Ultrasuono ad alta frequenza per l'analisi dello sviluppo fetale e placentare In Vivo

Riepilogo

Qui descriviamo la tecnica degli ultrasuoni ad alta frequenza per l'analisi in vivo dei feti in topi. Questo metodo consente il follow-up dei feti e l'analisi dei parametri placentari come pure il flusso di sangue materno e fetale durante la gravidanza.

Abstract

Formazione immagine di ultrasuono è un metodo diffuso usato per rilevare anomalie organo e tumori in tessuti umani e animali. Il metodo è non invasiva, innocua e indolore, e l'applicazione è facile, veloce e può essere fatto ovunque, anche con dispositivi mobili. Durante la gravidanza, l'imaging ad ultrasuoni come standard viene utilizzato per monitorare attentamente lo sviluppo del feto. La tecnica è importante valutare la restrizione della crescita intrauterina (IUGR), una complicazione della gravidanza con breve e lungo termine conseguenze di salute per la madre ed il feto. Comprensione del processo di IUGR è indispensabile per lo sviluppo di strategie terapeutiche efficaci.

Il sistema a ultrasuoni utilizzato in questo manoscritto è un apparecchio a ultrasuoni prodotto per l'analisi di piccoli animali e può essere utilizzato in vari campi di ricerca, compresa la ricerca di gravidanza. Qui descriviamo l'utilizzo del sistema per l'analisi in vivo dei feti da natural killer (NK) delle cellule/delle cellule di albero (MC)-carenti le madri che partoriscono cuccioli crescita-limitata. Il protocollo comprende la preparazione del sistema, manipolazione dei topi prima e durante le misurazioni e l'utilizzo di B-mode, doppler modalità colore e modo di doppler di onda di impulso. Dimensione fetale, placentare e rifornimento di sangue al feto sono stati analizzati. Abbiamo trovato l'impianto ridotte dimensioni e più piccole placente in topi NK/MC-carenti da metà gestazione in poi. Inoltre, MC/NK-carenza è stata associata all'assenza e invertito il flusso diastolico fine il fetale umbilicalis di Arteria(UmA) e un indice di elevata resistenza. I metodi descritti nel protocollo possono essere utilizzati facilmente per argomenti di ricerca correlati e non correlati.

Introduzione

L'ultrasuono è le onde sonore con frequenze di sopra della gamma udibile dell'orecchio umano, superiore a circa 20 kHz¹. Animali come i pipistrelli, Galles, delfini^2,3,⁴di topi, ratti⁵e mouse lemuri⁶ tutti utilizzare gli ultrasuoni per orientamento o comunicazione. Gli esseri umani prendono vantaggio degli ultrasuoni per diverse applicazioni tecniche e mediche. Un apparecchio a ultrasuoni è in grado di creare l'onda sonora e distribuire e rappresentano il segnale. Se l'ultrasuono incontra un ostacolo, il suono si riflette, assorbito o può passare attraverso di essa. L'applicazione degli ultrasuoni come un metodo di imaging, chiamato l'ecografia, viene utilizzato per l'analisi dei tessuti organici in medicina umana o veterinaria come il cuore (ecocardiografia)^7,8, polmone⁹, ghiandola tiroide¹⁰ , reni¹¹e urinario e riproduttivo^12,13; rilevamento di calcoli biliari¹⁴ e tumori¹⁵; e la valutazione di aspersione di vasi sanguigni o organi^16,17. Ultrasuono è un metodo standard di cura prenatale durante la gravidanza e disabilità dello sviluppo fetale o i danni possono essere riconosciuti presto. In particolare, la crescita di un feto è strettamente monitorata ad intervalli regolari per riconoscere un possibile IUGR. Infine, il flusso di sangue fetale possa essere monitorato, come questo può sottolineare la crescita restrizioni^18,19,20,21.

