Occlusione del vaso due Mouse modello di Ischemia-riperfusione cerebrale

Riepilogo

Un modello murino di ischemia-riperfusione cerebrale è istituito per studiare la patofisiologia del colpo. Abbiamo distalmente legare l'arteria cerebrale centrale di destra e l'arteria carotica comune di destra e ripristinare il flusso sanguigno dopo 10 o 40 min di ischemia.

Abstract

In questo studio, un modello di topo di occlusione dell'arteria cerebrale centrale (MCA) è impiegato per studiare il ischemia-riperfusione cerebrale. Un modello del topo riproducibili e affidabili è utile per studiare la fisiopatologia dell'ischemia-riperfusione cerebrale e determinazione potenziali strategie terapeutiche per i pazienti con ictus. Variazioni nell'anatomia del circolo di Willis di C57BL/6 topi colpisce il loro volume di infarto dopo lesione cerebrale indotta da ischemia. Gli studi hanno indicato che l'occlusione distale del MCA (MCAO) possa superare questo problema e sfociare in una dimensione di infarto stabile. In questo studio, stabiliamo un modello murino di occlusione del due-vaso di ischemia-riperfusione cerebrale mediante l'interruzione del flusso sanguigno per la MCA giusto. Abbiamo distalmente legare la MCA destra e dell'arteria carotica comune di destra (CCA) e ripristinare il flusso sanguigno dopo un certo periodo di ischemia. Questa lesione di ischemia-riperfusione induce un infarto di dimensione stabile ed un deficit comportamento. Cellule del sistema immunitarie periferico infiltrano cervello ischemico entro il periodo di infiltrazione 24h. Inoltre, la perdita di un neurone nella zona corticale è minore per un periodo più lungo di riperfusione. Pertanto, questo modello di occlusione del due-vaso è adatto per indagare la risposta immunitaria ed il recupero di un neurone durante il periodo di riperfusione dopo ischemia cerebrale.

Introduzione

Modello del topo di ischemia-riperfusione cerebrale è uno degli approcci sperimentali più ampiamente usati per studiare la fisiopatologia della indotta da ischemia cerebrale lesioni¹. Perché l'ischemia-riperfusione cerebrale attiva il sistema immunitario periferico, le cellule immuni periferiche infiltrano nel cervello ischemico e causano danno neuronale². Così, un modello del mouse affidabile e riproducibile che imita ischemia-riperfusione cerebrale è necessaria per capire la patofisiologia del colpo.

I topi C57BL/6J (B6) sono il ceppo più comunemente utilizzato negli esperimenti di corsa perché essi possono facilmente essere geneticamente manipolati. Sono disponibili due modelli comuni di MCAO/riperfusione che imitano la condizione di ischemia-riperfusione cerebrale. Il primo è il modello del filamento intraluminal di MCAO prossimale, dove un filamento di silicio è impiegato per via intravascolare occludere il flusso di sangue nel MCA; il filamento d'occlusione viene successivamente rimosso per ripristinare il flusso di sangue³. Una durata breve occlusione si traduce in una lesione della regione subcortical, mentre una più lunga durata di occlusione provoca infarti nelle zone corticali e subcortical. Il secondo modello è il modello di legatura di MCAO distale, che coinvolge extravascular legatura del MCA e CCA per ridurre il flusso di sangue attraverso la MCA, dopo che il flusso sanguigno è ripristinato attraverso la rimozione della sutura e aneurysm clip⁴. In questo modello, un infarto è causato nelle aree corticali, e il tasso di mortalità è basso. Poiché la legatura del modello MCAO/riperfusione richiede craniectomy per esporre il sito del MCA distale, il sito può essere facilmente confermato e che esamina se il flusso di sangue nel MCA distale è interrotta durante la procedura è semplice.

B6 topi mostrano notevoli variazioni nell'anatomia del loro cerchio di Willis; Questo potrebbe influenzare il volume di infarto dopo ischemia-riperfusione cerebrale^5,6,7. Attualmente, questo problema può essere superato attraverso la legatura del distale MCA⁸. In questo studio, si stabilisce un metodo per occludendo il flusso di sangue MCA e abilitazione riperfusione dopo un predeterminato periodo di ischemia. Occlusione del due-vaso del modello di ischemia-riperfusione cerebrale induce ischemia transitoria del territorio attraverso la legatura del MCA distale di destra e destra CCA, MCA con flusso sanguigno ripristinato dopo un certo periodo di ischemia. Questo modello MCAO/riperfusione induce un infarto di dimensione stabile, una massa di cervello-infiltrazione di cellule immunitarie nel cervello ischemico e un deficit comportamento dopo ischemia-riperfusione cerebrale⁴.

