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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Trasporto retrogrado delle proteine di superficie delle cellule di Golgi è essenziale per mantenere l'omeostasi della membrana. Qui, descriviamo un metodo per analizzare biochimicamente trasporti di superficie--Golgi cellulare di proteine ricombinanti utilizzando nanobodies funzionalizzati in cellule HeLa.

Abstract

Trasporto di proteine e membrane dalla superficie delle cellule di Golgi e oltre è essenziale per l'omeostasi, organello identità e fisiologia. Per studiare il traffico della proteina retrograda, abbiamo recentemente sviluppato un versatile basato su nanobody toolkit per analizzare il trasporto dalla superficie delle cellule al complesso di Golgi, mediante imaging cellulare fisso e dal vivo, da microscopia elettronica, o biochimicamente. Abbiamo progettato funzionalizzati anti-verde proteina fluorescente (GFP) nanobodies — raccoglitori di proteine ad alta affinità, monomerico e piccoli — che possono essere applicati alle linee cellulari che esprimono le proteine di membrana di interesse con una parte extracellulare di GFP. Derivatizzato nanobodies associato ai reporter GFP sono specificamente interiorizzato e trasportato sulle spalle lungo rotte ordinamento il reporter. Nanobodies sono stati funzionalizzati con fluorofori seguire trasporto retrogrado mediante microscopia a fluorescenza e immagini, con ascorbato perossidasi 2 (APEX2) per studiare la localizzazione ultrastrutturale dei reporter-nanobody complessi da elettrone dal vivo microscopia e con motivi di solfatazione (TS) di tirosina per valutare la cinetica dell'arrivo di trans-Golgi network (TGN). In questo articolo metodologico, descriviamo la procedura generale per batterico esprimere e purificare nanobodies funzionalizzati. Vi illustriamo l'uso potente del nostro strumento utilizzando il nanobodies mCherry - e TS-modificato per analizzare l'assorbimento endocitosi e TGN arrivo di proteine cargo.

Introduzione

Retrogrado traffico di proteine e di lipidi dalla superficie delle cellule ai vari compartimenti intracellulari è cruciale per il mantenimento dell'omeostasi di membrana per controbilanciare la secrezione e riciclare componenti di anterograda trasporto macchinari1 , 2. a seguito di internalizzazione tramite endocitosi clatrina-dipendente o - indipendente, carico della proteina e del lipido innanzitutto popolare presto endosomes da dove si trovano ulteriori reindirizzamento sia lungo il sistema endolisosomiale, riciclato alla membrana plasmatica, o mirati alla rete trans-Golgi (TGN). Riciclaggio da endosomi e/o di superficie delle cellule a livello di TGN è parte del ciclo funzionale di un numero di recettori transmembrana carico anterograda, quali i recettori di mannosio-6-fosfato catione-dipendenti e indipendenti del catione (CDMPR e CIMPR) consegna recentemente sintetizzato idrolasi lisosomiale da TGN tardi endosomi e lisosomi3,4,5, sortilina e SorLA6,7e Wntless (WLS) trasporto di ligandi di Wnt alla superficie delle cellule 8 , 9 , 10 , 11. altre proteine Estratto torna a TGN sono TGN46 e sue isoforme correlate12,13,14, Rullanti ( N- ethylmaleimide-sensibili fusione fattore allegato recettori solubili) 15 , 16 , 17, precursore dell'amiloide (APP) di proteina18,19, anchilosi progressiva (ANK) proteina20, trasportatori metallici quali ATP7A/B o DMT121,22e del transmembrane elaborazione enzimi tra cui carbossipeptidasi D, furin o BACE123,24,25. Oltre a queste proteine endogene, tossine batteriche e pianta (ad es., tossina Shiga e colera, ricina e abrina) dirottare macchinari di trasporto retrogrado per raggiungere il pronto soccorso per dislocazione nel cytosol26,27, 28,29.

Al fine di analizzare direttamente il traffico retrograda, precedentemente abbiamo sviluppato un kit di strumenti basati su nanobody per etichettare e seguire le proteine cargo dalla superficie delle cellule per compartimenti intracellulari30. Nanobodies rappresentano una nuova famiglia di proteine leganti derivati da omodimeriche pesante-catena-solo gli anticorpi (hcAbs) che si presentano naturalmente in camelidi e pesci cartilaginei31,32. Essi costituiscono il dominio variabile di catene pesanti (VHH) di hcAbs e presentano molti vantaggi sopra gli anticorpi convenzionali (ad es., IgG): sono monomerici, piccolo (~ 15 kDa), altamente solubile, privo di legami bisolfurico, può essere espresso batterico e selezionato per legame ad alta affinità33,34,35,36. Per rendere il nostro strumento di nanobody versatile e ampiamente applicabili, abbiamo impiegato nanobodies funzionalizzati anti-GFP per le proteine di superficie-etichetta e pista con GFP al loro dominio extracellulare/lumenal etichettate. Dalla funzionalizzazione di nanobodies con mCherry, ascorbato perossidasi 2 (APEX2) trasporto retrogrado37, o sequenze di solfatazione (TS) tirosina di proteine transmembrana carico bonafide può essere analizzato da uno fisso e live imaging cellulare, di la microscopia elettronica, o biochimicamente. Poiché la solfatazione di tirosina mediata da tyrosylprotein sulfotransferasi (TPST1 e TPST2) è una modificazione post traduzionale limitato a trans-Golgi/TGN, possiamo studiare direttamente trasporti e cinetica di proteine di interesse dalla superficie delle cellule a questo intracellulare Golgi vano38,39,40.

