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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Cellule T antigene-specifiche sono difficili da caratterizzare o utilizzare in terapie grazie alla loro frequenza estremamente bassa. Qui, forniamo un protocollo per sviluppare una particella magnetica che si può associare a cellule T antigene-specifiche per arricchire queste cellule e quindi di espanderli diversi moltiplicati per la caratterizzazione e la terapia.

Abstract

Abbiamo sviluppato uno strumento per arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche. Ciò può essere utile in casi come A) rilevare l'esistenza di cellule T antigene-specifiche, B) sonda la dinamica delle risposte antigene-specifiche, C) capire come risposte antigene-specifiche influenzano lo stato di malattia come autoimmunità, D) demistificare eterogenei risposte per le cellule T antigene-specifiche, o E) utilizzano cellule antigene-specifiche per la terapia. Lo strumento si basa su una particella magnetica che abbiamo coniugato antigene-specifiche e segnali co-stimolatori delle cellule T, e che definiamo come artificiale antigene che presenta le cellule (aAPCs). Di conseguenza, poiché la tecnologia è semplice da produrre, si può facilmente essere adottata da altri laboratori; così, il nostro scopo qui è di descrivere dettagliatamente la fabbricazione e l'uso successivo della aAPCs. Spieghiamo come collegare segnali co-stimolatori e antigene-specifici per il aAPCs, come utilizzarli per arricchire di cellule T antigene-specifiche e come espandere le cellule T antigene-specifiche. Inoltre, evidenzieremo progettazione considerazioni basate su informazioni sperimentali e biologici della nostra esperienza con la caratterizzazione di cellule T antigene-specifiche.

Introduzione

Con l'ascesa di molte immunoterapie, c'è la necessità di essere in grado di caratterizzare e controllare le risposte immunitarie. In particolare, la risposta immunitaria adattativa è di interesse a causa della specificità e la durata delle cellule. Recentemente, le terapie con cellule T-antigene-recettore chimerico sono state approvate per la terapia del cancro; Tuttavia, l'antigene-recettori sono basati fuori il comune cellula antigene di superficie CD19, invece gli antigeni specifici per il cancro1. Di là della specificità, immunoterapie possono anche soffrire la mancanza di controllo e limitata comprensione della risposta immunitaria dinamica all'interno di cancro o autoimmunità.

Una delle sfide di studiare risposte antigene-specifiche è la loro frequenza estremamente bassa, ad es., cellule T antigene-specifiche sono 1 di ogni 104 106 T cellule2,3. Così, per indagare quali T sono presenti cellule o blocca, le cellule hanno bisogno di essere arricchito e ampliato, o loro segnale bisogno di essere amplificato. È costoso e difficile da mantenere le cellule di alimentatore utilizzando le attuali tecniche che si concentrano sull'espansione delle cellule antigene-specifiche. Le attuali tecniche che si concentrano su amplificando il segnale di T antigene-specifiche cellule, come l'enzima-collegata immunospot (ELISPOT) dosaggio, limitare il riutilizzo di tali cellule di T4. Infine, a causa della bassa sensibilità, spesso queste due tecniche devono essere combinati per enumerazione antigene-specifici.

Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato l'antigene artificiale basata su nanoparticelle magnetiche presentazione cella (aAPC)5,6,7,8. Il aAPC possono essere funzionalizzati con un complesso antigene-specifico peptide segnale caricato istocompatibilità (pMHC) - e molecole costimolatorie -ad es., un anticorpo anti-CD28-ad entrambi arricchire cellule T antigene-specifiche e poi successivamente stimolare la loro espansione (Figura 1). Le particelle possono essere così un prodotto redditizio standard che possa essere sia personalizzato per soddisfare antigene-specifiche stimolazioni ancora standardizzato attraverso esperimenti e pazienti. Eseguendo l'arricchimento e l'espansione elaborare risultati in centinaia di migliaia-fold espansione di cellule CD8 + T antigene-specifiche e può provocare frequenze fino al 60% dopo appena una settimana, che permette la caratterizzazione o l'uso terapeutico di grandi numero di celle. Qui, descriviamo come fare aAPCs di nanoparticelle, alcune considerazioni di progettazione critici nella scelta delle proprietà delle nanoparticelle ed illustrano alcuni risultati tipici da utilizzando queste particelle in isolamento ed espansione raro antigene-specifiche cellule T CD8 +.

