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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per studiare la fisiopatologia della retinopatia diabetica proliferativa utilizzando tessuti paziente-derivato, chirurgicamente asportato, fibrovascolare per coltura di tessuto nativo tridimensionale caratterizzazione ed ex vivo. Questo ex vivo modello di cultura è inoltre favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Abstract

Retinopatia diabetica (Dott) è la complicazione microvascolare più comune di diabete e una delle principali cause di cecità negli adulti in età lavorativa. Nessuna correnti modelli animali di diabete e retinopatia indotta da ossigeno sviluppano i cambiamenti progressivi full range manifestati in umana retinopatia diabetica proliferative (PDR). Di conseguenza, comprensione della patogenesi della malattia e della patofisiologia si affida in gran parte l'uso di sezioni istologiche e campioni vitrosi negli approcci che forniscono solo informazioni allo steady-state sui fattori patogeni coinvolti. La prova aumentante indica che dinamico cellula-cellula e cellula matrice extracellulare (ECM) interazioni nel contesto di tridimensionale (3D) microambienti sono essenziali per gli studi meccanicistici e funzionali verso lo sviluppo di nuovi strategie di trattamento. Di conseguenza, abbiamo supposto che il tessuto fibrovascolare patologico asportato chirurgicamente da occhi con PDR poteva essere utilizzato per attendibilmente svelare i meccanismi cellulari e molecolari di questa malattia devastante e testare il potenziale per il romanzo clinica interventi. A tal fine, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per 3D ex vivo cultura di asportata chirurgicamente paziente-derivato tessuto fibrovascolare (FT), che servirà come un modello pertinente di fisiopatologia umana di PDR. La FTs sono dissecato in espianti e incorporato nella matrice di fibrina per ex vivo di cultura e 3D di caratterizzazione. Intero-monta immunofluorescenza di FTs nativo e culture End-Point permette un'indagine approfondita della composizione del tessuto e processi multicellulari, evidenziando l'importanza della caratterizzazione di tessuto-livello 3D per scoprire caratteristiche rilevanti di Patofisiologia PDR. Questo modello permetterà la valutazione simultanea di meccanismi molecolari, cellulari/tessuto processi e le risposte al trattamento nel contesto complesso di interazioni dinamiche biochimici e fisici all'interno dell'architettura tissutale PDR e microambiente. Poiché questo modello ricapitola patofisiologia PDR, anche sarà favorevole per il test o lo sviluppo di nuovi trattamenti.

Introduzione

DR è una grave complicanza oculare del diabete, una malattia che ha raggiunto proporzioni enormi nell'ultimo trent'anni1. Vent'anni dopo la diagnosi, virtualmente tutti i pazienti con diabete di tipo 1 e il 60% dei pazienti con segni presenti di tipo 2 diabete di retinopatia, rendendo diabete per sé uno dei principali cause di cecità in età adulti2di lavoro. Secondo il livello di degenerazione microvascolare e danno ischemico, DR è classificata in DR non proliferativa (non-PDR) e DR proliferative (PDR). La malattia di stadio finale, PDR, è caratterizzata da neovascolarizzazione indotta da ischemia e infiammazione e fibrotiche risposte all'interfaccia vitreo-retinica. In condizioni non trattate, questi processi porterà alla cecità a causa di emorragia del vitreo, fibrosi retinica, distacco di retina trazionale e glaucoma neovascular3,4. Nonostante i recenti progressi, opzioni correnti di trattamento di destinazione solo DR tappe, tra cui edema maculare diabetico e PDR, quando già ne è danno retinico. Inoltre, una grande percentuale di pazienti DR non beneficia attuale armamentario di trattamento, che indica un urgente bisogno di terapie migliori4,5,6.

Più altri iovivo n malattia/modelli di sviluppo e modelli animali diabetici sono stati sviluppati fino ad oggi, ma nessuno di loro ricapitola l'intera gamma di caratteristiche patologiche osservate in human PDR7,8. Inoltre, la prova aumentante indica che le risposte al trattamento siano strettamente collegate nella composizione di ECM come pure la disposizione spaziale e l'interazione tra il microambiente cellulare e acellular9. Abbiamo, quindi, di sviluppare un modello clinicamente rilevante del PDR umano utilizzando materiale patologico FT che comunemente viene asportato da occhi sottoposti a vitrectomia come parte dell'amministrazione chirurgica di PDR10.