In questo articolo di metodi, descriviamo la facilità di produzione di nanobodies funzionalizzati (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry e derivati), adatto per un numero di applicazioni per analizzare il trasporto retrogrado in cellule di mammifero30. Ci concentriamo principalmente sull'uso di TS per volta il sito nanobody per l'analisi del traffico intracellulare dalla superficie delle cellule al comparto della solfatazione.

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Protocollo

1. batterica trasformazione con Nanobodies funzionalizzati

Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato per l'espressione, la purificazione e l'analisi di nanobodies funzionalizzati anti-GFP come descritto in precedenza30. Derivatizzazione con altre parti di proteine potrebbero essere necessarie modifiche del presente protocollo standard.

  1. Scongelare i batteri chemocompetent (~ 100 µ l) adatti per l'espressione della proteina (ad es., Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) cellule) posizionandoli sul ghiaccio.
    Nota: Preparare chemocompetent cellule batteriche secondo le procedure standard di laboratorio. In alternativa, le cellule batteriche chimicamente competenti possono essere acquistate in commercio.
  2. Aggiungere 50 ng di un plasmide codifica nanobodies funzionalizzati. Per consentire sufficiente biotinylation site-specific del reporter nanobody durante espressione batterica, anche aggiungere un triplice eccesso (150 ng) di un plasmide di espressione batterica codifica ligasi biotina BirA (Vedi anche tabella 1 per informazioni plasmide). Pipetta da delicatamente su e giù.
    Nota: Se nanobody biotinylation non è necessario o i giornalisti nanobody sono privi di un peptide di accettore di biotina (BAP), co-trasformazione con un plasmide codifica BirA non è necessaria.
  3. Incubare le cellule batteriche per 30 min in ghiaccio.
  4. Calore di scossa le cellule batteriche inserendoli per 1 min a 42 ° C in un bagno d'acqua o un blocco di riscaldamento.
  5. Aggiungere 1 mL di temperatura (RT) medio di brodo (LB) di Luria e incubare i batteri trasformati in un agitatore per 1h a 37 ° C per permettere l'espressione fenotipica dei geni di resistenza. Per preparare 1L LB medi, Estratto di equilibrio 5 g di lievito, 10g di tryptone e 10 g di NaCl, riempire con acqua e sterilizzare in autoclave. Se il nanobody funzionalizzati ha stato subclonato in un vettore di espressione contenente resistenza all'ampicillina/carbenicillina, passaggio 1.5 può essere omesso.
  6. A pellet i batteri a 11.000 x g per 1 min e risospendere in 100 µ l di terreno LB fresco.
  7. Piastra i batteri sospesi su piastre LB contenenti i rispettivi antibiotici (ad esempio, con 50 µ g/mL kanamicina e 50 carbenicillina µ g/mL quando i batteri sono stati co-trasformati con nanobody reporter e BirA come indicato in precedenza (punto 1.2)).
  8. Posizionare le piastre di LB in un incubatore a 37 ° C e lasciare crescere durante la notte (O/N).
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui memorizzando la piastra LB con colonie coltivate a 4 ° C. Utilizzare parafilm per sigillare piastre LB.

2. batterica coltura liquida e induzione dell'espressione di Nanobody funzionalizzati