Protocollo

Tutti i topi sono stati mantenuti a linee guida approvate dal comitato di revisione istituzionale dell'Università Johns Hopkins.

1. caricare la proteina di fusione dell'immunoglobulina dimerico complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-Ig) con sequenza del Peptide antigene desiderata.

Nota: Se si utilizza H - 2Kb: Ig, poi segui il protocollo dettagliato nel passaggio 1.1; Se si utilizza H-2Db:Ig, poi segui il protocollo dettagliato nel punto 1.2.

  1. Attiva il caricamento di sequenza del peptide in H - 2Kb: Ig.
    1. Preparare il necessario buffer. Preparare il tampone di denaturazione facendo una soluzione di NaCl 150 mM e 15mM Na2CO3 in acqua deionizzata e poi regolando il pH a 11.5. Preparare il tampone di rinaturazione facendo una soluzione di 250 mM Tris-HCl in acqua deionizzata e regolando il pH a 6,8.
      Nota: In genere, richiederà circa 5 mL di buffer sia la denaturazione e rinaturazione per 1 mg di H - 2Kb: Ig.
    2. Denaturare H - 2Kb: Ig per consentire il legame del peptide avanzata. Portare il H - 2Kb: concentrazione delle Ig per tra 0,5-2 mg/mL con tampone fosfato salino (PBS). Poi diluire la H - 2Kb: Ig a una concentrazione finale di 100-200 µ g/mL con volume di 5-10 equivalenti di denaturazione del buffer e consentono a incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    3. Aggiungere 50 eccesso molare di peptide sequenza (solitamente stock peptide è tenuto a 1 mM a-80 ° C) per la H - 2 Kb: soluzione di Ig.
      Nota: Di solito gli antigeni peptidici bisogno di essere dissolto all'interno di almeno 10% di dimetilsolfossido (DMSO) e poi ha aggiunto lentamente a PBS di rimanere solubile. A seconda della sequenza dell'amminoacido, potrebbe essere necessario aumentare la quantità di DMSO.
    4. Rinaturazione H - 2Kb: Ig con peptide. Immediatamente dopo l'aggiunta del peptide, portare la soluzione a un pH di 7,4 aggiungendo buffer di rinaturalizzazione. Lasciare la soluzione neutralizzata Incubare per 48 h a 4 ° C.
    5. Concentrarsi e lavare peptide-caricato H - 2Kb: Ig. utilizzando un concentratore centrifugo con un'interruzione del peso molecolare di 50 kDa (MWCO), seguire le indicazioni del produttore per lavare il peptide-caricato H - 2Kb: soluzione di Ig 3 volte con PBS, concentrarsi ad almeno 1 mg/mL e quantificare la concentrazione su uno spettrofotometro.
  2. Attiva il caricamento di sequenza del peptide in H-2Db:Ig.
    1. Preparare il necessario buffer. Preparare il tampone di denaturazione facendo una soluzione di acido citrico 131 mM, 150 mM NaCl e 124 mM Na2HPO4 in acqua deionizzata e poi regolando il pH a 6.5. Preparare il tampone di rinaturazione facendo una soluzione di 120 mM Tris-HCl in acqua deionizzata e regolando il pH a 8,8.
      Nota: In genere, esso richiederà circa 5 mL di buffer di denaturazione e 1 mL di buffer di rinaturalizzazione per 1 mg di H-2Db:Ig.
    2. Denaturare H-2Db:Ig per consentire il legame del peptide avanzata. Portare la H-2Db:Ig concentrazione ad una concentrazione finale di 0.5-2 mg/mL con PBS. Quindi, diluire il H-2Db:Ig a una concentrazione finale di 100-200 µ g/mL a 5-10 equivalenti di volume di tampone di denaturazione.
    3. Aggiungere 50 eccesso molare di peptide sequenza (solitamente stock peptide è tenuto a 1 mM a-80 ° C) per la H-2Db:Ig soluzione e lasciare per incubare per 1h a 37 ° C.
    4. Aggiungere β2 microglobulina e rinaturazione H-2Db:Ig con peptide. Aggiungere 2 volte eccesso molare di β2 microglobulina. Quindi, portare la soluzione a un pH di 7,4 aggiungendo buffer di rinaturalizzazione. Lasciare la soluzione neutralizzata Incubare per 24 h a 4 ° C.
    5. Concentrarsi e lavare H peptide-caricato-2Db:Ig. che utilizza un concentratore centrifugo con un 50 kDa MWCO, seguire le indicazioni del produttore per lavare il peptide-caricato H - 2 Kb: soluzione di Ig 3 volte con PBS, concentrarsi ad almeno 1 mg/mL e quantificare il concentrazione su uno spettrofotometro.