Protocollo

Le commissioni di utilizzo di Academia Sinica e Taipei Medical University e istituzionale cura degli animali approvato questo protocollo per l'uso di animali da esperimento.

1. modello MCAO/riperfusione

1. Fornire i topi con libero accesso all'acqua e chow fino a quando l'intervento chirurgico.
2. Autoclave la chirurgica degli strumenti e igienizzare il tavolo operatorio e attrezzature utilizzando etanolo al 70%. Indossare una mascherina chirurgica e guanti sterili. Utilizzare uno sterilizzatore a secco perlina per sterilizzare gli strumenti chirurgici se gli ambulatori multipli del mouse saranno condotta in un esperimento.
3. Anestetizzare un mouse a 12-week-old 8 (massa: 25 – 30 g) utilizzando 0,8% cloralio idrato, tramite un'iniezione intraperitoneale. Assicurarsi che il mouse anestetizzato non hanno un riflesso pedale (come testate utilizzando un pizzico di punta costante) dopo l'amputate.
4. Usare pomata veterinario per prevenire la secchezza dell'occhio per il mouse mentre è sotto anestesia.
5. Utilizzare un sistema di pressione sanguigna non invasiva per monitorare la pressione sanguigna del mouse.
6. Utilizzare un sistema di monitoraggio fisiologico per controllare la propria temperatura rettale e gas del sangue arterioso. Mantenere la temperatura corporea a 36,5 ± 0,5 ° C.
7. Iniettare per via sottocutanea il mouse con un antibiotico profilattico (25 mg/kg cefazolina)⁸.
8. Posizionare il mouse nella posizione supina il termoforo.
9. Utilizzare tagliatori elettrici per esporre la pelle dalla rasatura pelliccia del mouse sulla regione ventrale del collo, così come nella regione tra l'occhio destro e l'orecchio destro.
10. Usare crema epilatoria per cancellare la pelliccia dal corpo del mouse e disinfettare il sito chirurgico alternando scrbus con povidione-iodio ed etanolo al 70%.
11. Usare forbici iris per tagliare un'incisione di 1 cm di lunghezza del midline al collo.
12. Utilizzare pinze iris attentamente dissezionare il CCA libero dai nervi vago senza causare danni fisici.
13. Utilizzare punti di sutura seta 5-0 per isolare il CCA.
14. Fare un'incisione di 0,3 cm nel cuoio capelluto a metà tra l'occhio destro e l'orecchio destro.
15. Utilizzare MICROFORBICE per tagliare il muscolo di temporalis per esporre l'osso zigomatico e squamosa.
16. Sotto un microscopio per dissezione stereo, è possibile utilizzare un microdrill per creare un foro di diametro di mm 2 direttamente sopra la MCA distale di destra.
17. Legare il tronco di destra distale MCA utilizzando una sutura 10 / 0.
18. Occludere il CCA di destra utilizzando una clip di aneurysm nontraumatic.
19. Dopo 10 o 40 min di ischemia, rimuovere la clip per aneurisma e sutura per ripristinare il flusso sanguigno alla MCA e CCA.
20. Utilizzare una clip di sutura per sigillare l'incisione cutanea sulla testa.
21. Sigillare le incisioni della pelle cervicale utilizzando una singola sutura seguita da chiusura della pelle del collo con sutura o fiocco⁹.
22. Iniettare per via sottocutanea buprenorfina (0,1 mg/kg) per dolore sollievo⁹.
23. Mantenere la temperatura corporea del mouse a 36,5 ± 0,5 ° C il termocuscino finché non ha completamente recuperato dalla anestesia. Non restituire l'animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali, finché non ha completamente recuperato. Non lasciare incustodito l'animale fino a quando non riprende conoscenza sufficiente.
24. Posizionare il mouse nella gabbia in autoclave in modo che può liberamente accedere acqua e chow dopo completamente ha recuperato.