Un vantaggio importante di formazione immagine di ultrasuono rispetto ad altri metodi come la radiografia è innocuità del suono dei tessuti da analizzare. Questo metodo facile e veloce è non invasiva, indolore e può essere utilizzato un numero di volte. L'esborso iniziale di un apparecchio a ultrasuoni è costoso; Tuttavia, i materiali di consumo necessari sono a buon mercati. Il sistema a ultrasuoni utilizzato in questo manoscritto è adatto per una gamma di modelli animali (cioè, topi e pesce) mentre per gli esseri umani un apparecchio a ultrasuoni richiede una frequenza di 3-15 mHz, una frequenza di 15-70 mHz è richiesta per i topi.

Il presente manoscritto descrive un protocollo per l'utilizzo di B-mode, modo di doppler di colore e modo di doppler di onda di impulso. La descrizione comprende la preparazione dei topi come pure prestazioni, acquisizione dati e archiviazione. Questo metodo è stato ceppi murini applicata con successo per diversi giorni a tutti gestazionale e può essere utilizzato per indagare lo sviluppo fetale e placenta così come i parametri del sangue materno e fetale. Qui, tutte le applicazioni sono spiegate basata sui nostri studi che impiegano incinto topi MC/NK-carenti e controllo.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal "Landesverwaltungsamt Sachsen Anhalt: 42502-2-1296UniMD."

1. procedura sperimentale

1. Compagno di 6 a 8-settimana-vecchio femmina MC-carenti C57BL/6J-Cpa3^{Cre /+} (Cpa3^{Cre /+}) topi e MC-sufficiente C57BL/6J-Cpa3^+/+ (controlli di Colonia; Cpa3^+/+) con i maschi BALB/c.
2. Definire il giorno di gestazione (gd) 0 dopo la conferma della spina vaginale e trattare le femmine immediatamente dopo la conferma di spina.
   Nota: Una spina è lo sperma del maschio nell'orifizio vaginale della femmina.
   1. Iniettare 250 µ l di PBS intraperitonealmente in controllo Cpa3^+/+ femmine.
   2. Iniettare 250 µ l di anti-CD122 (0,25 mg) per via intraperitoneale in MC-carenti Cpa3^{Cre /+} femmine.
      Nota: Un'iniezione di 0,25 mg di anti-CD122 impoverisce NKs periferico e uNKs in Cpa3 MC-carenti^{Cre /+} femmine come descritto in precedenza²².
3. Attendere gd5.
   Nota: Alle gd5, c'è la possibilità più in anticipo per l'analisi dell'impianto.
   1. Procedere con i passaggi 2-5 per l'analisi di ultrasuono.
4. Eseguire l'imaging ad ultrasuoni presso gd5, 8, 10, 12 e 14.

2. preparazione del sistema ad ultrasuoni

1. Accendere il sistema (Figura 1A; alimentazione principale sul retro e computer standby presso il sito di sinistro), la piattaforma riscaldata (Figura 1B; presso il pad di controllo) e il gel più caldo (Figura 1).
   Nota: Il gel per ultrasuoni deve scaldare per circa 0,5 h.
2. Assicurarsi che l'unità di isoflurane sta riempiendo sufficientemente (Figura 1).
3. Aprire un Nuovo studio o una Nuova serie in uno studio esistente nel browser. Compilare tutte le informazioni richieste (proprietario, Studio nome, nome della serie, i dati animali) nella finestra Info di studiare . Fare clic su Ok.
4. Dopo aver cliccato Ok, assicurarsi che viene visualizzata la finestra di imaging B-mode e l'imaging in B-mode inizia automaticamente.