2. i coniugati complessi MHC-peptide e molecole costimolatorie alla superficie delle nanoparticelle magnetiche per formare cellule presentanti l'antigene artificiale delle nanoparticelle. Utilizzare uno dei tre metodi diversi a seconda della dimensione delle particelle e applicazione.

Nota: Un numero di diverse tecniche consente di coniugare le proteine sulla superficie delle particelle. Qui, sono descritti 3 approcci separati: particelle rivestite con ammina (punto 2.1), N-Idrossisuccinimide (NHS)-rivestite con particelle (punto 2.2) e particelle rivestite con anti-biotin (punto 2.3). Questi processi sono state anche descritte in dettaglio all'interno della sezione metodi di due documenti pubblicati6,7. Eseguire tutti i passaggi in una cappa di biosicurezza con soluzioni sterili per garantire la sterilità delle particelle aAPC stock.

  1. Cappotto segnali antigene-specifiche e stimolatori di particelle magnetiche rivestite con ammina (Figura 2). Questo processo è descritto per 100 nm, nanoparticelle superparamagnetiche rivestite con ammina.
    Nota: Protocolli dettagliati per associare l'anticorpo sulla superficie di una particella rivestita di ammina possono essere trovati alla https://www.micromod.de/en/technotes-2.html, dove 201 Nota tecnica descrive come a tiolico anticorpi e coniugato di maleimide funzionalizzare particelle e 202 descrivere il processo necessario per funzionalizzare particelle rivestite con ammina con maleimide gruppi funzionali. Qui, solo lievi modifiche sono evidenziate per il MHC-Ig e segnali co-stimolatori attaccati a queste particelle.
    1. Tiolico gli anticorpi con reagente di Traut (Technote 201).
      1. Preparare un PBS-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) l'acido tampone 10x (0.1 M PBS e 100 mM EDTA). Aggiungere i 10 x tampone PBS-EDTA agli anticorpi in un 01:10 rapporto per impedire l'ossidazione di tioli liberi aggiunto agli anticorpi.
      2. Aggiungere 20 eccesso molare di reagente di Traut (2-Iminotiolano) per l'anticorpo e incubare per 2 ore a temperatura ambiente con la miscelazione. Dosare il reagente di Traut (polvere secca) all'interno di una cappa chimica per evitare la respirazione durante la conversione di gruppi amminici a gruppi tiolici.
      3. Lavare accuratamente con tampone PBS-EDTA 3 volte usando un concentratore centrifugo con un 50 kDa MWCO 1x e seguire le indicazioni del produttore, concentrando fino a un volume finale di 500 µ l. misurare la concentrazione di anticorpo soluzione utilizzando un spettrofotometro.
    2. Convertire i gruppi funzionali di ammina su nanoparticelle magnetiche maleimide gruppi utilizzando Sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (Sulfo-SMCC, nota tecnica 202).
      1. Aggiungere i 10 x tampone PBS-EDTA agli anticorpi in un 01:10 rapporto alle particelle.
      2. Sciogliere in acqua deionizzata e vortice Sulfo-SMCC per risospendere ad una concentrazione di 1 mg/mL. Misurare il Sulfo-SMCC (polvere secca) all'interno di una cappa chimica per evitare la respirazione durante la conversione di gruppi amminici a maleimide gruppi.
      3. Aggiungere 0,016 nmol della soluzione Sulfo-SMCC per ogni millimetro quadrato di superficie delle particelle. Per 1 mg di 100 particelle di nm, utilizzare 0,3 mg di Sulfo-SMCC. Lasciare per agire per 1,5 h a temperatura ambiente.
      4. Lavare le particelle con 1x PBS-EDTA 3 volte usando un campo magnetico con una colonna magnetica e risospendere in 500 µ l di tampone PBS-EDTA 1x.
        Nota: Se si utilizza particelle inferiori a 200 nm, così come le particelle di nm 100 descritto nel presente documento, magneti permanenti molto probabilmente non sarà abbastanza potenti per tirare le particelle per lavare o concentrando gli scopi. Così, per lavare le particelle più piccole, utilizzare una colonna magnetica composta da sfere ferromagnetici per amplificare il campo magnetico.
    3. Particelle di maleimide-funzionalizzate reagiscono con gli anticorpi tiolate (Technote 201).
      1. Aggiungere le particelle di un flaconcino di scintillazione di vetro, aggiungere un mini-ancoretta, posto appena un pollice sopra una piastra magnetica e indurre miscelazione magnetico della soluzione delle particelle.
