisi di campioni cellulari
   Nota: La procedura di estrazione è basata sul metodo precedentemente convalidato di gas cromatografia e spettrometria di massa da Bourdeaux et al. ¹ e utilizza gli stessi parametri di sensibilità e specificità. Sevoflurano e cloroformio (IS) sono stati utilizzati nel presente protocollo, e isoflurane è stata associata con il metodo di analisi multiparametrico. Brevemente, per l'acquisizione di spettrometria di massa, il metodo è stato sviluppato dopo l'iniezione di soluzione pura. Quindi, m/z è stata confermata con norme di riferimento e dati della letteratura. Tre m/z sono stati selezionati per ciascun analita (ad eccezione di IS): uno m/z per quantificazione (il più abbondante e più alto), per cui l'abbondanza è stata calcolata integrando l'area sotto la curva per la quantificazione e due m/z per conferma. Utilizzando tre m/z, analiti potrebbero essere specificamente identificati perché tutti m/z ha avuto il tempo di ritenzione stesso, come pure perché tutti gli importi di m/z (parente di ioni conferma vs quantificazione) erano gli stessi nello standard puro e in tutti i campioni. Con questa modalità di acquisizione, analiti potrebbero essere individuati e quantificati con buona specificità.
   1. Costruire un curve di 8 punti di calibrazione con le gamme di concentrazione di 0,5-400 mg/L e più qualità controlli (0,5, 1, 5, 10, 20, 75, 200 e 400 mg/L).
      Nota: Per convalidare ogni calibrazione, quattro controlli di qualità sono stati utilizzati: il limite inferiore di quantificazione (C1 = 0,5 mg/L), due intermedi livelli (C2 = 20 mg/L e C3 = 75 mg/L) e il livello finale (C4 a 400 mg/L; superiore livello di quantificazione). Tutte le norme e i controlli sono stati analizzati in matrici di cellule in coltura per evitare l'effetto matrice. Per ogni curva di calibrazione, una matrice vuota è stata analizzata per convalidare che non c'era nessuna interferenza con colta standard cellulare e interna.
   2. Preparare una soluzione stock di sevoflurane e un'altra soluzione stock di isoflurane, entrambi a 50 g/L in metanolo. Contemporaneamente, preparare una soluzione stock di cloroformio (standard interno, IS) a 2 g/L in metanolo. Memorizzare tutte le soluzioni standard a-20 ° C. Quindi, preparare soluzioni di lavoro di sevoflurane/isoflurane mista a 50, 500 e 5000 mg/L in acqua ultrapura / dimetil sulfoxyde (50/50; v/v). Per IS, la soluzione di lavoro viene diluita a 100 mg/L in metanolo.
   3. Per le curve di calibrazione e controlli, è necessario preparare i campioni di spiking 50 µ l di IS (100 mg/L) in 1 mL delle matrici campione cellulare.
   4. Preparare soluzioni campione con 200 µ l di soluzione acquosa satura di cloruro di sodio in un tubo di headspace 10ml, avvitato ermeticamente con un tappo in Teflon-sigillato.
3. Gas cromatografia e spettrometria di massa
   1. Per le analisi del campione, è possibile utilizzare iniezioni di spazio di testa in una gas cromatografia, accoppiata con il metodo di rilevazione di masse.
   2. Portare tubi dello spazio di testa per 10 min a 80 ° C con un agitatore di riscaldatore. Quindi, ritirare e iniettare il gascromatografo di 1,5 mL di gas campione. Impostare il parametro dell'iniettore a 260 ° C con una portata di Spalato al 100 mL/min per 2 min all'inizio della corsa di cromatografia.
   3. Utilizzare iniettore Split/splitless con una pressione di modalità programmata di vettore. In primo luogo, tenere la pressione del gas a 40 kPa per min 0,15. Quindi, aumentare la pressione di programma di tasso a 150 kPa a 125 kPa/min prima di impostare una velocità di 16 kPa/min 300 kPa pressione per 5 min.
   4. Simultanea all'iniezione, iniziare con una temperatura del forno di 60 ° C per 1 min e aumento fino a quando si raggiunge una temperatura di 140 ° C a una velocità di 20 ° C/min. Fino a 250 ° C si ottiene, quindi, di aumentare la temperatura nuovamente. Il tempo totale della corsa è di 7 min.
   5. Effettuare la separazione cromatografia utilizzando una colonna capillare in silice fusa (30 m x 1.4 µm, 0,25 mm ID). Esperimenti di massa con un singolo ione monitoraggio condizione (SIM) e monitorare la quantificazione dello ione m/z 181 e ioni qualifiche m/z 151 e 51 simultaneamente a un tempo di ritenzione (RT) di 2,30 min per sevoflurano, m/z 149 (quantificazione dello ione), m/z 115 e 87 (ione qualifiche) per isoflurano a 2.8 RT min e m/z 83 (quantificazione dello ione) per cloroformio a 3.70 RT min.
   6. Determinare le concentrazioni di sevoflurano e isoflurano in coltura delle cellule dai loro rapporti di zona a quello del si utilizza una misura quadratica di peso. Il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) per sevoflurano e isoflurano era a 0,5 mg/L e il limite di quantificazione (ULOQ) era 400 mg/L.

Risultati

Le concentrazioni del sevoflurano e isoflurano, che sciolto in mezzo nel corso del tempo, sono riportate nella tabella 1 e tabella 2, rispettivamente.

I corsi delle concentrazioni di sevoflurano e isoflurano in mezzo erano simili nel corso del tempo. Immediatamente dopo che è stata impostata la necessaria concentrazione di agente alogenati, concentrazioni è aumentato durante la prima ora. Un a...

Discussione

Il nostro protocollo descrive un metodo semplice per esporre le cellule ad una precisa frazione di un agente anestetico alogenato, quali sevoflurano o isoflurano. Inoltre, segnaliamo qui — per la prima volta — una correlazione rigorosa tra la frazione di gas sia la concentrazione di sevoflurano e isoflurano dentro il terreno di coltura stessa. Questo passaggio fondamentale permette di utilizzare in modo sicuro la nostra camera stagna per studiare gli effetti di questi agenti alogenati in un monostrato colto delle cel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sevoflurane	Baxter		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Isoflurane	Virbac		Performing experiments using sevoflurane or isoflurane while being pregnant should be strongly discouraged
Human Alveolar Epithelial cells	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medium (ready-to-use)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Anesthetic machine circuit	Drager	Fabius
Gas analyzer	Drageer	Vamos Plus
Anesthetic gas filter	SedanaMedical	FlurAbsord
Heated Humifier	Fisher&Paykel	MR850
Chamber	Curver	00012-416-00
Gas chromatography coupled with mass detection	Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA	Trace 1310 with TSQ 8000evo
Fused-silica column (30 m x 1.4 μm, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, France	Rxi-624Sil MS