Questo manoscritto descrive il protocollo per il 3D ex vivo cultura e caratterizzazione della-asportata chirurgicamente, PDR paziente-derivato patologico FT. Il metodo qui descritto è stato utilizzato in una recente pubblicazione che ha dimostrato il successo decostruzione del nativo 3D paesaggio tessuto PDR e ricapitolazione delle caratteristiche di patofisiologia PDR inclusi angiogenici e fibrotiche risposte di anormale strutture vascolari11. Questo modello ha anche rivelato caratteristiche novelle che non possono essere facilmente apprezzati da sezioni istologiche sottili, come nello spazio limitano di apoptosi e proliferazione nonché vascolare isolotto formazione11. Liquido vitroso è stato utilizzato con successo di altri utenti su culture di sferoide endoteliale 3D per valutare il suo potenziale angiogenico e l'efficacia di angiostatic molecole12. Quando combinato con uno sferoide in vitro delle cellule endoteliali linfatiche 3D (LEC) analisi usando vitroso PDR come stimolante di germogliatura, nostro modello ha rivelato che il contributo di entrambi vitreal solubili fattori spunti anche come locale all'interno del tessuto neovascolare per as ancora capito male LEC coinvolgimento nel PDR patofisiologia3,11. Nella gestione del PDR, chirurgia vitreo-retinica è una procedura di routine eseguita ancora impegnativa. Come tecniche e strumentazioni chirurgiche sono vedendo avanzamento continuo e raffinatezza, rimozione tempestiva e conservatore di fibrovascolare proliferativa esemplare non solo migliora il risultato di visione ma fornisce anche materiale tissutale inestimabile per la indagine di risposte di patofisiologia e trattamento di PDR negli aspetti traslazionali complessi del microenvironment del tessuto umano vivo.

Protocollo

Questa ricerca è stata approvata dal comitato etico dell'ospedale dell'Università di Helsinki e Institutional Review Board. Firmato il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente.

1. preparazione di soluzioni, mezzi e attrezzature

  1. Preparare le seguenti attrezzature prima della raccolta del tessuto fibrovascolare (FT) per garantire un'elaborazione rapida.
    1. Pinzette di microdissection sterile-autoclave due.
    2. Preparare 1 x tampone fosfato salino (PBS) sciogliendo 1 compressa PBS pre-pesato (0,14 M NaCl, KCl, 0,010 M PO4-3M 0,0027) in 900 mL di acqua deionizzata e mescolare per sciogliere. Regolare il volume di acqua fino a 1 L e sterile-autoclave la soluzione pronta. Conservare a RT.
    3. Raccogliere la soluzione di cui sopra e attrezzature in un cestino, insieme con un bisturi sterile monouso, una piastra di coltura sterile 6 cm cella e cinque piastre per colture cellulari di 12-pozzetti sterili.
  2. Preparare un 6 mg/mL soluzione di fibrinogeno in matasse bilanciato sale soluzione (HBSS) sciogliendo 30 mg di fibrinogeno umano del plasminogeno-vuotati in 5 mL di HBSS, utilizzando un tubo da 50 mL, immerso in un bagno di acqua a 37 ° C, per almeno 1 h.
    Nota: Questa soluzione può essere mantenuta nel bagno d'acqua (37 ° C) per 7 h (massimo 10 h) prima dell'uso.
  3. Preparare l'ex vivo di coltura aggiungendo 5% siero fetale di vitello (FCS) o siero umano 5%, 0,4% supplemento di crescita delle cellule endoteliali, 10 ng/mL ricombinante umano fattore di crescita epidermico, 1 idrocortisone μg/mL e 50 μg/mL Gentamicina a commercialmente disponibile mezzo di crescita delle cellule endoteliali e tenere a bagnomaria a 37 ° C fino all'utilizzo. Conservare a 4 ° C per fino a un mese.