      2. Per la soluzione di miscelazione, aggiungere goccia a goccia gli anticorpi tiolate (0,5 mg di anticorpo per ogni 1 mg di particelle). Lasciare per agire tutta la notte a temperatura ambiente.
      3. Lavare con tampone PBS 1X 3 volte usando un campo magnetico e risospendere in 500 µ l di PBS 1X. Etichettare e conservare a 4 ° C fino a 6 mesi.
        Nota: Un'efficienza massima coniugazione si verifica quando particelle maleimide-funzionalizzate immediatamente sono mescolate con tiolate proteina.
  2. Cappotto segnali antigene-specifiche e stimolatori di particelle magnetiche rivestite con NHS (Figura 3). Questo processo è descritto per 200 nm, nanoparticelle superparamagnetiche NHS-rivestite.
    1. Preparare il tampone di risospensione, tempra buffer e buffer di memoria. Il tampone di risospensione è di 25 mM 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES) con 0.01% Tween 20 regolata a pH 6.0. Il buffer di tempra è una soluzione di 100 mM di Tris-HCl a pH 7,4. Il buffer di memoria è una soluzione di 10 mM PBS e 0.01% Tween a pH 7,4.
    2. Risospendere le particelle liofilizzate in 1 mL di tampone di risospensione. Vortexare vigorosamente per almeno 15 min fino a quando non aggregati sono visibili.
    3. Mettete le particelle magnetiche su un supporto magnetico per rimuovere il surnatante, risospendere con 0,5 mL di tampone di risospensione e trasferimento in un flaconcino di vetro scintillazione. Vortice fino a quando non aggregati sono visibili.
    4. Aggiungere 0,1 mg di proteine totali per 1 mg di particelle di sedimento. Vortice di mescolare e reagire a temperatura ambiente per 2,5 h durante la miscelazione.
    5. Aggiungere 0,1 mL di buffer di tempra e reagire a temperatura ambiente per 30 minuti, mescolando.
    6. Collocare il flaconcino di scintillazione su un supporto magnetico e lavare le particelle. Attendere fino a quando il surnatante è chiaro da rimuovere. Rimuovere le particelle dal supporto magnetico, aggiungere 1 mL di tampone di risospensione e mescolare nel vortex fino a quando non aggregati sono visibili. Ripetere questa operazione tre volte e risospendere le particelle in 1 mL di tampone di risospensione. Memorizzare le particelle a 4 ° C fino a 6 mesi.
  3. Cappotto segnali antigene-specifiche e stimolatori di particelle magnetiche rivestite con anti-biotin (Figura 4). Questo processo è descritto per 50-100 nm, nanoparticelle superparamagnetiche anti-biotina.
    1. Biotinylate MHC-Ig o molecole costimolatorie.
      1. Regolare la concentrazione di proteina a 0.5-2 mg/mL in tampone PBS. Risospendere sulfo-NHS-biotina ad una concentrazione di 10 mg/mL in acqua deionizzata e aggiungere 20 volte e molare dell'anticorpo in eccesso per stimolatore. Incubare a temperatura ambiente per 45 min.
      2. Lavare accuratamente con PBS 3 volte usando un concentratore centrifugo con un 50 kDa MWCO, seguire le indicazioni del produttore, concentrando fino a un volume finale di 500 µ l. misurare la concentrazione della soluzione anticorpo usando uno spettrofotometro.
    2. Coniugato biotinilato MHC-Ig e/o segnali co-stimolatori alle nanoparticelle anti-biotina. Per 500 µ l di stock anti-biotina particelle, aggiungere 0,5 nmol di stimolatori dell'anticorpo e incubare a 4 ° C durante la notte.
    3. Lavare le nanoparticelle aAPC coniugati. Perché queste particelle sono più piccole di 200 nm, bagnare una colonna magnetica e mettere su un supporto magnetico.
    4. Aggiungere la sospensione di particelle/proteina alla colonna. Consentire tutte le proteine/particelle di entrare completamente la colonna.
    5. Lavare aggiungendo 0,5 mL di PBS tre volte alla colonna.
    6. Eluire rimuovendo la colonna dal supporto magnetico, aggiungendo 0,5 mL di PBS alla colonna, e utilizzando lo stantuffo, expulse la aAPCs di particelle in una fialetta di scintillazione. Memorizzare le particelle a 4 ° C fino a 6 mesi.
      Nota: Le particelle sono stabili a 4 ° C (non deve essere congelato) per fino a 6 mesi. Temperature più elevate diminuiscono la funzionalità delle particelle e alcuni aggregazione delle particelle sono stati osservati (dati non mostrati). Non tenere a temperatura ambiente per lunghi periodi di tempo come questo diminuisce notevolmente la shelf-life delle particelle.