  1. Scegli una colonia batterica contenente il vettore di interesse dalla piastra e lasciarlo crescere in una bottiglia contenente 20 mL di LB supplementato con antibiotici O/N in un agitazione incubatore a 37 ° C (Vedi anche punto 1.7 per quanto riguarda gli antibiotici di scelta).
  2. Giorno successivo, diluire la coltura batterica coltivati da 20 mL in un matraccio contenente 1 L di LB medium con gli antibiotici di scelta.
  3. Continuare a incubare la coltura batterica a 37 ° C fino a raggiungere un OD600 di 0,6-0,7. Consentire la cultura raffreddare a RT prima di indurre l'espressione della proteina.
  4. Indurre l'espressione della proteina di nanobodies funzionalizzati e BirA con l'aggiunta di 1 mL di 1 M di isopropile-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM dell'induttore (1:1, 000 diluizione). Anche aggiungere 10 mL di una soluzione della madre di d-biotina mM 20 conseguente 200 µM d-biotina nel terreno di crescita per consentire biotinylation dell'epitopo BAP presente in nanobodies funzionalizzati (Vedi anche tabella 1 per informazioni plasmide)
    Nota: La soluzione di riserva d-biotina è preparata in ddH2O e portata in soluzione da sospensione aggiunta di 500mm NaH2PO4. In alternativa, d-biotina può anche essere sciolto in DMSO. Per produrre nanobodies fusa a APEX2 (VHH-APEX2), il mezzo LB deve essere integrato inoltre con il cloridrato di 1 mM 5-aminolevulinico acido (dALA) per promuovere l'incorporazione del heme. dALA è preparato come una soluzione stock di 100 mM in ddH2O.
  5. Incubare la coltura batterica di IPTG-indotto 1 L a 30 ° C per 4 h per VHH-2xTS, a 20 ° C o RT O/N per VHH-APEX2 o a 16 ° C O/N per VHH-mCherry (Vedi anche tabella 1 per informazioni plasmide).
    Nota: Condizioni di espressione per un nuovo costrutto di nanobody devono essere ottimizzate dallo sperimentatore.
  6. Trasferire la coltura batterica dal pallone in una bottiglia di centrifugazione 1L e agglomerare le cellule a 5.000 x g a 4 ° C per 45 min. decantare il supernatante e continuare con la purificazione.
    Nota: Il protocollo può essere sospesa qui memorizzando il pellet batterico a-80 ° C a tempo indeterminato. Il pellet per VHH-APEX2 o VHH-mCherry è tipicamente brunastro (a causa dell'eme incorporato) o rosa, rispettivamente.

3. purificazione di Nanobodies funzionalizzati

  1. Se necessario, scongelare il pellet batterico congelato sul ghiaccio (Vedi anche punto 2.6).
  2. Aggiungere 30 mL di buffer di associazione ghiacciata (imidazolo 20mm in PBS 1X) per il pellet cellulare batterica e risospendere pipettando su e giù. Trasferire batteri sedimento in una provetta con etichetta 50 mL.
  3. Supplemento l'associazione 30 mL Tampone con lisozima di 200 µ g/mL, 20 µ g/mL dnasi I, 1 mM MgCl2 e 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) ed incubare prima per 10 min a RT e poi per 1 h a 4 ° C in un agitatore di over-fine.
  4. Meccanicamente lisare cellule batteriche in un tubo da 50 mL inserendo un sonicatore punta nella sospensione. Applicare impulsi costante 3 x 1 min con periodi di raffreddamento 1 min-tra.
  5. Centrifugare il batterico lisato a 15.000 x g a 4 ° C per 45 min a pellet i detriti e cellule intatte. Trasferire i lisati mediante lysate delle cellule batteriche o in una bottiglia di centrifugazione appropriato per centrifugazione o dividere il lisato in diverse provette 5 mL per centrifugazione da tavolo.
  6. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 mL e scartare i detriti pellettato.
  7. Memorizzare lo sgomberati lisato su ghiaccio mentre si prepara la purificazione dalla cromatografia di affinità immobilizzata di metallo (IMAC). Per isolare nanobodies funzionalizzati istidina-etichettate, impiegano monouso sue colonne (Vedi Tabella materiali) che permette la purificazione di gravitá veloce e semplice.
    Nota: In alternativa, purificazione di batch anziché colonne commerciale può essere anche utilizzato.
  8. Montaggio sue colonne a un supporto in metallo.
    1. Affievolirsi soluzione di archiviazione delle colonne ed equilibrare la sua colonna con 10 mL di buffer di associazione (imidazolo 20mm in PBS 1X).
    2. Vuoto di flusso di gravità (il flusso continuo può essere scartato).
  9. Caricare gradualmente lo sgomberati batterica lisato (~ 30 mL) nella colonna. Vuoto di flusso di gravità (il flusso continuo può essere scartato).
  10. Lavare la sua colonna 2 x 10 ml di buffer di associazione (imidazolo 20mm in PBS 1X).
  11. Eluire il nanobodies con 2 mL di tampone di eluizione (imidazolo 500 mM in 1X PBS) in una provetta da 2 mL e applicare un cambio di buffer.
  12. Cambio di buffer.
    1. Equilibrare un desalificazione colonna (Vedi Tabella materiali) disposta in un adattatore della colonna tubo 50 mL 5 volte con 5 mL di PBS 1X.
    2. Permettere al tampone di entrare nella base imballata. Scartare il flusso continuo.
    3. Dopo il quinto equilibrazione di PBS, girare la colonna a 1.000 x g per 2 min.
    4. Scartare il flusso continuo.
    5. Sistemare la colonna con l'adattatore su un nuovo tubo da 50 mL. Caricare i 2 mL di eluiti nanobody funzionalizzati (dal punto 3.11) nella colonna di dissalazione PBS equilibrati e spin a 1.000 x g per 2 min e raccogliere l'eluato.
      Nota: Invece di colonne di dissalazione commerciali, dialisi possono essere applicato per lo scambio di composizione di buffer.
  13. Determinare la concentrazione di proteina (nanobody) dell'eluato utilizzando il bicinconinico (BCA) o analisi di Bradford secondo le istruzioni del produttore.
    Nota: Per le analisi di assorbimento nanobody di linee cellulari GFP reporter, una concentrazione stock di 2-10 mg/mL è ottima.

