Coltura cellulare primaria di neuroni GABAergici o glutamatergici purificati stabiliti attraverso la selezione di cellule attivate a fluorescenza

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo basato sulla selezione delle cellule per la purificazione e la coltura di neuroni GABAergici o glutamatergici fluorescenti dalla neocorteccia e dall'ippocampo di topi o ratti postnatali.

Abstract

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di generare colture neuronali purificate derivate da neuroni GABAergici o glutamatergici. I neuroni purificati possono essere coltivati in media definiti per 16 giorni in vitro e sono suscettibili di analisi tipicamente eseguite su colture dissociate, comprese le analisi elettrofisiologiche, morfologiche e di sopravvivenza. Il vantaggio principale di queste colture è che i tipi di cellule specifici possono essere studiati selettivamente in assenza di influenze esterne complesse, come quelle derivanti da cellule gliali o da altri tipi di neuroni. Quando si pianificano esperimenti con le cellule purificate, tuttavia, è importante notare che i neuroni dipendono fortemente dai media condizionati dalla glia per la loro crescita e sopravvivenza. Inoltre, i neuroni glutamatergici dipendono ulteriormente dai fattori secati dalla glia per la creazione della trasmissione sinaptica. Descriviamo quindi anche un metodo per la co-coltura dei neuroni e delle cellule gliali in una disposizione senza contatto. Utilizzando questi metodi, abbiamo identificato importanti differenze tra lo sviluppo delle reti neuronali GABAergiche e glutamatergiche. Così, studiare le culture dei neuroni purificati ha un grande potenziale per promuovere la nostra comprensione di come il sistema nervoso si sviluppa e funziona. Inoltre, le colture purificate possono essere utili per indagare l'azione diretta di agenti farmacologici, fattori di crescita o per esplorare le conseguenze delle manipolazioni genetiche su specifici tipi di cellule. Come sempre più animali transgenici diventano disponibili, etichettare ulteriori tipi specifici di cellule di interesse, ci aspettiamo che i protocolli qui descritti cresceranno nella loro applicabilità e potenziale.

Introduzione

L'ordinamento delle cellule è un potente strumento per l'isolamento delle cellule viventi di interesse da una miscela eterogenea di cellule. Le celle possono essere ordinate in base ai criteri di dimensione e forma, nonché all'espressione dei marcatori fluorescenti^1,2. Spesso, gli anticorpi coniugati con fluoroforo sono usati per etichettare tipi di cellule distinti puntando sugli antigeni di superficie specifici delle cellule^3,4. In alternativa, gli animali transgenici o i sistemi di somministrazione virale sono stati progettati per esprimere i fluorofori sotto i promotori specifici delle cellule^5,6. Storicamente, lo sviluppo di strumenti e animali transgenici era costoso e dispendioso in termini di tempo. Più recentemente, diminuire i costi e ridurre le difficoltà tecniche ha portato ad un drammatico aumento del numero di linee reporter disponibili. Poiché la disponibilità di strumenti transgenici e di animali reporter continua a crescere, così anche l'utilità e l'applicabilità dei metodi di selezione delle cellule basati sulla fluorescenza.

Recentemente abbiamo dimostrato che la selezione cellulare da animali transgenici può essere regolarmente applicata per purificare i neuroni primari in preparazione per la coltura cellulare⁷. Ordinando le cellule da ratti o topi, siamo stati in grado di isolare e colture neuroni fluorescenti, che esprimono le proteine reporter fluorescenti specificamente in entrambi i neuroni GABAergici o glutamatergici^6,8,9. Studiando queste colture neuronali purificate, siamo stati in grado di identificare una differenza importante nel modo in cui i neuroni GABAergic e glutamatergici dipendono dai fattori secati dalla glia per la creazione della trasmissione sinaptica⁷. Inoltre, attraverso la co-coltura delle cellule gliali con neuroni purificati, siamo stati in grado di estendere le precedenti osservazioni dimostrando il ruolo critico che le cellule gliali giocano nella crescita e nella sopravvivenza dei neuroni^10,11. Così, attraverso una combinazione di cernita cellulare e coltura cellulare, siamo stati in grado di studiare non solo lo sviluppo di specifici tipi di neuroni in isolamento, ma sono stati in grado di indagare l'influenza delle cellule gliali sulla loro funzione.

Presentiamo qui un protocollo per la purificazione e la cultura dei neuroni GABAergici e glutamatergici dalla corteccia e dall'ippocampo di topi o ratti transgenici. Presentiamo anche un metodo per la co-coltura senza contatto di neuroni purificati e cellule gliali, adattato da Geissler et al.¹². Al fine di generare colture GABAergiche purificate, abbiamo ordinato i neuroni fluorescenti di VGAT-Venus-A Wistar ratti⁸ o vgat-Venus topi¹³, che esprimono selettivamente una variante di proteina fluorescente gialla potenziata (Venere) nel > 95% di neuroni GABAergici corticali. Per generare colture glutamatergiche purificate, abbiamo ordinato i neuroni fluorescenti da NexCre; Ai9 topi^6,9, che esprimono tdtomato nei neuroni glutamatergici corticali. L'intera procedura di ordinamento e coltura può essere eseguita entro 3-4 h e può essere utilizzata per generare centinaia di colture replicate adatte per l'analisi elettrofisiologica, morfologica e di sopravvivenza cellulare. Il metodo è semplice, riproducibile e può produrre colture neuronali purificate che sono superiori al 97% puro per il tipo di cellula di interesse.

Protocollo

Tutte le procedure e la manutenzione degli animali sono state eseguite in conformità con gli orientamenti istituzionali, la legge tedesca sul benessere degli animali e la direttiva 86/609/CEE del Consiglio europeo per quanto riguarda la protezione degli animali, in presenza di autorizzazioni da (LaGeSo Berlin, T-0215/11).