3. caratterizzare il contenuto di proteina su artificiale Antigen Presenting Cell nanoparticelle utilizzando rilevazione dell'anticorpo fluorescente.

Nota: Questo è un controllo di qualità utile delle cellule presentanti l'antigene artificiale prodotta. Inoltre, la quantità di segnale stimolatorio è usata per produrre le dosi equivalenti aAPC in lotti e vari tipi di aAPC (ad es., diverse dimensioni).

  1. Misurare la concentrazione di particelle di aAPCs rivestito.
    1. Utilizzare particelle non coniugate da soluzione di riserva e fare una titolazione della dose di 1:2 in una soluzione di PBS attraverso una piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti a fondo piatto con 100 µ l per pozzetto.
    2. Leggere le particelle su una piastra-lettura spettrofotometro a 405 nm per creare una curva standard da una concentrazione di particelle conosciute.
    3. Prelevare un campione del aAPCs coniugato, diluito in PBS per un volume totale di 100 µ l e leggere sullo spettrofotometro.
  2. Rimuovere un campione di aAPCs fabbricato e macchia con anticorpi fluorescenti.
    1. Per calcolare quanto campione per rimuovere, stimare il numero di anticorpi sulla superficie della particella.
      Nota: Per queste tecniche, presuppongono una densità di circa 1000 anticorpi/µm2 di superficie delle particelle. Per essere in grado di rilevare la fluorescenza, richiede circa 1011 MHC-Ig o molecole di CD28 totale per test in fluorescenza.
    2. Portare il volume totale di aAPCs fino a 100 µ l di PBS, aggiungere gli anticorpi colorazione in una diluizione di 1: 100 e incubare per 1 h a 4 ° C.
      Nota: Gli anticorpi di esempio utilizzati con successo sono FITC Coniugato anti-ratto murine Ig λ1, λ2, catena leggera λ3, clone R26 46 per rilevare MHC-Ig e il mouse coniugato FITC anti armeno/siriano criceto IgG, clonare G192-1, per rilevare il anti-mouse CD28.
  3. Lavare le particelle e leggere la fluorescenza su un lettore di piastra fluorescente.
    1. Magneticamente lavare (come descritto nel passaggio 2) le frazioni di aAPC macchiato tre volte con 0,5 mL di PBS.
    2. Eluire il aAPCs lavato con 0,5 mL di PBS.
    3. Aggiungere 100 µ l della aAPCs eluiti ad una piastra 96 pozzetti a fondo piatto per leggere la concentrazione utilizzando l'assorbanza come in passo 3.1.
    4. Prendere i rimanenti 400 µ l, suddivisi in aliquote di due 200 µ l e aggiungere due pozzetti in una piastra 96 pozzetti, fondo piatto nera, polistirolo. Titolare presso un rapporto di 1:2 giù la piastra prendendo 100 µ l della soluzione e la miscelazione con il pozzo successivo che ha 100 µ l di PBS in ogni bene, almeno quattro volte.
      Nota: Il multiplo medio replica della misura per ridurre il rumore nella misurazione.
    5. Sulla stessa piastra 96 pozzetti nera, fare una curva standard dell'anticorpo fluorescente utilizzato per macchiare, aggiungendolo a 1: 200 in un pozzo con 200 µ l di PBS e titolazione giù al rapporto di 1:2 per almeno 12 pozzi.
    6. Dopo gli anticorpi sia aAPC e fluorescenti sono sul piatto, è possibile leggere la piastra con un lettore di piastra fluorescente.
  4. Calcolare la quantità di proteina per particella. Determinare la concentrazione di anticorpo confrontando i valori della curva standard, dove la concentrazione di anticorpi è noto, supponendo un rapporto di 1:1 di macchiatura dell'anticorpo a rilevato l'anticorpo. Quindi dividendo la concentrazione di anticorpi rilevati con la concentrazione di particelle determinata mediante l'analisi di assorbanza darà il numero di anticorpi per particella.