2. dissezione del tessuto fibrovascolare

  1. Raccogliere il tessuto fibrovascolare (FT) che è stato asportato da soggetti umani sottoposti a chirurgia vitreo-retinica microincisione trans-congiuntivale, da 23 o 20 gauge tre-orificio pars il plana vitrectomy come parte dell'amministrazione chirurgica vitreoretinica del PDR.
    Nota: Il FT è asportato mediante segmentazione e delaminazione, tagliare se necessario con microforbici e rimosso dalla cavità vitrosa con Micropinze intraoculare fine-presa da chirurgo vitreo-retinica con esperienza. Estrema cura deve essere presa per rimuovere FT integro senza causare danni a strutture oculari, compreso il nervo ottico o arcade vascolare temporale in cui si trova più comunemente il tessuto patologico neovascolare. Le dimensioni del tessuto asportato è variabile, solitamente compresa tra 3 e 50 mm2.
  2. Mantenere il FT in una piastra di coltura cellulare di 6 cm o provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBS sterile posizionato su ghiaccio bagnato e trasferirlo immediatamente alla ricerca di laboratorio per l'elaborazione.
    Nota: È essenziale che l'unità di ricerca (laboratori) è fisicamente vicino la sala operatoria dell'ospedale (OR) per ridurre al minimo i tempi di trasferimento delle piccole FT asportato. In questo caso il trasferimento dura meno di 5 minuti e gli espianti sono incorporati all'interno della fibrina solitamente in 1-1,5 h (massimo 2 ore) dopo la rimozione chirurgica. L'impatto dei tempi di trasferimento più lunghi sulla cultura 3D avrebbe bisogno di essere testati.
  3. Posizionare il FT in una piastra di coltura cellulare di 6 cm contenente 1 mL di PBS a temperatura ambiente (TA, 25 ° C) e acquisire immagini del tessuto utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito con un obiettivo 5x.
    Nota: Le immagini sono acquisite per la documentazione e valutazione qualitativa. Sarà possibile osservare la dimensione del tessuto, la densità e la composizione generale (ad es., le strutture vascolari).
  4. Tagliate il FT ~ 1 mm a2 pezzi sotto uno stereomicroscopio di dissezione in posizione verticale, utilizzando una pinzetta sterile bisturi e microdissection. Tenere il tessuto, immerso in PBS, utilizzando una pinzetta microdissection ed eseguire tagli netti usando un bisturi sterile. Evitare di strappare FT, come ciò modificherebbe le strutture native fibrovascolare.
  5. Posizionare ogni singolo pezzo in un pozzetto di una piastra di coltura 12-pozzetti cella contenente 1 mL di PBS sterile.
    Nota: Se necessario, diffondere delicatamente il FT sulla piastra, usando la pinzetta microdissection, prima dell'esecuzione di tagli.

3. fusione verticale fibrina Gel goccioline per la caratterizzazione di FT nativo e coltura Ex Vivo