Nota: Questo protocollo descrive la cultura dei neuroni purificati da un singolo topo transgenico o cucciolo di ratto (giorno postnatale 0 – 2). Tutte le tecniche devono essere eseguite in condizioni sterili. Tutte le soluzioni devono essere sterilizzate utilizzando un filtro da 0,2 μm (vedere tabella dei materiali). Vetrerie di vetro e strumenti di dissezione devono essere sterilizzati a caldo per 3 ore a 185 ° c.

1. rivestimento vetrini coprioggetti con poli-L-lisina

1. Preparare i coprioggetti in vetro scongelando un'aliquota di 5 mL di 200 μg/mL di soluzione di poli-L-lisina (PLL). Diluire questa soluzione in stock a 20 μg/mL aggiungendo 45 mL di acqua pura di grado di iniezione. Filtrare-sterilizzare la soluzione in un nuovo tubo conico 50 mL. Etichettare questo tubo come "PLL sterile".
   Nota: Utilizzare acqua immagazzinata a temperatura ambiente per accelerare il processo di sbrinamento.
2. Aggiungere 100 vetrerie sterili, rotonde, di vetro da 12 mm alla soluzione PLL sterile. Agitare il tubo ogni 5 – 10 min, per 2 – 3 min, per garantire anche il rivestimento. Rivestire i coprioggetti in questo modo per 1 h.
   Nota: Sono preferibili i coprioggetti in vetro rotondo di produzione tedesca (diametro = 12 mm), in quanto forniscono una superficie di coltura affidabile e si adattano facilmente ai pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti.
3. Dopo 40 min di rivestimento PLL, prendere 2 pezzi di carta velina e adagiarle in piano nell'armadio di flusso. Sterilizzare la carta utilizzando 70% etanolo, quindi appiattire per rimuovere le pieghe e lasciare asciugare.
4. Dopo aver rivestito i coprioggetti in vetro per 1 h con PLL, rimuovere la soluzione PLL in eccesso e aggiungere acqua sterile di grado di iniezione. Agitare delicatamente i coprioggetti per 2 – 3 s per consentire la rimozione del PLL in eccesso. Ripetere questa fase di risciacquo 2 volte.
5. Rimuovere l'acqua in eccesso, quindi trasferire i coprioggetti sulla carta velina sterile. Separare accuratamente ogni vetrino coprioggetti utilizzando pinze curve e lasciare asciugare.
   Nota: I coprioggetti che non si separano facilmente possono essere scartati. In alternativa, è possibile aggiungere una piccola quantità di acqua per aiutare la separazione.
6. Una volta asciutto, trasferire i coprioggetti su una piastra di coltura 24-well.
   Nota: Coprioggetti devono essere preparati circa 30 min – 1 h prima di iniziare il processo di dissezione. Le piastre possono essere immagazzinate in un incubatore a 37 ° c e 5% CO₂ fino a quando richiesto.