4. arricchire antigene-specific CD8 + cellule di T con cellule presentanti l'antigene artificiale preparato delle nanoparticelle.

  1. Isolare le cellule T CD8 +.
    1. Eutanasia degli animali da esposizione per isoflurano seguita da dislocazione cervicale.
    2. Rimuovere la milza e linfonodi da topi C57BL/6j wildtype e posto in una soluzione di PBS. Macerare gli organi ed eluire le cellule attraverso un colino di cella µm sterile 70 con frequenti lavaggi di PBS.
    3. Per eliminare le cellule non - CD8 + T, utilizzare un kit di isolamento delle cellule T CD8 + no-touch e seguire le istruzioni del produttore.
      Nota: Ogni condizione di antigene richiede almeno 3 x 106 cellule T CD8 +.
  2. Aggiungere il aAPCs di nanoparticelle da associare alle cellule T CD8 +.
    1. In seguito l'isolamento, concentrato in un volume di 100 µ l di PBS con 0,5% albumina di siero bovino (BSA) e 2 mM EDTA.
    2. Determinare il numero di aAPCs da aggiungere tramite il calcolo sulla base del rapporto del 1011 aAPC-limite, peptide-caricato MHC-Ig per ogni 10 cellule T CD8 +6 .
    3. Incubare aAPC particelle e cellule T CD8 + per 1 h a 4 ° C con miscelazione continua in un polistirolo sterile 5 mL fondo tubo tondo.
  3. Preparare supporti completati e fattore di crescita delle cellule T (TCGF) per eluire e coltura di cellule T CD8 +.
    1. Per i media completati, supplemento completo RPMI 1640 media (con glutammina) con 1 x aminoacidi non essenziali, piruvato di sodio di 1 mM, 0.4 x soluzione di vitamine, 92 µM 2-mercaptoetanolo, 10 µM ciprofloxacina e 10% siero bovino fetale (FBS).
    2. Per rendere TCGF, seguire i protocolli già affermati e cui si fa riferimento qui9.
      Nota: TCGF è un cocktail in-House di citochine immuni umane che sono essenziale per fornire le cellule di T con segnali ulteriori stimoli per crescere. TCGF potrebbe essere scambiata per cellula T noto stimolatore citochine quali il-2, IL-7, o IL-15; Tuttavia, ognuno può polarizzare la risposta delle cellule T di conseguenza. Il protocollo descritto nel presente documento non è stato ottimizzato con questi cocktail; così altre tecniche dovrebbero essere consultati per le concentrazioni e combinazioni se TCGF non viene utilizzato con gli esempi elencati10,11.
  4. Lavare e arricchire aAPC e miscela di cellule T CD8 +.
    1. Lavare la aAPCs di particelle magnetiche come descritto nel passaggio 2. Tuttavia, lavare prima utilizzando il tampone PBS con 0,5% BSA e 2 mM EDTA, secondo utilizzando integrati multimediali e terzo utilizzando completati media con 1% TCGF.
    2. Eluire aAPCs e cellule T CD8 + arricchite in 500 µ l di media completati con 1% TCGF.
    3. Contare le celle utilizzando un emocitometro e la piastra in un piatto fondo U 96 a 160 µ l di media completati con 1% TCGF ad una concentrazione di 2.5 x 105 T di CD8 + cellule/mL.
    4. Se isolando utilizzando aAPCs con solo peptide-caricato MHC-Ig sulla superficie (senza segnali co-stimolatori), poi completa passo 4.5. Se isolando utilizzando aAPCs con entrambi MHC-Ig di peptide-caricati sui segnali co-stimolatori e di superficie, quindi procedere al passaggio 5.
  5. Aggiungere le particelle magnetiche rivestite con segnali co-stimolatori sulla superficie per la frazione arricchita e aggiungere un campo magnetico per co-clustering i segnali stimolatori sulla superficie delle cellule T.
    1. Per le frazioni arricchite, aggiungere un equimolare (o maggiore a seconda della applicazione-vedere la sezione sulle proprietà aAPC al controllo) dell'anticorpo stimolatore al numero di peptide-caricato MHC-Ig sulla particella.
    2. Consentire costimolatorie particelle magnetiche di legarsi alle cellule di T di CD8 + arricchite per 1 h a 4 ° C.
    3. Aggiungere campo magnetico inserendo la piastra di coltura fra due magneti al neodimio N52 disco di 1,9 cm (0,75 pollici) di lunghezza.
      Nota: N52 disco magneti hanno un campo estremamente forte. Cura dovrebbe essere presa entrambi per memorizzarli con distanziali tra magneti, come è difficile rimuovere uno da altro e quando metterli sulle piastre di coltura. Per ridurre al minimo i magneti da attaccare ai componenti metallici dell'incubatore, metterli in contenitori di polistirolo 50 mL tubo conico sulla superiore ed inferiore.