4. convalida dell'espressione Nanobody funzionalizzati (colorazione di Coomassie)

  1. Preparare 10-12,5% gel per elettroforesi del gel sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) secondo protocolli standard.
    Nota: In alternativa, utilizzare gel gradiente prefabbricati disponibili in commercio.
  2. Pipettare 20 µ g di nanobody purificato funzionalizzati in una provetta da 1,5 mL e far bollire nel buffer del campione a 95 ° C per 5 min.
    Nota: Ad esempio, aggiungere 10 µ l di una soluzione di riserva nanobody di 2 mg/mL in una provetta da 1,5 mL con 10 µ l di tampone di campione x 2. Se il volume è troppo piccolo, diluire ulteriormente nanobody in PBS prima di aggiungere il tampone del campione.
  3. Caricare il nanobody purificata bollito nel buffer del campione su un gel di SDS-poliacrilammide ed eseguire secondo il protocollo standard di pagina fino a quando la tintura di riferimento (ad esempio, il blu di bromofenolo) ha raggiunto la fine del gel di separazione, seguita dalla macchiatura Coomassie e decolorante.
  4. Coomassie Gel di colorazione e decolorazione.
    1. Uncast il gel e macchia con la soluzione colorante Coomassie (5% di un soluzione di riserva di Coomassie in 10% acido acetico e il 45% di metanolo in ddH2O 10 g/L) per 20-30 min a RT su una piattaforma d'agitazione commovente. Il gel deve essere completamente coperta nella soluzione colorante.
    2. Decolorare il gel 2 - 3 volte con decolorare soluzione (7,5% di acido acetico e 15% metanolo in ddH2O) per 1 h ogni a RT, prima di lasciare il gel O/N per ulteriori decolorante.
      Nota: Eccesso Coomassie può essere efficientemente assorbito mettendo asciugamani di carta cucina intorno il gel.
  5. Immagine il gel con un imager o macchina fotografica di scelta.
    Nota: Nanobody espressione può essere ulteriormente convalidato dall'analisi del immunoblot usando gli anticorpi suoi epitopi di targeting (Vedi anche Figura 1A).

5. l'assorbimento di Nanobodies funzionalizzati dalle cellule coltivate per la macchiatura di fluorescenza

  1. In una cappa di cultura cellulare, cellule HeLa seme ~ 400.000 a 500.000 che esprimono stabilmente una proteina reporter GFP-etichettato su lamelle di vetro di 18 mm (No. 1,5 H) in 35 mm piatti o in gruppi di 6-pozzetti con completo supporto contenente antibiotici (medium di Eagle per volta di Dulbecco, DMEM completati con 10% siero fetale di vitello (FCS), 100 unità/mL di streptomicina, 2 mM l-glutammina e con puromicina 1,5 µ g/mL).
    Nota: Qui, usiamo le cellule HeLa che esprimono EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP a scopo illustrativo. A parte le linee cellulari stabili, possono essere utilizzate anche transitoriamente transfected le cellule HeLa. Linee cellulari stabilizzate possono essere co-coltivate in questa fase con parentale non trasdotte le cellule HeLa, per confronto diretto.
  2. Incubare le cellule O/N a 37 ° C in un incubatore di 7,5% CO2 a proliferare.
    Nota: Le cellule dovrebbero avere una confluenza di ~ 80% il giorno successivo.
  3. Pipettare 2 µ l di una soluzione di riserva nanobody 2 mg/mL in una provetta da 15 o 50 mL contenente 2 mL di terreno completo (questo volume è sufficiente a coprire un piatto di 35 mm o un pozzetto di un cluster di 6 pozzetti, regolare il volume del mezzo e nanobody proporzionalmente per includere più cella cultura d pesci o cluster).
    Nota: A scopo illustrativo, usiamo qui VHH-mCherry, poiché nessun ulteriore macchiatura dell'anticorpo è necessaria per vedere nanobody interiorizzato dai reporter EGFP (Vedi Figura 2).
  4. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule e aggiungere 2 mL di preriscaldati mezzo completo contenente 2 µ g/mL funzionalizzati nanobody piatto 35 mm o 6 pozzetti unità.
  5. Incubare le cellule per 1 h a 37 ° C in un incubatore di 7,5% CO2 per consentire l'assorbimento nanobody reporter-mediata.
    Nota: A seconda dell'esperimento pianificato, il tempo dell'assorbimento nanobody deve essere regolato. Per l'esperimento mostrato qui, 1h è sufficiente raggiungere stazionario dell'assorbimento nanobody di EGFP-CDMPR e TfR-EGFP.
  6. Rimuovere il supporto e lavare le cellule 2 - 3 volte con 1 mL di 1X PBS a TA.
  7. Fissare le cellule con 1 mL di 3% paraformaldeide (PFA) per 10 minuti a TA.
  8. Rimuovere la soluzione PFA e dissetare rimanente fissativo con 1 mL di 50mm NH4Cl in 1X PBS per 5 minuti a TA.
    Nota: 3% PFA deve essere smaltito separatamente come fissativo rifiuti.
  9. Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di 1X PBS a TA.
  10. Permeabilize le cellule con 1 mL di 0.1% Triton X-100 in 1X PBS per 10 minuti a TA.
    Nota: Anche se nessun permeabilizzazione è richiesto, fluorescenza EGFP e mCherry è meglio quando in seguito le cellule sono incorporate in mezzo di montaggio.
  11. Lavare le cellule 3 volte con 1 mL di 1X PBS a TA.
  12. Posizionare i coprioggetti con forcipe su una goccia (~ 100 µ l) di BSA 1% in 1X PBS contenente 5 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) per 5 minuti a TA.
  13. Posizionare i vetrini coprioggetti indietro nel piatto/pozzetto e lavare 3 volte con 1 mL di PBS 1X a TA.
  14. Etichettare i vetrini e montare le cellule con Fluoromount-G. Lasciate che il mezzo di montaggio indurire al buio per 3-4 h e conservare i vetrini a 4 ° C sotto protezione dalla luce.
  15. Pattern di colorazione utilizzando un microscopio di scelta (ad es., punto scansione confocale microscopio verticale) dell'immagine.