2. dissociazione di ippocampale e tessuto corticale

1. Preparazione di soluzioni per colture cellulari
   1. Per la dissociazione del tessuto neurale, prima scongelare un'aliquota di 40 mL di tampone di coltura cellulare (composizione [in mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO₃, 1,3 Nah₂po₄, 1 MgSO₄· 7h₂o, 1 CAcl₂· 2h₂o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H₂o e 25 D-glucosio, pH = 7,4). Misurare 12 mL di tampone di coltura cellulare in un tubo conico da 15 mL; etichetta come "BSA". Misurare 5 mL di tampone di coltura cellulare in un altro tubo da 15 mL; etichetta come "papaina". Incubare entrambi i tubi in bagnomaria per 15 minuti a 37 ° c.
   2. Filtrare-sterilizzare il buffer di coltura cellulare rimanente, etichettare come "buffer-sterile" e conservare a 4 ° c fino a quando richiesto.
   3. Pesare 120 mg di albumina sierica bovina (BSA) e aggiungere al tubo denominato "BSA". Pesare 7 mg di papaina e aggiungere al tubo etichettato "papaina". Riportare entrambi i tubi al bagno d'acqua per 15 minuti.
      Nota: È utile aggiungere una piccola quantità di tampone alla barca di pesatura per facilitare il trasferimento della polvere di papaina.
   4. Una volta che tutte le polveri si sono dissolte, filtrare-sterilizzare ogni soluzione ad un nuovo tubo conico 15 mL. Per il papaina del tubo, etichettare la soluzione filtrata come "papaina-sterile". Per il tubo BSA, dividere la soluzione BSA sterile in 3 provette, ciascuna contenente 4 mL di soluzione BSA. Etichettare ogni tubo come "BSA-sterile" e "1", "2" o "3". Riportare tutti i tubi al bagno d'acqua e continuare ad incubare a 37 ° c fino a quando richiesto.
2. Preparazione per la dissezione tissutale
   1. Prendete un unico pezzo di carta da filtro 35 mm (vedere tabella dei materiali) e sterilizzare con 70% di etanolo; lasciare asciugare nel coperchio di una piastra di Petri da 100 mm, in un armadio di flusso.
   2. Stendere le forbici, le pinze, il bisturi e la spatola (Vedi tabella dei materiali) necessari per la dissezione dell'ippocampo e della corteccia.
   3. Collocare piatti di Petri da 2 35 mm e una capsula di Petri da 100 mm contenente carta filtrante sterile in una posizione accessibile al centro dell'armadio di flusso.
   4. Raccogliere NexCre transgenico; Ai9 e VGAT Venere cuccioli di topo che devono essere sezionati. Utilizzare una lampada fluorescente con filtri di eccitazione e di emissione appropriati (vedere tabella dei materiali) per discriminare i cuccioli fluorescenti di tipo selvaggio.
   5. Immediatamente prima di sezionare gli animali, riempire ogni piatto di Petri da 35 mm con tampone di coltura cellulare sterile e refrigerato.
      Nota: Una capsula di Petri è per la pulizia degli strumenti tra dissezioni, e l'altro è per la raccolta dell'ippocampo e della corteccia.
3. Dissezione tissutale
   1. Non appena il tampone di coltura cellulare viene versato, decapitare un giorno postnatale 0 – 2 topo transgenico o cucciolo di ratto utilizzando grandi, forbici affilate e utilizzare una sterile 100 mm capsula di Petri per trasferire la testa nel cabinet flusso. Utilizzare pinze, forbici e una spatola per trasferire accuratamente il cervello di un cucciolo transgenico a carta filtrante sterile.
   2. Utilizzare un bisturi tipo 22 per sezionare via il cervelletto e separare i 2 emisferi. Utilizzare una piccola spatola per rotolare gli emisferi lateralmente. Su ogni emisfero, premere delicatamente in modo che la corteccia venga a contatto con la carta filtrante. Sposta delicatamente le regioni mesencefalo per rivelare l'ippocampo e la corteccia.
      Nota: Fare attenzione a non applicare troppa pressione quando si preme verso il basso sugli emisferi o le cellule possono diventare schiacciate.
   3. Usa un bisturi o una spatola per separare l'ippocampo e la corteccia da ogni emisfero. Trasferire il tessuto dissezionato su una piastra di Petri da 35 mm contenente tampone di coltura cellulare refrigerata.
      Nota: Se sezionare più animali, conservare tampone di coltura cellulare sterile in un 50 mL tubo conico su ghiaccio. Dopo ogni dissezione, trasferire il tessuto dissezionato al tampone di coltura delle cellule refrigerate.
   4. Dopo dissezione di successo del tessuto cortico-ippocampale, trasferire la soluzione di papaina sterile dal bagno d'acqua al cabinet di flusso. Utilizzare una pipetta Pasteur da 3 mL per trasferire l'ippocampo dissezionato e la corteccia al coperchio di una capsula di Petri sterile da 35 mm. Tritare in un movimento Criss-Cross, utilizzando la parte piatta di un bisturi tipo 22, fino a quando il tessuto è in piccoli pezzi.
   5. Utilizzare una piccola quantità di soluzione di papaina per trasferire il tessuto tritato dal coperchio della capsula di Petri al tubo di papaina sterile. Riportare il tubo di papaina al bagno d'acqua e incubare il tessuto a 37 ° c per 25 min.
   6. Durante l'incubazione di papaina, creare una soluzione completa di media fluorescente. Sbrinare un'aliquota di 1 mL di B27, un'aliquota di 0,5 mL di Glutamax e un'aliquota di 0,5 mL di Pen-Strep. Aliquota 48,5 mL di Hibernate un supporto a bassa fluorescenza a un tubo conico da 50 mL. Aggiungere B27, Glutamax e Pen-STREP alla soluzione. Agitare bene la soluzione, quindi filtrare-sterilizzare ed etichettare come "Hibernate A complete media" (con data e iniziali). Incubare a 37 ° c in bagnomaria.
   7. Dopo l'incubazione del papaina, trasferire il tubo di papaina e i tubi BSA sterili all'armadio di flusso. Utilizzare una pipetta Pasteur da 1 mL per rimuovere solo il tessuto cortico-ippocampale dal tubo di papaina in BSA-Tube 1.
      Nota: Fare attenzione a minimizzare il trasferimento della soluzione di papaina in eccesso.
4. Dissociazione delle cellule
   1. Al fine di rompere qualsiasi grande grumi di tessuto, triturato il tessuto più volte utilizzando una pipetta Pasteur da 1 mL. A seguito di questo, triturato il tessuto 7 volte utilizzando una pipetta Pasteur punta fine. Lasciare il tessuto a riposare per 30 s, permettendo pezzi più grandi di tessuto al sedimento.
   2. Dopo 30 s, trasferire il più basso 1 mL di soluzione e tessuto da BSA-Tube 1 a BSA-Tube 2. Triturato il tessuto in BSA-Tube 2 diverse volte utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine.
      1. Dopo la triturazione, trasferire di nuovo il più basso 1 mL di tessuto e soluzione da BSA-Tube 1, ma ora a BSA-Tube 3. Triturato il tessuto in BSA-Tube 3 diverse volte utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine.
      2. Dopo la triturazione, trasferire tutta la soluzione e il tessuto dai tubi 2 e 3 in BSA-Tube 1. Triturato un ulteriore 2-3 volte e centrifugare a 3.000 x g per 3 min.
   3. Durante la centrifugazione, creare un supporto completo Neural basal A (media NBA). Aliquot 48,5 mL di media NBA su un tubo conico da 50 mL e incubare a 37 ° c in bagnomaria. Etichettare questo tubo "solo NBA". Inoltre, scongelare una aliquota di 1 mL di B27, un'aliquota di 0,5 mL di Glutamax e un'aliquota di 0,5 mL di Pen-STREP a temperatura ambiente.
   4. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il supernatante dal tessuto pellettato e risospendere le cellule in 2 mL di supporto completo. Utilizzare una pipetta P1000 per triturati il tessuto su e giù 20 volte.
      Nota: Fare attenzione a non pipettare le cellule troppo vigorosamente. Se si applica troppa pressione, le cellule possono danneggiarsi.
   5. Utilizzare una pipetta Pasteur da 1 mL per filtrare la sospensione cellulare attraverso un setaccio a cellule da 30 μm in un tubo campione di polistirene.
      Nota: Se la sospensione cellulare non passa immediatamente attraverso il setaccio cellulare, può essere necessario premere sulla parte superiore del setaccio con un guanto sterile per avviare il flusso. Questo importante passo previene l'intasamento della selezionatrice cellulare.
   6. Per la raccolta dei neuroni dopo la cernita, preparare i tubi di raccolta pipettando 300 μL di supporto completo al numero richiesto di tubi in polipropilene.
   7. La sospensione cellulare è ora pronta per essere portata al selezionatore cellulare per l'ordinamento. Prendere la sospensione cellulare, tubi di raccolta extra e ricambi supporti completi in caso di diluizione del campione è necessario.