3. Mouse movimentazione

1. Amputate del mouse
   1. Posizionare il mouse nella casella di atterramento (Figura 1E), chiudere la finestra, aprire il tubetto di isoflurane alla casella di atterramento e accendere l'isoflurano (concentrazione 3,5%).
   2. Quando il mouse è anestetizzato, più bassa (a concentrazione 1,5%) e reindirizzare il flusso di isoflurane aprendo il tubo in direzione della piattaforma riscaldamento e chiudere il flusso alla casella di atterramento.
      Nota: Per raggiungere l'anestesia sufficiente, attendere un ulteriore 10 s dopo il mouse non si muove.
   3. Trasferire rapidamente il mouse dalla casella di knockout per la piattaforma di riscaldamento (Figura 1F) in posizione dorsale e appoggiate delicatamente il naso nel tubo naso anestesia che si trova sulla cima della piattaforma.
2. Fissazione, depilazione e preparazione del mouse per la misurazione
   1. Posizionare la protezione degli occhi crema in ogni occhio del mouse per impedire gli occhi asciutti.
   2. Depositare una goccia di gel per elettrodi su ciascuna delle quattro aree rame sulla piattaforma riscaldata (Figura 1F).
   3. Toccare le zampe con nastro chirurgico sulle zone degli elettrodi gel-rivestita della piattaforma riscaldamento.
   4. Verifica ECG [valore ottimale = 450-550 battimenti/minuto (BPM)] e fisiologia respiratoria in ogni momento.
      Nota: Usando una sonda rettale, della temperatura corporea è possibile, ma non necessario.
   5. Posto depilatorio crema all'addome del mouse, strofinare la crema con un batuffolo di cotone e attendere circa 1 minuto togliere la crema con un impacco impregnati d'acqua. Ripetere questo passaggio se non tutti i peli sono andati.
   6. Applicare il gel per ultrasuoni pre-riscaldato sulla pelle depilata.

4. misure e acquisizione di immagini e video

1. Tenere il trasduttore (Figura 1) con la mano o bloccarla nel dispositivo di tenuta (Figura 1 H; detenzione dispositivo è consigliato).
2. Identificare la vescica con il trasduttore e usarlo come punto di riferimento. Spostare il trasduttore per i siti di sinistro e destro dell'addome per gli impianti di traccia.
3. B-modalità per la visualizzazione delle strutture anatomiche in 2D in scala di grigi
   1. Spostare il trasduttore o riscaldamento piattaforma tavolo dove il mouse è fissato fino a quando il primo impianto è visibile sullo schermo alle sue dimensioni più grandi.
      1. Selezionare L'etichetta dell'immagine e digitare un nome, o Frame Store (deposito senza nome) per memorizzare singoli fotogrammi o Cine Store per memorizzare un cineloop per le misurazioni dell'intero impianto.
   2. Spostare il trasduttore o tabella per portare la placenta in una posizione dove il flusso sanguigno nell'area di memoria superiore è visibile. Memorizzare un singolo fotogramma o cineloop (Vedi punto 4.3.1.1) per misurazioni placentare.
      Nota: Misure placentare sono possibili da gd10 in poi.
   3. Continuare con tutti gli impianti utilizzando lo stesso metodo.
4. Modo di doppler di colore per visualizzare e determinare la direzione del flusso sanguigno
   1. Premere il pulsante di colore .
   2. Spostare la casella di colore (in questa zona, il segnale è visibile) nella posizione desiderata utilizzando il trackball. Se necessario, modificare le dimensioni della casella premendo aggiornamento e spostare la trackball (a destra/verso l'alto = più grande; per lo sinistro lato/basso = più piccolo). Quando la casella ha la giusta dimensione, premere Select.
   3. Memorizzare i singoli fotogrammi o cineloops come descritto al punto 4.3.1.1.
5. Modo di doppler di onda di impulso (PW) per quantificare il flusso di sangue attraverso i vasi in uterina di Arteria (arteria uterina, UA) e UmA
   1. Individuare l'area di interesse per l'acquisizione di doppler di colore.
      Nota: La UA si trova caudale alla vescica, e l'UmA è situato tra il feto e la placenta.
   2. Premere PWe una linea tratteggiata apparirà. Spostare questa linea di vaso sanguigno di interesse e regolare l'angolo della linea tramite la manopola "Doppler angolo" in linea con il flusso di sangue. Premere Update.
      Nota: L'angolo tra la direzione del flusso sanguigno e il trasduttore deve essere coerenza in tutti gli animali, soprattutto quando si utilizzano gli angoli superiori a 60° (qui, sono stati utilizzati i 70° di UAs e 45° per UmAs).
   3. Memorizzare un cineloop delle linee doppler che appare nella finestra di acquisizione doppler PW.