  1. Filtro sterile la soluzione di fibrinogeno pronta preparata al punto 1.2, con un filtro di 0,22 μm, montato in una siringa da 10 mL.
  2. Preparare aliquote della soluzione di fibrinogeno (25 µ l per provetta da 1,5 mL) tenga a RT. Prepare un'aliquota per fibrina gel / ogni pezzo FT ottenuta dopo la dissezione, e un paio di aliquote supplementare per il test della fibrina gel formazione.
  3. Preparare una soluzione di HBSS contenente 4 unità/mL di trombina e 400 μg/mL di aprotinina, chiamato aldilà TA soluzione e tiene a RT. Prepare tanto soluzione TA come necessario, a seconda del numero di pezzi ottenuti dopo la dissezione (25 μL di soluzione di TA è utilizzato per ogni Gel di FT/fibrin) e un importo supplementare (ad es., 250 μL) per testare la formazione di gel di fibrina e garantire che la soluzione abbastanza sia disponibile in tutta colata delle gocce di gel di fibrina.
    Nota: La trombina è richiesta per la polimerizzazione della fibrina mentre aprotinina è aggiunto per prevenire il degrado del gel di fibrina da proteasi cellulari espresse dalle FTs13,14.
  4. Testare i tempi di formazione del gel di fibrina: aggiungere 25 μL di soluzione di TA per la soluzione di fibrinogeno 25 μL aliquotati preparata al punto 3.2 e, utilizzando un'altra pipetta impostato su 50 μL, mescolarvi il tubo pipettando e dispensare in una piastra di coltura cellulare di 6 cm , formando una gocciolina in posizione verticale.
    Nota: La formazione del gel di fibrina dovrebbe avvenire in ~ 1 min. Se questo richiede oltre 1,5 min, la concentrazione di trombina nella soluzione TA preparata al punto 3.3 può essere aumentata aggiungendo altre soluzione stock di trombina. Può essere aggiunto un decimo del volume inizialmente usato della soluzione di riserva di trombina, ripetutamente, fino a quando la formazione di gel di fibrina si verifica entro 1,5 min. Il tempo di formazione di gel di fibrina è critico per la tridimensionalità della cultura, come gel di rapida formazione (entro 1,5 minuti) impedisce il pezzo FT da affondare fino in fondo il gel di fibrina e venendo così a contatto con la superficie di plastica 2D della cella piastra di coltura, che può condurre all'adesione cellulare 2D e di conseguenza.
  5. Posizionare il pezzo di un FT al centro di un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti utilizzando una pinzetta sterile e rimuovere l'eccesso di PBS di pipettaggio con una pipetta di 0.5-10 μL per evitare la forza di aspirazione sulla FT. Nel caso in cui che il tessuto si attacca alla pinzetta, è necessario utilizzare una pinzetta aggiuntiva per facilitare il posizionamento del pezzo di tessuto sulla piastra.
    Nota: Gel FT/fibrina può essere lanciato anche su 48 pozzetti per ridurre l'utilizzo di reagenti. Tuttavia, questo è più impegnativo come lo spazio è più limitato e fibrina si diffonderà se viene a contatto con la parete ben.
  6. Aggiungere 25 μL di soluzione di TA per la soluzione di fibrinogeno μL 25 aliquotati in passo 3.2, e per mezzo di un'altra pipetta impostato su 50 μL mix nel tubo di pipettaggio. Dispensare sul pezzo FT ben disposto sul piatto, e pipetta su e giù per 2 - 3 volte al fine di includere il pezzo FT all'interno la goccia in posizione verticale, fornendo una matrice circostante 3D al FT.
    Nota: Assicurarsi che la FT non viene aspirato durante il pipettaggio e che non si formano bolle d'aria. Assicurarsi inoltre che miscelazione, dispensa e pipettaggio vengono eseguite rapidamente come il gel di fibrina si forma entro 1,5 min, come testato al punto 3.4. Se la colata gel di fibrina su 48 pozzetti, utilizzare 20 μL di soluzione di fibrinogeno e 20 μL di soluzione di TA.
  7. Ripetere i passaggi da 3.5 e 3.6 per tutti i pezzi FT.
  8. Consentire i gel di fibrina a solidificare incubando le piastre in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% CO2.
  9. Dopo 0,5-1 h, controllare che il gel di fibrina è completamente formato da attentamente inclinando la piastra. Procedere al punto 3.10 quando il gel non si muove quando la piastra viene inclinata, che indica che la formazione di gel di fibrina è stata completata.
  10. Sovrapporre i gel FT/fibrina con ex vivo terreno di coltura (600 μL/pozzetto in piastre da 24) o 300 μL/pozzetto in piastre da 48 completati con 100 μg/mL aprotinina. Pipettare delicatamente il mezzo di sospensione dispensazione.
    Nota: Qui, aprotinina è usato per prevenire il degrado del gel di fibrina da proteasi cellulari espresse dalle FTs13,14. L'ex vivo di coltura inoltre può essere completato con fattori di crescita ricombinanti, come VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (Vedi Tabella materiali)11.
  11. Rimettere il FT ex vivo piastra di coltura nella 37 ° C, 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare e la cultura per il periodo di tempo desiderato (ad esempio, 2 - 18 giorni, più cultura periodi dovrà essere testato). Sostituire il 50% del mezzo con fresco ex vivo di coltura ogni tre giorni.

4. "a matrice" Imaging

  1. Acquisire immagini del FT ex vivo culture nello stesso giorno (giorno 0) e a intervalli regolari (ad esempio, ogni altro giorno), utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito, per seguire la crescita 3D.
    Nota: Le immagini ottenute utilizzabile per la quantificazione di conseguenza il FT come la lunghezza totale di due diametri perpendicolari attraverso l' espianto11.

5. nativo FT ed Ex Vivo cultura End-Point

Nota: I gel FT/fibrina possono essere coltivati ex vivo per il periodo di tempo desiderato (FT ex vivo culture) o fissati lo stesso giorno (nativo FT) per nativo di caratterizzazione FT11.