6. l'assorbimento di Nanobodies funzionalizzati dalle cellule coltivate (per analisi di solfatazione)

  1. In una cappa di cultura cellulare, seme ~ 400.000 a 500.000 cellule HeLa che esprimono una proteina reporter GFP-etichettato in piastre da 35 mm o sui cluster 6-pozzetti con completi medi contenenti antibiotici (medium di Eagle per volta di Dulbecco, DMEM, completati con 10% fetale di vitello siero (FCS), 100 unità/mL di streptomicina, 2 mM l-glutammina e con puromicina 1,5 µ g/mL).
    Nota: Come accennato in precedenza, usiamo qui le cellule HeLa che esprimono EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP a scopo illustrativo. A parte le linee cellulari stabili, può essere utilizzato anche transitoriamente transfected HeLa.
  2. Incubare le cellule O/N a 37 ° C in un incubatore di 7,5% CO2 a proliferare.
    Nota: Le cellule dovrebbero avere una confluenza di ~ 80% giorno successivo.
  3. Rimuovere la sostanza completa, lavare 2 volte con 1x PBS a RT e morire di fame le cellule con il mezzo di solfati (SFM) per 1 h a 37 ° C in un incubatore di 7,5% CO2 .
    Nota: SFM è preparato aggiungendo 10 mL di soluzione di MEM aminoacidi (50x), 5 mL di L-Glutammina (200 mM), 5 mL di soluzione di vitamine (100x) e 900 µ l di CaCl2·2H2O a 500 mL di sali bilanciati dell'Aquila. Passare attraverso un 0,22 µm filtro e aliquota.
  4. In un cappuccio ventilato o panca designata per il lavoro di radioattività, preparare solfato etichettatura mezzo contenente solfato di mCi/mL [35S] 0,5 come sale di sodio in SFM.
    Attenzione: Maneggiare con cura tutte le soluzioni contenenti radioattività. Funzionano solo in area cappe o panche. Tutti i materiali (suggerimenti, tubi, piastre, ecc.) o buffer di lavaggio a contatto con la radioattività devono essere raccolti e smaltiti separatamente. Fare questo per tutti i passaggi di seguito (passaggio 6.5-6.20) pure.
  5. Aggiungere VHH-2xTS in 1X PBS in solfato etichettatura medio ad una concentrazione finale di 2 µ g/mL.
    Nota: Come controllo, includono anche VHH-std o un altro nanobody privo di siti TS per dimostrare etichettatura specifica.
  6. Sostituire SFM da 0,7 mL di solfato di etichettatura contenente 0,5 mCi/mL [35S] medio solfato e 2 µ g/mL VHH-2xTS e incubare le cellule per 1 h a 37 ° C in un incubatore di2 CO 7,5% indicato per il lavoro con la radioattività.
    Nota: A seconda dell'esperimento pianificato, il tempo di solfatazione nanobody deve essere regolato. Inoltre, per determinare la cinetica di arrivo TGN, etichettatura viene eseguito per diverse volte (ad esempio, per 10 min, 20 min, 30 min, ecc.).
  7. Togliere la soluzione di etichettatura e lavare le cellule 2 - 3 volte con PBS 1X ghiacciata su una piastra di raffreddamento o di ghiaccio.
  8. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi (PBS contenente 1% Triton X-100 e 0,5% desossicolato) completati con 2 mM PMSF e 1 x cocktail di inibitore della proteasi e incubare le cellule per 10-15 min su una piattaforma a dondolo a 4 ° C.
  9. Raschiare e trasferire il lisato in una provetta da 1,5 mL, vortice lisato e posto per 10-15 min in un rotatore di fine oltre a 4 ° C.
  10. Preparare un postnuclear lisato mediante centrifugazione a 10.000 x g per 10 min a 4 ° C.
  11. Utilizzando una nuova provetta da 1,5 mL, preparare 20-30 µ l di un impasto di perle di nichel in una provetta da 1,5 mL e lavare una volta con PBS 1X di cubettatura delicatamente li a 1.000 x g per 1 min.
    Nota: Invece di nichel perline, perline di streptavidina (se nanobody è biotinilato) o A proteine con un IgG contro un epitopo di nanobody (T7 - o HA-tag) può essere utilizzato.
  12. Trasferire la postnuclear lisato in una provetta da 1,5 mL contenente nichel perline e incubare per 1 h a 4 ° C in un rotatore di estremità sopra per isolare il nanobodies. Rimuovere un'aliquota (50-100 µ l) della postnuclear lisata e bollire nel buffer del campione SDS per l'analisi di immunoblot successive di totale associato nanobody, GFP reporter e controllo di carico.
  13. Lavare le perle 3 volte con PBS o lisi 1x di cubettatura delicatamente a 1.000 x g per 1 min.
    Nota: Per il lavaggio più rigorosa delle perline, imidazolo 20 mM possa essere inclusi in tampone PBS o lisi.
  14. Rimuovere tutti i buffer di lavaggio dalle perle con cura, aggiungere 50 µ l di tampone del campione: 2x e bollire per 5 min a 95 ° C.
  15. Carico sia bollite perline su un midi 12,5% gel di SDS-PAGE ed eseguito secondo il protocollo standard di pagina fino a quando la tintura di riferimento (ad esempio, il blu di bromofenolo) ha raggiunto la fine del gel di separazione.
    Nota: L'analisi di immunoblot di totale associato nanobody, GFP reporter e controllo di carico può essere eseguita anche utilizzando un mini 12,5% SDS-PAGE o gel di pendenza prefabbricati.
  16. Difficoltà il gel di separazione in ~ 30 mL di tampone di fissazione (10% acido acetico e 45% metanolo in ddH2O) per 1 h a RT, lavare il gel tre volte con ~ 50 mL di acqua deionizzata e preparare per l'essiccazione del gel.
  17. Asciugatura gel SDS-PAGE.
    1. Posizionare il gel fisso su pellicola trasparente allungato e coprirla con carta da filtro pretagliato.
    2. Posizionare il gel con la carta da filtro verso il basso in cima alla piattaforma di essiccazione, posizionare il coperchio aspiratore e accendere la pompa del vuoto per l'essiccazione del gel. Asciugare il gel per 3-5 h.
    3. Rimuovere la pellicola trasparente e mettere il gel essiccato in una cassetta di autoradiografia dotata di schermo al fosforo.
  18. Autoradiograph di immagine utilizzando un Imager di schermo al fosforo. Seguire le istruzioni del produttore.
    Nota: A seconda della forza del segnale, secchi gel c'è bisogno di essere esposto più a lungo con schermi di fosforo.