5. espandere e rilevare l'antigene-specific CD8 + cellule di T con cellule presentanti l'antigene artificiale preparato delle nanoparticelle.

  1. Aggiungere la piastra ben a fondo U 96 con aAPCs e cellule T CD8 + in un umidificata 5% CO2, incubatore 37 ° C per 3 giorni. Il giorno 3, nutrire le cellule con 80 µ l per pozzetto di media completati con 2% TCGF e posto nuovamente dentro l'incubatrice fino al giorno 7.
  2. Il giorno 7, è possibile raccogliere le cellule stimolate in un 5 mL fondo sferico per il conteggio.
  3. Una volta che tutte della soluzione è raccolto, lo spin down le cellule prelevate per risospendere in 0,5 mL di PBS con sodio azide 0.05% e 2% FBS. Conteggio di cellule vitali di colorazione con trypan blue e contando su un emocitometro.
  4. Rimuovere le cellule contate 50.000-500.000 in due nuove mL 5 tubi del fondo per la macchiatura di antigene-specifiche. Un tubo verrà utilizzato per la macchia di cognate peptide-MHC, e l'altro tubo servirà per la macchia non affine per determinare una colorazione di fondo.
  5. Aggiungere 1 µ g di biotinylated MHC-Ig (utilizzando la tecnica descritta nel passaggio 2) per le rispettive cognate e i tubi non affine in 100 µ l di PBS con sodio azide 0.05% e 2% FBS con allophycocyanin (APC)-ratto coniugati anti-topo CD8a, clonare 53-6,7 (rapporto di diluizione di 1: 100) per 1 h a 4 ° C.
  6. Aggiungere secondaria streptavidina e vivo morto macchia. Lavare in eccesso biotinilati MHC-Ig con PBS tramite centrifugazione. Quindi macchiare tutti i campioni con un rapporto di 1: 350 di ficoeritrina (PE)-etichettato rapporto streptavidina e 1: 1000 di una macchia di cellula morta verde live/dead risolvibile per 15 min a 4 ° C.
  7. Leggi tutti i campioni su un citometro a flusso per determinare la specificità e il numero di cellule antigene-specifiche.
    1. Lavare secondaria in eccesso e live/dead macchia mediante centrifugazione e risospendere con 150 µ l di tampone PBS con sodio azide 0.05% e 2% FBS di leggere su un citometro a flusso.
  8. Determinare il numero e la percentuale di cellule antigene-specifiche con software di analisi dati.
    1. Per determinare la percentuale di cellule antigene-specifiche, utilizzare le seguenti porte nel rispettivo ordine live + linfociti + (forward scatter di scatter laterale), CD8 + e dimero +. Determinare il dimero + cancello confrontando il non-affine alla macchia cognata.
    2. Determinare la percentuale di cellule antigene-specifiche in un campione sottraendo la percentuale di dimero + della macchia MHC-Ig cognata dalla macchia MHC-Ig non affine.
    3. Utilizzando questa percentuale di cellule antigene-specifiche, moltiplicarlo per il numero di cellule contate, restituendo il numero di cellule antigene-specifiche risultante dall'arricchimento e l'espansione.
      Nota: Compensazione dovrà essere impostato sul citometro a flusso, poiché non vi è sovrapposizione spettrale con fluorofori utilizzati in questo pannello.