  1. Difficoltà il nativo o 20ft ex vivo culture sostituendo il terreno di coltura con 1 mL/bene di paraformaldeide al 4% in soluzione di PBS, per 1 h a TA. Per i nativi gel FT/fibrina, Difficoltà 0,5-1 h dopo l'aggiunta dell'ex vivo cultura medio (se i gel di fibrina non hanno stato immerso nel mezzo, fissazione li danneggia).
    Nota: Eseguire questo passaggio in cappa come paraformaldeide è corrosivo, tossico e cancerogeno.
  2. Sciacquare i gel FT/fibrina con tre min 5 lavaggi in PBS (2 mL/pozzetto).
  3. Sostituire il PBS con 2ml/bene di PBS contenente 0,02% di sodio azide e conservare i gel di fibrina fisso a 4 ° C fino al momento di un'ulteriore elaborazione. Sigillare le piastre con film di paraffina per garantire che i gel FT/fibrina non asciugano in deposito.
    Nota: Eseguire questo passaggio in cappa come sodio azide è tossica.

6. intero-monta immunofluorescenza

Nota: Questo protocollo dura 5 giorni e può essere interrotto con le incubazioni overnight dove indicato. Non lasciare che la fibrina gel a secco in qualsiasi punto. Se non diversamente indicato, tutti i passaggi vengono eseguiti a RT.