3. cernita cellulare dei neuroni GABAergici o glutamatergici purificati

Nota: Per minimizzare la possibilità di contaminazione batterica durante la selezione risciacquare il tubo campione della selezionatrice con 70% di etanolo per almeno 5 minuti prima della cernita. Parametri di ordinamento dettagliati variano tra gli strumenti, considerazioni fondamentali sono i seguenti.

1. Durante la prima specie di cella, stabilire i livelli di fluorescenza di sfondo da celle senza etichetta ordinando e confrontando le celle da un animale di tipo selvaggio.
2. Per ogni tipo di cella fluorescente da ordinare, scegliere i filtri di eccitazione e di emissione appropriati. Le proteine Excite Venus e TdTomato utilizzano rispettivamente lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm o 531 nm. Rilevare la luce emessa attraverso 530/40 e 575/30 set di filtri di emissione, rispettivamente.
3. Aggiungere tubi di raccolta in polipropilene, contenenti 300 μL di supporto completo, al selezionatore cellulare per la raccolta cellulare.
4. Per un'elevata purezza, ordinare le celle fluorescenti con etichette luminose (vedere la Figura 1B per esempio i grafici a punti delle celle ordinate).
5. Dopo l'ordinamento, per ottenere risultati ottimali, eseguire un test di purezza delle celle ordinate per stimare i livelli di purezza. Si noti che il tasso di recupero tipico delle celle dopo l'ordinamento è compreso tra 70 – 80%.
6. Annotare il numero di celle ordinate in ogni tubo di raccolta. Questo valore è dato dallo strumento di selezione delle celle.
   Nota: L'ordinamento delle celle può essere eseguito utilizzando un ugello da 70 μm (pressione del fluido guaina 70 psi) o un ugello da 100 μm (pressione del fluido guaina 20 psi).

4. coltura di neuroni ordinati

1. Dopo la cernita delle cellule, trasferire le cellule raccolte a 2 mL di provette centrifughe di fondo rotonde, utilizzando una pipetta Pasteur da 1 mL. Centrifugare le cellule a 3.000 x g per 3 min per formare un pellet cellulare.
   Nota: Per aiutare a identificare la posizione del pellet cellulare, orientare i tubi centrifughe a fondo rotondo con la cerniera del coperchio rivolto verso l'esterno, che consente di formare il pellet cellulare sul retro del tubo della centrifuga (cioè sullo stesso lato del tubo come cerniera).
2. Durante la centrifugazione, aggiungere 1 mL di B27, 0,5 mL di Glutamax e 0,5 mL di Pen-STREP ai 48,5 mL di media NBA pre-riscaldato. Agitare bene la soluzione, quindi filtrare sterilizzare ed etichettare come "supporto completo NBA" (con data e iniziali). Tornare al bagno d'acqua fino a quando richiesto.
3. Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta Pasteur da 1 mL per trasferire il supernatante in una diversa provetta da centrifuga (mantenere il surnatante Incase il pellet cellulare è stato disturbato). Risospendere il pellet cellulare nella quantità necessaria di supporti NBA pre-riscaldati completi per ottenere una densità cellulare di 1.000 cellule/μL. Risospendere le celle pipettando su e giù con una pipetta P200 o P1000.
4. Per confermare la presenza di cellule dissociate, controllare la soluzione cellulare sotto un microscopio, utilizzando una lente obiettivo 4x o 10x. In alternativa, pipettare una piccola quantità di soluzione cellulare su un vetrino coprioggetti e controllare sotto il microscopio. Se sono presenti un numero elevato di celle, il supernatante dal passaggio 4,3 può essere scartato.
5. Prima di placcatura le cellule, vortice su una velocità media per 2 – 3 s per garantire una sospensione uniforme delle cellule. Dopo la vortexing, pipettare rapidamente 10 μL della sospensione cellulare al centro di ciascun vetrino coprioggetti. Dopo il pipettaggio delle cellule, riportare rapidamente ogni piastra all'incubatore (5% CO₂/37 ° c) e incubare per 1 h.
   Nota: Se l'aggiunta di celle a più piastre a 24 pozzetti, assicura anche le densità delle celle mediante la vortizzazione delle cellule tra le piastre.
6. Dopo 1 h, nutrire le cellule con 500 μL di media NBA pre-riscaldato e tornare all'incubatore.
   Nota: Quando si nutrono le cellule, è importante Pipettare delicatamente il supporto lungo il lato del pozzo per evitare il distacco delle cellule. Per brevi esperimenti (< 16 giorni), l'alimentazione alla densità di cui sopra non è necessaria. Quando si placcatura una maggiore densità di cellule, possono essere necessari intervalli di alimentazione più frequenti (vedere discussione).

5. astrocyte arricchito le colture di supporto gliale

Nota: La produzione di colture gliali¹⁴ e l'uso di inserti di coltura cellulare è stato descritto in precedenza¹². In breve, le colture di glia arricchite con astrociti derivano dal tessuto cortico-ippocampale (con meningi rimossi; P2 – P5), che sono stati coltivati per una settimana su piastre da 6 pozzetti rivestite con PLL da 20 μg/mL, in supporti DMEM integrati nel siero.