Risultati

Per completare un arricchimento di successo e l'espansione di cellule T antigene-specifiche, il peptide-caricato MHC-Ig e molecole costimolatorie devono essere correttamente collegati alla particella aAPC. Basato sui 3 metodi di attacco delle particelle, forniamo alcuni dati rappresentativi per un risultato di successo coniugazione procedura (Figura 5a). Infatti, se la densità di ligando è troppo bassa, quindi non ci sarà un'efficace stimolazione delle cel...

Discussione

Abbiamo creato una tecnologia di isolamento di romanzo delle cellule di T antigene-specifiche basata su nanoparticelle artificiale antigene che presenta le cellule (aAPCs). AAPCs di nanoparticelle hanno peptide-caricato MHC sulla superficie che permette l'associazione di cellule T antigene-specifiche e attivazione al fianco di costimolazione attivazione. aAPCs sono anche paramagnetico e quindi può essere utilizzato per arricchire le cellule T antigene-specifiche rare usando un campo magnetico. Abbiamo ottimizzato e stud...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano l'interesse finanziario concorrenti seguenti: sotto un accordo di licenza tra NexImmune e The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck ha diritto a una quota di royalty ricevute dall'Università sulle vendite dei prodotti descritti in questo articolo. Fu anche dei fondatori di NexImmune e possiede partecipazioni in società. Egli serve come un membro del Consiglio di amministrazione e il comitato consultivo scientifico di NexImmune. I termini di tali disposizioni hanno stati esaminati e approvati dal The Johns Hopkins University secondo le proprie politiche di conflitto di interessi.

Riconoscimenti

J.W.H. grazie NIH cancro nanotecnologia Training Center presso il Johns Hopkins Institute per nanobiotecnologie, la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) e la Fondazione di archi per il supporto di borsa di studio. Questo lavoro è stato finanziato dal sostegno dei National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovation Initiative e la Fondazione di Coulter (JPS).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Human HLA-A2:Ig Fusion ProteinBD Biosciences551263
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I: Recombinant Soluble Dimeric Mouse H-2K[b]:Ig Fusion ProteinBD Biosciences550750
Vivaspin 20 MWCO 50 000GE Life Sciences28932362
Vivaspin 2 MWCO 50 000GE Life Sciences28932257
Purified Human Beta 2 MicroglobulinBio-RadPHP135
nanomag-D-spio, NH2, 100 nm nanoparticlesMicromod79-01-102
Super Mag NHS Activated Beads, 0.2 µmOcean NanotechSN0200 
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
Sulfo-SMCC Crosslinker ProteoChemc1109-100mg
2-Iminothiolane hydrochlorideSigma-AldrichI6256 Sigma 
96 Well Half-Area Microplate, black polystyreneCorning3875
FITC Rat Anti-Mouse Ig, λ1, λ2, & λ3 Light Chain  Clone  R26-46  BD Biosciences553434
FITC Mouse Anti-Armenian and Syrian Hamster IgG  Clone  G192-1BD Biosciences554026
B6.Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (transgenic PMEL) miceJackson Laboratory005023
C57BL/6J (B6 wildtype) miceJackson Laboratory000664
CD8a+ T Cell Isolation Kit, MouseMiltenyi130-104-075
MS ColumnsMiltenyi130-042-201
LS ColumnsMiltenyi130-042-401
Streptavidin-Phycoerythrin, SAv-PEBiolegend405203
N52 disk magnets of 0.75 inches K&J MagneticsDX8C-N52
APC anti-mouse CD8a Antibody, clone 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD Fixable Green Dead Cell Stain Kit, for 488 nm excitation ThermoFisherL-34969

Riferimenti

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