  1. Preparare le seguenti soluzioni prima di iniziare il protocollo di colorazione.
    1. Soluzione di post-fissazione: preparare la soluzione di acetone: metanolo di 50: 50 mescolando uguali quantità di acetone e metanolo (ad es., 50 mL). Conservare a-20 ° C. Preparare questa soluzione ultima il giorno prima la colorazione. Questa soluzione può essere conservata torna a-20 ° C ed essere utilizzata per gli stainings successivi.
      Nota: Preparare questa soluzione in cappa come acetone e metanolo sono infiammabili e pericolosi per la salute.
    2. Soluzione bloccante: preparare un 15% siero fetale bovino (FBS), 0,3% ottile fenolo etossilato soluzione PBS prima aggiunta del 15% FBS di PBS. Aggiungere ottile fenolo etossilato e mescolare per sciogliere. Conservare a 4 ° C.
      Nota: Questa soluzione può essere preparata in grande quantità in anticipo, memorizzati in 15ml aliquote a-20 ° C e scongelati prima dell'uso, il giorno quando viene avviato il protocollo di colorazione. Utilizzare un aliquote preparata al momento o appena scongelati per ogni protocollo di colorazione.
    3. Soluzione di lavaggio: preparare 1 L di PBS completati con 0,45% ottile fenolo etossilato aggiungere 4,5 mL di ottile fenolo etossilato a 995,5 mL di PBS. Mescolare per sciogliere. Conservare a RT.
  2. Sollevare le goccioline attentamente dalla piastra utilizzando una spatola in acciaio inox segati. Smontare la gocciolina prima dai bordi prima di sollevare il centro e trasferire in un pozzetto della piastra 12-pozzetti contenente 1 mL di PBS.
    Nota: Eseguire post-fissazione, lavaggi e blocchi passi in questo formato di piastra.
  3. Post-fissare le gocce con 1 mL di soluzione di acetone: metanolo ghiacciato 50: 50 per ~ 1 min (al confine delle goccioline diventeranno bianco).
    Nota: Eseguire questo passaggio in cappa come acetone e metanolo sono pericolosi per la salute.
  4. Sciacquare con 3-5 lavaggi in 2 mL di PBS (le goccioline affonderà nella soluzione PBS quando reidratazione è completa).
    Nota: Evitare di toccare le goccioline con la punta della pipetta, dopo post-fissazione, essi sono appiccicose in plastica. In tutto il protocollo, evitare aspirazione Post-fix, anticorpo, blocco e soluzioni di lavaggio mediante aspirazione, poiché questo potrebbe danneggiare o distruggere completamente le goccioline. Invece, la piastra di inclinazione e rimuovere con cautela le soluzioni usando una pipetta μL di 500-5.000.
  5. Centrifugare la soluzione bloccante per 15 min a 21.000 x g e a 4 ° C al fine di rimuovere i detriti.
    Nota: La soluzione può essere aliquotata in provette da 1,5 mL per centrifugazione. La soluzione non utilizzata può essere conservata a 4 ° C e utilizzata per tutti i passaggi successivi pertinenti.
  6. Incubare le goccioline in 500 μL ostruisce soluzione per 2 h a TA.
    Nota: Per ridurre il volume di soluzione utilizzato il blocco, la piastra può essere inclinata su un supporto e appena 300 μL di soluzione/goccia può essere utilizzato.
  7. Preparare la miscela di anticorpo primario (almeno 30 μL/gocciolina) a diluizione appropriata in blocco soluzione e centrifugare per 15 min a 21.000 x g a 4 ° C.
  8. Trasferire le goccioline in tondo (U)-piastra a 96 pozzetti di fondo utilizzando una spatola rotonda-orlato e incubare con almeno 30 μL/goccia della miscela anticorpo primario durante la notte a 4 ° C.
  9. Il giorno seguente, trasferimento le goccioline in 12-pozzetti piastra contenente 2 mL di soluzione/pozzetto, di lavaggio risciacquo con tre 5 min lava prima e poi con lavaggi di nove 30 min. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) durante la notte a 4 ° C.
  10. Il giorno seguente, lavare tre volte con PBS e trasferire le goccioline in tondo (U)-piastra a 96 pozzetti di fondo.
  11. Durante i lavaggi, preparare la miscela di anticorpo secondario coniugato fluoroforo appropriato (diluito 1: 500, almeno 30 μL/goccia) in blocco soluzione e centrifugare per 15 min a 21.000 x g e a 4 ° C.
  12. Trasferire le goccioline in un tondo (U)-piastra a 96 pozzetti di fondo utilizzando una spatola rotonda-orlato e incubare con almeno 30 μL di miscela di anticorpo secondario, per 4 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
    Nota: Eseguire tutte le successive incubazioni e lavaggi al riparo dalla luce.
  13. Trasferire le goccioline in 12 pozzetti contenenti 2 mL di soluzione/pozzetto usando una spatola di turno-orlato, risciacquo con tre lavaggi di 5 min prima del lavaggio e poi con quattro lavaggi di 30 min. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) durante la notte a 4 ° C.
  14. Il giorno seguente, sciacquare i gel con cinque min 30 lavaggi e quindi tre volte con PBS. Lasciare l'ultimo lavaggio (2 mL) durante la notte a 4 ° C.
  15. Il giorno seguente, trasferire le goccioline in un tondo (U)-piastra a 96 pozzetti di fondo utilizzando un turno-edged spatola e controcolorazione nuclei incubando con 10 μg/mL Hoechst macchia nucleare (almeno 30 μL/goccia) per 30 minuti a TA.
    Nota: Montaggio supplementato con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per nuclei colorazione di contrasto può essere utilizzato in alternativa. In tal caso, questo passaggio e 6.16 vengono ignorati, procedere direttamente al passaggio 6.17.
  16. Trasferire le goccioline in 12 pozzetti contenenti 2 mL di PBS/pozzetto usando una spatola rotonda-orlato e lavare tre volte con PBS.
  17. Montare le goccioline sul vetrino del microscopio come segue:
    1. Applicare uno strato stretto di mezzo di montaggio rapido indurimento sui bordi di un coprioggetto di forma quadrata 22 mm x 22 mm e lasciare asciugare per ~ 1 minuto. Eseguire questo passaggio per ogni goccia individualmente, per evitare eccessivo indurimento di mezzo di montaggio.
      Nota: Eseguire questo passaggio in cappa come il mezzo di montaggio rapido indurimento è pericoloso per la salute.
    2. Sciacquare la goccia mediante immersione in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenenti 2 mL di acqua deionizzata e trasferire su un vetrino da microscopio, usando una spatola rotonda-orlato. Rimuovere l'acqua in eccesso utilizzando un piccolo pezzo di carta assorbente.
    3. Dispensare 15 μL di mezzo di montaggio antifade non indurente sulla goccia.
      Nota: In alternativa, se non è stato utilizzato nucleare macchia di Hoechst, mezzo di montaggio contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) può essere utilizzato.
    4. Delicatamente posizionare il vetro di copertura, con il mezzo di montaggio rapido indurimento affrontando il vetrino al microscopio, sopra la goccia e lasciar decantare.
      Nota: Il mezzo rapido indurimento attaccheranno alla diapositiva microscopica e mantenere la goccia sul posto.
  18. Ripetere il passaggio 6.17 per tutte le goccioline. Montare due gocce su ogni vetrino da microscopio.
  19. Lasciate che le diapositive asciugare a temperatura ambiente per ~ 2 h e conservare a 4 ° C durante la notte. Assicurarsi che le diapositive sono posizionate orizzontalmente e protetto dalla luce.
  20. Immagine il nativo macchiato o end-point FT ex vivo culture utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza verticale dotato di una funzione di sezionamento ottica e 20x o obiettivo 40x. Utilizzare piastrelle funzione per acquisire una maggiore area del tessuto in una sola volta.