1. Per la co-coltura di neuroni purificati e cellule gliali, il passaggio di cellule gliali confluenti al numero richiesto di inserti di coltura cellulare (dimensione dei pori 0,4 μm — Vedi tabella dei materiali). Per passare le cellule, rimuovere una piastra a 6 pozzetti contenente cellule gliali confluenti dall'incubatore e lavare 2 pozzetti, 2 volte, con 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato pre-riscaldato (37 ° c) (PBS).
2. Aspirare la soluzione di PBS e utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere 1 mL di tripsina pre-riscaldata (37 ° c) (1:250)/EDTA (0,25%/0,02%) soluzione ad ogni pozzetto.
3. Riportare la piastra 6-Well all'incubatore e controllare ogni 2 – 3 min per il distacco delle cellule.
4. Una volta che si è verificato un distacco significativo delle cellule, pipettare delicatamente le cellule e la soluzione cellulare su e giù utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine, per aiutare l'ulteriore distacco e la separazione delle singole cellule.
5. Trasferire la soluzione cellulare a un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 3.000 x g per 3 min.
6. Risospendere le cellule utilizzando una pipetta P1000 in 5 mL di supporto completo NBA pre-riscaldato (37 ° c), pipettando delicatamente su e giù fino a quando il pellet cellulare è in soluzione.
7. Eseguire un conteggio delle cellule utilizzando un emocytometro o un contatore cellulare automatizzato.
   Nota: Dopo 7 giorni in coltura, circa 750000-1000000 cellule possono essere raccolte da ogni pozzo di una piastra 6-well.
8. Piastra 40.000 cellule gliali ad ogni inserto di coltura cellulare in una gocciolina di 500 μL (80 cellule/μL).
9. Dopo aver permesso alle cellule di aderire per 1 h, utilizzare pinze sterili per trasferire gli inserti di coltura cellulare coperti da glial a piastre 24-well contenenti neuroni purificati. Rimuovere i supporti in eccesso dalla superficie degli inserti di coltura cellulare (circa 300 μL).
   Nota: Poiché le bolle d'aria spesso possono rimanere intrappolate sotto gli inserti di coltura cellulare, potrebbe essere necessario inclinare delicatamente gli inserti per rimuovere queste bolle. Se si aggiungono più cellule gliali all'inserto della coltura cellulare, possono essere necessari ulteriori passaggi di lavaggio e centrifughe per rimuovere l'eccesso di tripsina, che può essere dannoso per la sopravvivenza delle cellule.

Risultati

La dissociazione e la cernita cellulare dei neuroni fluorescenti da parte del topo transgenico o del tessuto cortico-ippocampale del ratto possono essere eseguite in circa 3 – 4 ore. Il risultato è una popolazione di neuroni fluorescenti altamente puri, che possono essere coltivati in coltura per 16 giorni.

Per generare colture purificate, gli animali transgenici sono stati identificati per la prima volta utilizzando una lampada fluorescente con opportuni set di filtri (esempi di Venere neonatale fluorescente e NexCre; I cuccioli di topo Ai9 sono mostrati nella Figura 1a). Dopo l'identificazione degli animali transgenici, il tessuto dissezionato è stato dissociato e i neuroni più fortemente fluorescenti sono stati ordinati per produrre una popolazione cellulare purificata. Esempio di intensità di fluorescenza dot plot per NexCre; Ai9 e VGAT Venus mouse neuroni, ottenuti durante FACS, sono mostrati nella Figura 1B. Quando ottimizzato, è possibile raccogliere tra 500.000 e 800.000 cellule dalla corteccia e ippocampo del singolo P0-2 NexCre; Ai9 o VGAT Venus topi. Le celle possono essere ordinate ad una velocità verso l'alto di 600 eventi/s. le stime della purezza delle cellule sono state eseguite utilizzando DAPI come marcatore nucleare (Figura 1C). Ordinando cellule fortemente positive, una purezza di oltre 97% può essere regolarmente raggiunta⁷.

Dopo la selezione di successo, i neuroni placcati dovrebbero apparire rotondi in forma, avere una membrana liscia e dovrebbero essere visti per germogliare i neuriti dopo circa 1 h in vitro (Figura 2a, B). Entro 7 giorni in vitro, anche se alcune cellule morte possono essere evidenti, cellule vitali dovrebbero essere presenti in tutte le condizioni di coltura (Figura 2C, D). A 12 – 16 giorni in vitro, utilizzando registrazioni di patch-clamp intere e biocytin-riempimento¹⁵, è possibile indagare lo sviluppo morfologico ed elettrofisiologico dei neuroni purificati (Figura 3). L'analisi delle colture purificate rivela che entrambi i neuroni glutamatergici e GABAergici sono stati in grado di estendere assoni e dendriti dai loro corpi cellulari (Figura 3A, B) e mantenere la capacità di generare potenziali di azione in risposta a iniezioni di corrente depolarizzante suprathreshold (Figura 3C, D). In particolare, tuttavia, dopo la purificazione, solo i neuroni GABAergici hanno ricevuto quantità significative di trasmissione sinaptica spontanea e i neuroni glutamatergici ricevono pochissima trasmissione sinaptica in assenza di cellule gliali (Figura 3E , F) ⁷. il

Come abbiamo riferito in precedenza, le cellule in colture purificate tendono a sopravvivere più male di quelle in colture non ordinate e hanno dendriti e assoni significativamente più piccoli⁷. Per superare questi deficit, abbiamo adattato e applicato metodi per sostenere lo sviluppo di colture purificate con cellule gliali^12,14. La composizione cellulare delle nostre colture di supporto gliale (DIV7) è mostrata nella Figura 4a. Queste colture contenevano principalmente gli astrociti positivi della proteina fibrillare gliale (GFAP), ma contenevano anche alcuni gruppi di molecole di differenziazione (CD11b) di microglia positiva e di oligodendrociti positivi della proteina di base di mielina (MBP). Dopo div 7, queste cellule possono essere passaggio agli inserti di coltura cellulare per fornire supporto senza contatto di neuroni purificati (Figura 4B, C). L'analisi delle co-colture di glia-Neuron rivela che circa 40.000 cellule gliali erano sufficienti per migliorare la sopravvivenza a lungo termine e la crescita dei neuroni glutamatergici e GABAergici purificati (Figura 4D, e)⁷. Inoltre, l'analisi elettrofisiologica rivela che i neuroni glutamatergici, co-colti con le cellule gliali, sono stati altamente attivi e hanno fortemente aumentato l'attività della rete (percentuale di neuroni glutamatergici supportati da gliali che sparavano esplosioni di azione potenzialità: 62%; n = 28; Figura 4F , G). Il supporto di glial è quindi importante non solo per promuovere la crescita e la sopravvivenza del neurone, ma anche per promuovere la trasmissione sinaptica e la creazione di attività di rete nelle colture glutamatergiche.