5. Revisione e acquisizione dati di finitura e una serie di risparmio

1. Per rivedere i dati, premere Gestione studio. Scorrere l'immagine di anteprima di interesse e fare doppio clic su aggiornamento.
2. Premere prima Studio Gestione quindi Chiudi nella finestra del browser per finire di acquisizione dati e salvare una serie registrata.
   Nota: Dopo la chiusura di una serie, non è possibile memorizzare più cornici o cineloops in questa serie.

6. gestione di acquisizione dei dati del Mouse

1. Rimuovere il gel dall'animale anestetizzato con l'aiuto di impacchi asciutti.
2. Rimuovere con cautela il nastro chirurgico dalle zampe.
3. Chiudere il tubo di isoflurane (concentrazione 0%).
4. Procedere con la seguente analisi di ultrasuono a gd5, 8, 10 e 12.
   1. Metti l'animale da solo in una gabbia per un minimo di 5 min quindi ha tempo di svegliarsi e orientarsi.
   2. Posizionare il mouse nella gabbia originale.
      Nota: Non spegnere l'isoflurano prima di rimuovere il gel e nastro chirurgico, come topi si sveglia molto rapidamente (circa 20 s) dopo aver spento l'isoflurano.
5. Procedere con la seguente analisi di ultrasuono a gd14.
   1. Sacrificare la femmina prima che si svegli di dislocazione cervicale. Aprire l'animale, rimuovere l'utero, separare i feti e placente e misurare pesi fetali e placentari.

7. copiare e importare i dati

1. Contrassegnare una o più serie facendo clic su Esporta e scegliere lo spazio di archiviazione per copiare i dati su un disco rigido.
2. Aprire il software a un computer e fare clic su Copia da e selezionare la serie di studio/dal disco rigido a importare una studio/serie nel software.
3. Analizzare i dati con il software.

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Risultati

Singoli componenti del sistema ad ultrasuoni utilizzati in questo manoscritto sono mostrati nella Figura 1. La figura 2 Mostra rappresentante immagini ecografiche acquisite in B-mode a gd5, 8, 10 e 12 (B) e misura di zona corrispondente impianto risultati (A), dimostrando una zona significativa riduzione impianto di anti-CD122-trattati Cpa3^{Cre / +} topi da gd10 in poi.

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Discussione

Utilizzando il nostro sistema di ultrasuono, abbiamo dimostrato la restrizione della crescita fetale nelle madri MC/NK-carenti da gd10 su. Inoltre, a gd10 e 12, abbiamo osservato ridotte dimensioni placentari e alle gd14 l'assenza o la reversione del flusso diastolico fine in UmAs di alcuni feti dei topi uMC/uNK-carenti. Questo segno di scarsa vascolarizzazione è stato associato con un indice di resistenza significativa delle arterie che indica IUGR. Risultati confermano il ruolo importante di uMCs e uNKs in gravidanza ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
LEAF anti-Maus CD122 (IL-2Rb)	BioLegend	123204	Klon TM-β1; 500 µg
Vevo 2100 System	FujiFilm VisualSonics Inc.		Transducer MS550D-0421
Vevo LAB Software	FujiFilm VisualSonics Inc.
Isoflurane	Baxter	PZN: 6497131
Electrode gel	Parker	12_8
Surgical tape	3M Transpore	1527-1
Eye cream	Bayer	PZN: 1578675
Cotton tipped applicators	Raucotupf	11969	100 pieces
Depilatory cream	Reckitt Benckiser	2077626
Compresses	Nobamed Paul Danz AG	856110	10 x 10 cm
Ultrasound gel	Gello GmbH	246000