Risultati

Più profonda comprensione delle proprietà di tessuto fibrovascolare PDR e l'espressione della proteina ha fatto affidamento principalmente sui campioni vitrosi e sottile istologico FT sezioni3,15,16,17. Per sviluppare un metodo per un'indagine approfondita dell'organizzazione del tessuto 3D e pluricellulari processi fisiopatologici del PDR, abbiamo precisato p...

Discussione

Considerando l'importanza del microambiente tessuto pertinenti per affidabile e funzionale delle cellule e molecolare risultati meccanicistici, è imperativo trovare appropriati modelli sperimentali che forniscono questo ambiente di tessuto. Descritto nel presente documento ex vivo PDR cultura modello per FTs fibrina-incorporato consente l'indagine dei meccanismi della patofisiologia PDR nel contesto dei campioni clinici PDR nativo, complesso e pluricellulare.

Fasi critiche all'intern...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori sono molto grati ai colleghi di retina medica e chirurgica, infermieri e tutto il personale dell'unità diabetica e unità di chirurgia vitreo-retinica presso il reparto di oftalmologia, ospedale dell'Università di Helsinki per partecipare attivamente nel reclutamento dei pazienti. Ringraziamo Biomedicum unità di Imaging molecolare per le strutture di formazione immagine. Ringraziamo Anastasiya Chernenko per l'eccellente assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni da Accademia di Finlandia (KL), Università di Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Istituto finlandese di cancro (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandese Eye Foundation (SL), occhio e Fondazione Banca di tessuto (SL), Maria e Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) e assegni di ricerca clinica HUCH (TYH2018127 dopo TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) così come il programma di dottorato in biomedicina (EG).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
MicroforcepsMedicon07.60.03Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - SterileSwann-Morton0513Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)Greiner Bio-One391-3210Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-wellGreiner Bio-One392-0049Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mLGreiner Bio-One391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mLGreiner Bio-One525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDFMilliporeSLGV033RSUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mLBraun4606108VUsed to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mLFisherFB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-wellNunc142475Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottomGreiner Bio-One392-0019Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless SteelVWR82027-528Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1Menzel/Fisher15727582Used for mounting
Microscope slidesFisherKindler K102Used for mounting
Absorbent paperVWR115-0202Used for mounting
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
PBS tabletsMedicago09-9400-100Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human PlasmaCalbiochem341578
Hanks Balanced Salt SolutionSigma-AldrichH9394-500MLUsed for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serumGibco10270106Used for preparing the blocking solution
Human SerumSigma-AldrichH4522Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/mlBiowestL0011-100
Endothelial cell media MV KitPromocellC-22120Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azideSigma-AldrichS2002Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
AcetoneSigma-Aldrich32201-2.5L-MUsed to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
MethanolSigma-Aldrich32213Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)Sigma-AldrichT9284Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mMLife Technologies62249For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesH-1000Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting mediumSigma-Aldrich03989-100mlTOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powderSigma-AldrichT9549-500UN Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powderSigmaA3428Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
NameCompanyCatalog NumberComments
Growth factors
Recombinant human VEGFAR&D Systems293-VE-01050 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFCR&D Systems752-VC-025200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβMilliporeGF3461 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGFMillipore01-10650 ng/ mL final concentration
NameCompanyCatalog NumberComments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)DakoM0823Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)DakoM716501-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)DakoM070129-2Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68ImmunoWayRLM3161Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)Cell Signalling9664Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)DakoM731429-2Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAPDakoZ0334Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67Leica MicrosystemsNCL-Ki67pUsed at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1R&D SystemsAF2089Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2MilliporeAB5320Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1ReliaTech102-PA32Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1R&D SystemsAF2727Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)MilliporeMAB3757Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)SigmaC6198Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
NameCompanyCatalog NumberComments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-11012Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgGThermo ScientificA-11057Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgGThermo ScientificA-11036Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgGMolecular ProbesA-21468Used at 1:500 dilution
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscopeZeissFor imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscopeOlympusFor FT dissection
LSM 780 confocal microscopeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with ApotomeZeissFor imaging of whole-mount immunostained FT

Riferimenti

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