Figura 1: purificazione dei neuroni glutamatergici e GABAergici. (A) immagini che mostrano il segnale fluorescente dall'espressione transgenica di TdTomato in nexcre; Ai9 topi (in alto) e Venere in topi VGAT Venus (in basso). Barre di scala = 5 mm. (B) trame a dispersione di intensità della fluorescenza di TdTomato e Venus di cellule dissociate da cortico-ippocampali da nexcre; Ai9 topi (in alto) e topi VGAT Venus (in basso). I neuroni TdTomato o Venus fortemente fluorescenti sono stati selezionati per l'ordinamento (indicato dalle scatole di gating). (C, sinistra) Immagini confocale di TdTomato ordinato (superiore) e Venere (in basso) neuroni positivi. (C, destra) Immagine unita che mostra le celle co-macchiate con DAPI (in pseudocolore blu). La fluorescenza di TdTomato è endogena e rimane forte nonostante la fissazione (in pseudocolore Magenta). L'espressione Venus è potenziata utilizzando una combinazione di un anticorpo primario diretto contro GFP e l'anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor-488 (in pseudocolore verde). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 2: coltura cellulare di neuroni glutamatergici o GABAergici purificati. (A) immagini combinate a infrarossi (campo luminoso) e segnale fluorescente sovrapposto da TdTomato (sinistra) e Venere (destra) neuroni positivi coltivati per 1 h in vitro. Le frecce bianche indicano la posizione dei neuriti in crescita. (B) immagini confocale di TdTomato (a sinistra) e di Venere (destra) i neuroni positivi coltivati per 1 h in vitro. (C, D) Campo luminoso (in alto) e campo luminoso combinato e immagini fluorescenti (in basso) di TdTomato (C) e Venus positivi neuroni (D) coltivati per 7 giorni in vitro (DIV). Le frecce bianche mostrano la posizione dei nuclei condensati dalle cellule morte. Le frecce colorate identificano i neuroni con etichetta fluorescente. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 3: proprietà morfologiche, elettrofisiologiche e sinaptiche dei neuroni purificati. (A, B) Immagini confocale dei neuroni positivi di TdTomato (A) e Venus (B) rispettivamente a DIV 13 e DIV 14. Le cellule sono presentate in nero utilizzando una tabella di ricerca invertita per aiutare la visualizzazione dei neuroni. Gli inserti mostrano il segnale fluorescente espresso dai neuroni identificati. (C, D) La risposta di tensione da un TdTomato (C) e Venus positivo neurone (D) a iperpolarizzante (200 a-20 pA, in passi da 20 pA) e depolarizzante (200 pA) impulsi di corrente, ottenuti da registrazioni di patch-clamp a tutto il cellulare. Gli inserti mostrano i neuroni registrati corrispondenti. Il potenziale di membrana di riposo di ogni cellula è indicato a sinistra della traccia di registrazione. (E, F) Registrazioni di tensione-morsetto rappresentative (10 s) ottenute da TdTomato (E) e Venus positivi neuroni (F). Gli eventi postsinaptici eccitatori spontanei (EPSC) sono stati registrati dai neuroni positivi di TdTomato, mantenuti ad un potenziale di detenzione di 50 mV. Gli eventi postsinaptici inibitori spontanei (IPSC) sono stati registrati dai neuroni positivi di Venere mantenuti ad un potenziale di detenzione di 0 mV. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figura 4: sostenere lo sviluppo del neurone con la co-coltura gliale. A) immagini confocale di colture gliali immunolabate per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP, sinistra), cluster di molecola di differenziazione (CD11b, medio) e proteina di base della mielina (MBP, destra). Le cellule gliali sono state coltivate per DIV 7. B) immagini di inserti di coltura cellulare utilizzati per la co-coltura di cellule gliali con neuroni purificati in una disposizione senza contatto. (C) uno schema dell'assetto spaziale utilizzato per la co-coltura di neuroni e glia. (D, E) Immagini confocale dei neuroni positivi di TdTomato (D) e Venus (E), cresciuti per 14 giorni, in assenza (a sinistra) o presenza (destra) del supporto gliale. (F, G) Registrazioni a morsetto di corrente (60 s) da TdTomato (F) e Venus positivi neuroni (G) coltivati per 14 giorni in assenza (superiore) o presenza (inferiore) di supporto gliale. I neuroni sono stati registrati al loro potenziale di membrana di riposo (presentato a sinistra di ogni traccia di registrazione). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Discussione

Descriviamo qui un metodo che unisce la cernita e la coltura dei neuroni primari per generare colture di cellule neuronali purificate. Questo metodo richiede circa 1 h più a lungo di un tipico protocollo di coltura neuronale primario dissociato, ma consente la generazione di centinaia di colture replicate contenenti specifici tipi neuronali. I neuroni purificati, che possono essere coltivati in isolamento per almeno 16 giorni, estendono assoni e dendriti e possono sparare i treni ripetitivi dei potenziali d'azione (Figura 2 e Figura 3). È importante sottolineare che queste cellule sono suscettibili alle stesse analisi sperimentali delle normali colture neuronali primarie dissociate, comprese le analisi elettrofisiologiche, morfologiche e di sopravvivenza. Un importante vantaggio di lavorare con queste colture purificate è che lo sviluppo di tipi di cellule specifici può essere studiato isolatamente. Per sostenere lo sviluppo di colture purificate, presentiamo anche un protocollo per la co-coltura di neuroni purificati con cellule gliali. Come mostrato in precedenza, la co-coltura di neuroni purificati con cellule gliali migliora la loro sopravvivenza, la crescita e può promuovere la formazione di rete⁷ (Figura 4). Pertanto, presentiamo qui una combinazione di metodi che dovrebbero approfondire lo studio delle interazioni glia-Neuron e possono rivelarsi utili per studiare lo sviluppo e l'interazione tra altri tipi di cellule di interesse.