2. colorazione con cloruro di 2, 3,5-triphenyltetrazolium

1. Anestetizzare il mouse con 0,8% cloralio idrato tramite un'iniezione intraperitoneale.
2. Usare le forbici operative per decapitare l'animale.
3. Esporre il cranio utilizzando forbici iris per fare un'incisione nella pelle della testa.
4. Usare le forbici operative per tagliare l'anteriore dell'osso frontale.
5. Usare forbici iris per tagliare il cranio lungo la sutura sagittale.
6. Utilizzare una Pinza ossivora osso per scostare il frontale e l'osso parietale ed esporre il cervello.
7. Utilizzare pinze di iris per sezionare il cervello.
8. Utilizzare una matrice di cervello di topo e lame di rasoio per ottenere fette coronali di 2 mm.
9. Macchia le fette di cervello per 10 min a 37 ° C con 2% 2, 3,5-triphenyltetrazolium cloruro (TTC) in 1x tampone fosfato salino.
10. Sciacquare il cervello 2 x con formalina al 10%.
11. Difficoltà il cervello in formalina al 10% a temperatura ambiente per 24 h.

3. misurazione della dimensione di infarto

1. Organizzare le sezioni su uno scivolo di plastica pulito e orientare le sezioni da rostral alla caudale.
2. Eseguire la scansione della diapositiva utilizzando uno scanner. Posizionare un righello metrico e assicurarsi che è visibile nell'immagine scansionata. Capovolgere la diapositiva e scansione lato inverso.
3. Calcolare l'area di infarto di ogni sezione utilizzando il software ImageJ.
   1. Aprire il file di immagine e impostare la scala per l'immagine.
   2. Utilizzare selezione a mano libera per selezionare l'area di infarto.
   3. Utilizzare le aree di interesse (ROI) manager per misurare l'area di interesse.
4. Sommare le aree di infarto per ogni sezione e moltiplicare il risultato per lo spessore di sezione per stimare il volume di infarto totale.

4. elaborazione statistica

1. Utilizzare GraphPad Prism 6 per determinare la significatività statistica con di Student t-test.
   Nota: Le barre di errore nei grafici bar rappresentano errori standard della media (SEMs).
2. Uso G * potenza 3,1 per calcolare la dimensione del campione adeguata ed eseguire un analisi di potenza di¹⁰.

Risultati

Questa procedura MCAO/riperfusione prodotto un infarto corticale nelle vicinanze del MCA giusto e ha causato un deficit comportamento. Diversi gradi di volume di infarto indotto da ischemia (Figura 1AB) e la perdita di un neurone (Figura 1D) sono stati creati nella corteccia cerebrale di zona MCA a destra attraverso un aumento nella durata di legatura. Questo MCAO/riperfusione diminuita attività...

Discussione

Il modello di mouse MCAO/riperfusione è un modello animale comunemente impiegato per imitare l'ischemia transitoria in esseri umani. Questo modello animale può essere applicato ai ceppi di topi transgenici e knockout per studiare la patofisiologia del colpo. Diversi passaggi nel protocollo sono particolarmente critiche. (1) il microdrill deve essere utilizzato con attenzione quando si crea un buco nel cranio, con azione inappropriati facilmente causando sanguinamento da MCA. (2) la MCA non deve essere danneggiato e lo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone rongeur	Diener		Friedman
Buprenorphine	Sigma	B-044
Cefazolin	Sigma	1097603
Chloral hydrate	Sigma	C8383
Dissection microscope	Nikon	SMZ-745
Electric clippers	Petpro
10% formalin	Sigma	F5304
Germinator dry bead sterilizer	Braintree Scientific
Iris Forceps	Karl Klappenecker		10 cm
Iris Scissors	Diener		9 cm
Iris Scissors STR	Karl Klappenecker		11 cm
Microdrill	Stoelting	FOREEDOM K.1070
Micro-scissors-Vannas	HEISS	H-4240	blade 7mm, 8 cm
Mouse brain matrix	World Precision Instruments
Non-invasive blood pressure system	Muromachi	MK-2000ST
Operating Scissors STR	Karl Klappenecker		14 cm
Physiological Monitoring System	Harvard Apparatus
Razor blades	Ever-Ready
Stoelting Rodent Warmers	Stoelting	53810	Heating pad
Suture clip	Stoelting
Tweezers	IDEALTEK		No.3
Vetbond	3M	15672	Surgical glue
10-0 suture	UNIK	NT0410
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma	T8877