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Risultati

Per studiare il trasporto retrogrado proteina per varie destinazioni intracellulare, recentemente abbiamo stabilito uno strumento anti-GFP nanobody per etichettare e seguire le proteine di fusione ricombinante dalla superficie cellulare30. Qui, dimostriamo la produzione batterica di tali derivatizzati nanobodies e dimostrare la loro applicazione per studiare l'assorbimento endocitosi di microscopia di fluorescenza e immunoblotting, nonché il loro uso di investigar...

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Discussione

Nanobodies rappresentano una classe emergente di proteina legante ponteggi con molti vantaggi rispetto ai convenzionali anticorpi: sono piccole, stabile, monomerico, possono essere selezionati per legami disolfuro ad alta affinità e mancanza33,35, 44 , 45. sono utilizzati in numerose applicazioni, come nei sistemi di coltura delle cellule e negli organismi in biologia dello sviluppo

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da Grant 31003A-162643 di Swiss National Science Foundation. Ringraziamo Nicole Beuret e Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) per il supporto.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GFP antibodySigma-Aldrich118144600001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Anti-His6 antibodyBethyl LaboratoriesA190-114A
Anti-actin antibodyEMD MilliporeMAB1501
Goat anti-rabbit HRPSigma-AldrichA-0545
Goat anti-mouse HRPSigma-AldrichA-0168
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542dissolved in 1x PBS/1%BSA
Dimethyl sulfoxide (DMSO)ApplichemA3672
D-biotinSigma-AldrichB4501dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochlorideSigma-AldrichA3785dissolved in sterile water
DNase IApplichemA3778dissolved in sterile water
LysozymeSigma-Aldrich18037059001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Brefeldin A (BFA)Sigma-AldrichB5936
PuromycinInvivogenant-pr-1
Penicillin/StreptomycinBioconcept4-01F00-H
L-glutamineApplichemA3704
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-AldrichD5796
Fetal calf serum (FCS)BiowestS181B-500
Sulfur-35 as sodium sulfateHartmann AnalyticsARS0105Product contains 5 mCi
Earle's balanced saltsSigma-AldrichE6267
MEM amino acids (50x) solutionSigma-AldrichM5550
MEM vitamin solution (100x)Sigma-AldrichM6895
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836153001Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)ApplichemA1008dissolved in sterile water, stock is 1 M
Carbenicillin disodium saltApplichemA1491dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Kanamycin sulfateApplichemA1493dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL
Coomassie-R (Brilliant Blue)Sigma-AldrichB-0149
Paraformaldehyde (PFA)ApplichemA3813
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Ni Sepharose High PerformanceGE Healthcare17-5268-01
His GraviTrap columnsGE HealthcareGE11-0033-99
His buffer kitGE HealthcareGE11-0034-00
Disposable PD10 desalting columnsGE HealthcareGE17-0851-01
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-wellBio-Rad456-1096
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
35 mm dishesFalcon353001
6-well platesTPP92406
Glass coverslips (No. 1.5H)VWR631-0153
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)ApplichemA0999.0025dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM
TryptoneApplichemA1553
Yeast extractApplichemA1552
Magnesium chloride hexahydrateMerck Millipore105833dissolved in sterile water, stock is 1 M
Calcium chloride dihydrateMerck Millipore102382dissolved in sterile water, stock is 1 M
Sodium chlorideMerck Millipore106404dissolved in sterile water, stock is 5 M