Studi sulle colture di neuroni glutamatergici purificati hanno rivelato informazioni fondamentali sul modo in cui le cellule gliali secernono fattori che promuovono lo sviluppo di reti neuronali e formazione di sinapsi^16,17,18 . In generale, i metodi per purificare specifici tipi di neuroni sono stati applicati con maggiore successo allo studio dello sviluppo dei neuroni glutamatergici piuttosto che dei neuroni GABAergici. Questo ha portato a una disparità nella nostra comprensione di come questi due tipi di cellule si sviluppano. Dato che i neuroni GABAergici e glutamatergici differiscono significativamente in termini di anatomia, fisiologia e origini dello sviluppo, è vitale che studiamo i neuroni GABAergici nel loro diritto, per comprendere meglio la loro funzione e fisiologia. Utilizzando il protocollo qui presentato, abbiamo precedentemente identificato importanti differenze nel modo in cui i neuroni GABAergic e glutamatergici dipendono dai fattori secati dalla glia per la creazione della trasmissione sinaptica⁷. Pubblicando questo protocollo speriamo che altri possano fare ulteriori approfondimenti sulle importanti interazioni tra neuroni e cellule gliali.

In questo protocollo, descriviamo un metodo di selezione delle cellule basato sulla citometria a flusso, che abbiamo usato per purificare i neuroni GABAergici o glutamatergici da diverse linee di roditori transgenici. I neuroni GABAergici positivi di Venere sono stati ordinati da topi VGAT Venus¹³ o ratti⁸ e i neuroni glutamatergici positivi di tdtomato sono stati ordinati da nexcre; Ai9 topi (allevati originariamente da NexCre⁹ e Ai9 linee reporter⁶, Vedi Turko et al., 2018⁷). Negli ultimi anni, a causa dei progressi tecnologici, la generazione di animali transgenici è diventata significativamente più facile. Come tale, la disponibilità di animali che esprimono molecole fluorescenti, in molti tipi di cellule differenti, è cresciuta rapidamente. Questo ha, a sua volta, aumentato l'uso e l'applicabilità della selezione di cellule fluorescenti attivate. Mentre i metodi alternativi per isolare le cellule di interesse attualmente esistono^16,19,²⁰, sono un po' ostacolato dalla loro dipendenza dalla disponibilità di anticorpi idonei per superficie naturale Antigeni. Questo limita la loro versatilità rispetto ai metodi di selezione delle cellule basati sulla fluorescenza, che possono già essere utilizzati per ordinare le cellule dai molti animali reporter transgenici specifici delle cellule che sono già disponibili. Tuttavia, quando ottimizzato, metodi di ordinamento basati su anticorpi possono essere rapidi e ad alto rendimento, e può anche meglio preservare l'anatomia delle cellule, permettendo la purificazione delle cellule con i loro assoni e dendriti intatto²¹. I metodi di selezione degli anticorpi dovrebbero pertanto essere presi in considerazione quando decidono una strategia di smistamento. In definitiva, il tipo di cellula di interesse, l'età alla quale le cellule devono essere ordinate, la disponibilità di animali transgenici o antigeni superficiali e il numero di cellule necessarie saranno i fattori determinanti quando si sceglie la strategia di ordinamento più adatta.

Sebbene l'ordinamento delle cellule basato sulla fluorescenza sia un metodo semplice e riproducibile per la purificazione delle cellule, è necessario prestare attenzione durante determinate fasi del protocollo per preservare la qualità delle cellule. Ad esempio, dopo ogni fase di centrifugazione, è importante assicurarsi che il pellet cellulare venga risospeso il più rapidamente possibile e che le cellule siano state recuperate con successo. Occasionalmente, il pellet cellulare può essere disturbato quando si rimuove il surnatante. Si consiglia quindi, tra le fasi di centrifugazione, di verificare la presenza di cellule sotto il microscopio per escludere qualsiasi perdita di cellule estesa. Dopo la placcatura cellulare, le cellule devono essere autorizzate ad aderire per almeno 1 h prima dell'allattamento. Se le cellule vengono alimentate troppo presto, alcune cellule possono essere disalloggiati dal vetrino coprioggetti, riducendo così la densità di coltura. Dopo 1 h nella cultura, è prudente valutare la salute delle cellule. Se le celle non appaiono sane (un esempio di cellule sane è mostrata nella Figura 2a), o c'è una morte cellulare significativa, questo può essere un'indicazione di un problema durante la procedura di dissociazione o di ordinamento. Un'ulteriore considerazione importante, quando si coltivano qualsiasi tipo di cellula, è quello di prendersi cura quando si gestisce il supporto di coltura cellulare. Il supporto NBA contiene il rosso fenolo, che funge da indicatore di pH²². Se il supporto diventa di colore troppo giallo, questo indica che il pH è troppo acido; Se il supporto diventa troppo rosa, questo indica che la soluzione è troppo alcalina. Le soluzioni stock aperte per lunghi periodi, in particolare i media aliquotati in tubi conici, tendono a diventare più alcalini nel tempo. Si consiglia quindi di creare nuovi media NBA completi ogni settimana e di completare i media ogni due settimane (i buffer medi in condizioni atmosferiche e dovrebbero quindi essere più stabili). Tenendo conto di questi punti, dovrebbe essere possibile stabilire colture cellulari purificate in qualsiasi laboratorio con accesso alle apparecchiature di smistamento cellulare e coltura cellulare.