Riferimenti

  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. Journal of Cell Biology. 106 (3), 617-628 (1988).
  4. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 4 (3), 202-212 (2003).
  5. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  6. Pallesen, L. T., Vaegter, C. B. Sortilin and SorLA regulate neuronal sorting of trophic and dementia-linked proteins. Molecular Neurobiology. 45 (2), 379-387 (2012).
  7. Gustafsen, C., et al. Sortilin and SorLA display distinct roles in processing and trafficking of amyloid precursor protein. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (1), 64-71 (2013).
  8. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Developmental Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  9. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nature Cell Biology. 13 (8), 914-923 (2011).
  10. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nature Cell Biology. 10 (2), 178-185 (2008).
  11. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nature Communications. 9 (1), 3737(2018).
  12. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochimica et Biophysica Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  13. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. Journal of Cell Science. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  14. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. The Journal of Cell Biology. 125 (2), 253-268 (1994).
  15. Mallard, F., et al. Early/recycling endosomes-to-TGN transport involves two SNARE complexes and a Rab6 isoform. The Journal of Cell Biology. 156 (4), 653-664 (2002).
  16. Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Molecular Biology of the Cell. 11 (1), 23-38 (2000).
  17. Hirst, J., et al. Distinct and overlapping roles for AP-1 and GGAs revealed by the "knocksideways" system. Current biology. 22 (18), 1711-1716 (2012).
  18. Burgos, P. V., et al. Sorting of the Alzheimer's disease amyloid precursor protein mediated by the AP-4 complex. Developmental Cell. 18 (3), 425-436 (2010).
  19. Choy, R. W., Cheng, Z., Schekman, R. Amyloid precursor protein (APP) traffics from the cell surface via endosomes for amyloid beta (Abeta) production in the trans-Golgi network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 109 (30), E2077-E2082 (2012).
  20. Seifert, W., et al. The progressive ankylosis protein ANK facilitates clathrin- and adaptor-mediated membrane traffic at the trans-Golgi network-to-endosome interface. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3836-3848 (2016).
  21. Tabuchi, M., Yanatori, I., Kawai, Y., Kishi, F. Retromer-mediated direct sorting is required for proper endosomal recycling of the mammalian iron transporter DMT1. Journal of Cell Science. 123 (Pt 5), 756-766 (2010).
  22. La Fontaine, S., Mercer, J. F. Trafficking of the copper-ATPases, ATP7A and ATP7B: role in copper homeostasis. Archives of Biochemistry and Biophysics. 463 (2), 149-167 (2007).
  23. Burd, C. G. Physiology and pathology of endosome-to-Golgi retrograde sorting. Traffic. 12 (8), 948-955 (2011).
  24. Chia, P. Z., Gasnereau, I., Lieu, Z. Z., Gleeson, P. A. Rab9-dependent retrograde transport and endosomal sorting of the endopeptidase furin. Journal of Cell Science. 124 (Pt 14), 2401-2413 (2011).
  25. Wahle, T., et al. GGA proteins regulate retrograde transport of BACE1 from endosomes to the trans-Golgi network. Molecular and Cellular Neurosciences. 29 (3), 453-461 (2005).
  26. Johannes, L., Goud, B. Surfing on a retrograde wave: how does Shiga toxin reach the endoplasmic reticulum. Trends in Cell Biology. 8 (4), 158-162 (1998).
  27. van Deurs, B., Tonnessen, T. I., Petersen, O. W., Sandvig, K., Olsnes, S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. Journal of Cell Biology. 102 (1), 37-47 (1986).
  28. Sandvig, K., van Deurs, B. Membrane traffic exploited by protein toxins. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 18, 1-24 (2002).
  29. Sandvig, K., et al. Retrograde transport of endocytosed Shiga toxin to the endoplasmic reticulum. Nature. 358 (6386), 510-512 (1992).
  30. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  31. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  32. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  33. Bieli, D., et al. Development and Application of Functionalized Protein Binders in Multicellular Organisms. International Review of Cell and Molecular Biology. 325, 181-213 (2016).
  34. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  35. Helma, J., Cardoso, M. C., Muyldermans, S., Leonhardt, H. Nanobodies and recombinant binders in cell biology. Journal of Cell Biology. 209 (5), 633-644 (2015).
  36. Harmansa, S., Affolter, M. Protein binders and their applications in developmental biology. Development. 145 (2), (2018).
  37. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  38. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annual Review of Physiology. 50, 363-376 (1988).
  39. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. The Journal of Cell Biology. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  40. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotechnology. 25 (5), 299-317 (2009).
  41. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. The Journal of Biological Chemistry. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  42. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. Journal of Cell Biology. 100 (3), 826-834 (1985).
  43. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  44. Kaiser, P. D., Maier, J., Traenkle, B., Emele, F., Rothbauer, U. Recent progress in generating intracellular functional antibody fragments to target and trace cellular components in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (11), 1933-1942 (2014).
  45. Dmitriev, O. Y., Lutsenko, S., Muyldermans, S. Nanobodies as Probes for Protein Dynamics in Vitro and in Cells. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3767-3775 (2016).
  46. Harmansa, S., Hamaratoglu, F., Affolter, M., Caussinus, E. Dpp spreading is required for medial but not for lateral wing disc growth. Nature. 527 (7578), 317-322 (2015).
  47. Harmansa, S., Alborelli, I., Bieli, D., Caussinus, E., Affolter, M. A nanobody-based toolset to investigate the role of protein localization and dispersal in Drosophila. eLife. 6, (2017).
  48. Caussinus, E., Kanca, O., Affolter, M. Fluorescent fusion protein knockout mediated by anti-GFP nanobody. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (1), 117-121 (2012).
  49. Rothbauer, U., et al. Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies. Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).
  50. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).
  51. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 567-572 (2011).
  52. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  53. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, (2018).
  54. De Genst, E., et al. Molecular basis for the preferential cleft recognition by dromedary heavy-chain antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 103 (12), 4586-4591 (2006).
  55. Truttmann, M. C., et al. HypE-specific nanobodies as tools to modulate HypE-mediated target AMPylation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (14), 9087-9100 (2015).
  56. Ashour, J., et al. Intracellular expression of camelid single-domain antibodies specific for influenza virus nucleoprotein uncovers distinct features of its nuclear localization. Journal of Virology. 89 (5), 2792-2800 (2015).
  57. Yamagata, M., Sanes, J. R. Reporter-nanobody fusions (RANbodies) as versatile, small, sensitive immunohistochemical reagents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States. 115 (9), 2126-2131 (2018).
  58. Pleiner, T., Bates, M., Gorlich, D. A toolbox of anti-mouse and anti-rabbit IgG secondary nanobodies. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1143-1154 (2018).
  59. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nature Methods. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  60. Robinson, M. S., Sahlender, D. A., Foster, S. D. Rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. Developmental Cell. 18 (2), 324-331 (2010).
  61. Meyer, C., et al. mu1A-adaptin-deficient mice: lethality, loss of AP-1 binding and rerouting of mannose 6-phosphate receptors. The EMBO Journal. 19 (10), 2193-2203 (2000).
  62. Utskarpen, A., Slagsvold, H. H., Iversen, T. G., Walchli, S., Sandvig, K. Transport of ricin from endosomes to the Golgi apparatus is regulated by Rab6A and Rab6A. Traffic. 7 (6), 663-672 (2006).
  63. Mallard, F., Johannes, L. Shiga toxin B-subunit as a tool to study retrograde transport. Methods in Molecular Medicine. 73, 209-220 (2003).
  64. Mallard, F., et al. Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgi apparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of Cell Biology. 143 (4), 973-990 (1998).
  65. Plaut, R. D., Carbonetti, N. H. Retrograde transport of pertussis toxin in the mammalian cell. Cellular Microbiology. 10 (5), 1130-1139 (2008).
  66. Johannes, L., Tenza, D., Antony, C., Goud, B. Retrograde transport of KDEL-bearing B-fragment of Shiga toxin. The Journal of Biological Chemistry. 272 (31), 19554-19561 (1997).
  67. Saint-Pol, A., et al. Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes. Developmental Cell. 6 (4), 525-538 (2004).
  68. Amessou, M., Popoff, V., Yelamos, B., Saint-Pol, A., Johannes, L. Measuring retrograde transport to the trans-Golgi network. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 15 Unit 15 10 (2006).
  69. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  70. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Reports. 21 (11), 3256-3270 (2017).
  71. Dick, G., Grondahl, F., Prydz, K. Overexpression of the 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate (PAPS) transporter 1 increases sulfation of chondroitin sulfate in the apical pathway of MDCK II cells. Glycobiology. 18 (1), 53-65 (2008).
  72. Fruholz, S., Fassler, F., Kolukisaoglu, U., Pimpl, P. Nanobody-triggered lockdown of VSRs reveals ligand reloading in the Golgi. Nature Communications. 9 (1), 643(2018).

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