Nella maggior parte dei nostri esperimenti abbiamo prodotto colture purificate da un singolo animale. Tuttavia, quando si purificano le cellule per le analisi biochimiche, può essere necessario riunire più animali per l'ordinamento. Abbiamo risolto con successo fino a 8 topi embrionali (embrionali giorno 13 animali) utilizzando il protocollo di cui sopra (dati non mostrati). Tuttavia, se più animali devono essere ordinati, potrebbe essere necessario aumentare il volume di entrambe le soluzioni di papaina e BSA (descritte ai punti 2.1.1 – 2.1.4) per accogliere l'aumento della quantità di tessuto. Inoltre, se più cellule sono placcate in coltura, potrebbe essere necessario un programma di alimentazione più frequente. Come punto di partenza, le cellule possono essere alimentate ogni 7 giorni rimuovendo 100 μL di supporti condizionati e aggiungendo 200 μL di un nuovo supporto NBA completo. Per il bene della vitalità del neurone, se si ordina più animali, il pensiero dovrebbe essere dato per ridurre al minimo il tempo di ordinamento il più possibile. Ciò richiede spesso l'attenta ottimizzazione delle analisi a valle per l'uso efficiente delle cellule depurata. Abbiamo ordinatamente ordinato neuroni del mouse a tassi di 600 eventi/s, fino a 500000-800000 cellule per animale (giorno postnatale 0 – 2). Tuttavia, ciò è stato senza un'ottimizzazione esaustiva delle velocità e delle condizioni di ordinamento. Pertanto, dovrebbero essere possibili ulteriori miglioramenti nella velocità di smistamento e nella resa.

I neuroni purificati richiedono mezzi di comunicazione condizionati per la loro sopravvivenza. Questo è stato dimostrato in precedenza da colture neuroni e cellule gliali separatamente, prima di trattare i neuroni con media con gliali condizionato¹⁰. Nei nostri esperimenti, abbiamo scelto di sostenere i neuroni purificati coltivando le cellule gliali su inserti di coltura cellulare semi-permeabili, che sono collocati all'interno della piastra di coltura cellulare. Questo metodo è stato applicato con successo per studiare le proteine della matrice extracellulare derivate dalla glia e la loro interazione con i neuroni¹². Il supporto senza contatto, ma continuo fornito da questo metodo ha una serie di vantaggi rispetto alla cultura separata delle cellule. In particolare, la co-coltura delle cellule gliali con i neuroni consente la regolazione continua e il condizionamento dei mezzi di coltura cellulare, che assomiglia più da vicino alla situazione in vivo. Inoltre, la co-coltura continua delle cellule consente potenziali segnalazioni di feedback tra neuroni e glia, che non è possibile in colture separate. Nel nostro protocollo, se necessario, il metodo di co-coltura continua può essere facilmente omesso e può essere eseguito un trattamento classico dei neuroni con media condizionati dalla glia.

In sintesi, il protocollo qui presentato mira a fornire al lettore una solida base da cui possono stabilire i propri esperimenti di coltura cellulare purificati. Prevediamo che la disponibilità di animali transgenici e costrutti virali continuerà ad aumentare per il prossimo futuro. Pertanto, le tecniche di selezione delle cellule basate sulla fluorescenza sono suscettibili di diventare ancora più ampiamente usato e prezioso.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neural Basal A media (NBA)	ThermoFisher Scientific	10888022	Cell Culture Buffer
B27	ThermoFisher Scientific	17504001	Culture supplement
Glutamax	ThermoFisher Scientific	35050-038	Culture supplement
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140-122	Antibiotic
Poly-L-Lysine	SIGMA	P1399	Coverslip coating
Papain	SIGMA	P4762-1G	Enzyme
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A3294-100G	Serum
Hibernate A low fluorescence media	Brain Bits Ltd	HALF	Cell Transport media
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)	Biochrom	F0435	Glial Culture Buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	Biochrom	S0115	Serum
Trypsin/EDTA	Biochrom	L2163	Enzyme
Fine Tip Pasteur Pipette	Neo Labs	-	Used for trituration of cells
24-well plates	BD	353047	Culture plate
50 mL Falcon tubes	BD	352070	-
15 mL Falcon tubes	BD	352096	-
Glass coverslips: 12 mm round	Roth	P231.1	-
35 mm Petri dish	Corning	353001	-
100 mm Petri dish	Corning	353003	-
30 µm CellTrics Cell Sieve	sysmex	04-004-2326	To remove cell clumps before cell sorting
Round bottom polystyrene tubes	BD	352054	Transport tube for sorted cells
Round bottom polypropylyne tubes	BD	352063	Collection tube for sorted cells
Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET	Falcon	353 095	For the co-culture of neurons and glia
Extra fine Bonn Scissors	Fine Scientific Tools	14084-08	To remove overlying skin and bone of mice
Extra narrow Scissors	Fine Scientific Tools	14088-10	To remove overlying skin and bone of rats
Forceps	Fine Scientific Tools	11242-40	To hold the head in place
Spatula (130 mm long/5 mm tip width)	Fine Scientific Tools	3006.1	To remove the brain to filter paper
Scalpel Blades	Swan-Morton	#0308	To mechanically dissociate neural tissue
Haemocytometer (Neubauer Imroved)	Optik Labor	-	To cell count dissociated cells
Fluorescent Miners Goggles (excitation light)	Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)	FHS/LS-1G	To excite TdTomato
Fluorescent Miners Goggles (emission filter)	Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)	FHS/EF-4R2	Td Tomato compatible emission filter
Fluorescent Miners Goggles (excitation light)	Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)	FS/ULS-02B2	To excite Venus
Fluorescent Miners Goggles (emission filter)	Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)	FS/TEF-3GY1	Venus compatible emission filter
Mouse-Anti-GFP primary antibodies	UC Davis	75-132	To enhance Venus signal following fixation
Mouse-Anti-GFAP primary antibodies	SIGMA	G-3893	The identification of reactive astrocytes
Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies	Southern Biotech	1561-15	The identification of microglial cells
Rabbit-Anti-MBP primary antibodies	Millipore	AB980	The identification of oligodendrocyes