Distribuzione dell'acqua Xylem nelle piante legnose con un microscopio elettronico a scansione crio-scansione

Riepilogo

Osservare la distribuzione dell'acqua all'interno dello xilema fornisce informazioni significative per quanto riguarda la dinamica del flusso d'acqua nelle piante legnose. In questo studio, dimostriamo l'approccio pratico per osservare la distribuzione dell'acqua xylem in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM, che elimina i cambiamenti artifactuali nello stato dell'acqua durante la preparazione del campione.

Abstract

Un microscopio elettronico a scansione installato crio-unità (crio-SEM) consente l'osservazione dei campioni a temperature sotto zero ed è stato utilizzato per esplorare la distribuzione dell'acqua nei tessuti delle piante in combinazione con tecniche di fissazione del congelamento utilizzando azoto liquido (LN ₂). Per le specie legnose, tuttavia, i preparativi per l'osservazione della superficie trasversale dello xilema comportano alcune difficoltà dovute all'orientamento delle fibre di legno. Inoltre, una maggiore tensione nella colonna d'acqua nei condotti xylem può occasionalmente causare cambiamenti artifactuali nella distribuzione dell'acqua, soprattutto durante la fissazione e la raccolta dei campioni. In questo studio, dimostriamo una procedura efficace per osservare la distribuzione dell'acqua all'interno dello xylem delle piante legnose in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM. In un primo momento, durante la raccolta del campione, misurare il potenziale dell'acqua xylem dovrebbe determinare se è presente un'alta tensione nei condotti xylem. Quando il potenziale dell'acqua xylem è basso (< ca. 0,5 MPa), è necessaria una procedura di rilassamento della tensione per facilitare una migliore conservazione dello stato dell'acqua nei condotti xylem durante la fissazione del congelamento del campione. Successivamente, un collare a tenuta stagna è attaccato intorno al gambo dell'albero e riempito con LN₂ per la fissazione del congelamento dello stato dell'acqua di xylem. Dopo la raccolta, occorre fare attenzione a garantire che il campione sia conservato mentre si completano le procedure di preparazione del campione per l'osservazione. Un criostato viene impiegato per esporre chiaramente la superficie xylem taglio trasversale. Nelle osservazioni crio-SEM, è necessaria la regolazione del tempo per il congelamento per rimuovere la polvere di gelo e accentuare il bordo delle pareti cellulari sulla superficie di visualizzazione. I nostri risultati dimostrano l'applicabilità delle tecniche crio-SEM per l'osservazione della distribuzione dell'acqua all'interno di xylem a livello cellulare e subcellulare. La combinazione di crio-SEM con tecniche di osservazione in situ non distruttive migliorerà profondamente l'esplorazione delle dinamiche del flusso idrico delle piante legnose.

Introduzione

La disponibilità di risorse idriche (ad esempio, precipitazioni, contenuto di acqua del suolo) determina rigorosamente la mortalità e la distribuzione geografica delle specie vegetali, poiché devono assorbire l'acqua dal suolo e trasportarla alle foglie per la produzione fotosintetica. Gli impianti devono mantenere il loro sistema di trasporto idrico sotto l'approvvigionamento idrico fluttuante. In particolare, le piante legnose generano alte tensioni nei loro condotti lungo i corsi d'acqua di traspirazione in quanto, in alcuni casi, hanno bisogno di tenere la corona a più di 100 m da terra. Per mantenere le colonne d'acqua sotto una pressione negativa così elevata, i condotti xylem consistono in un continuum di cellule tubolari con pareti cellulari rigide e lofobiche-lignifiche¹. La vulnerabilità alla disfunzione xylem dei condotti xylem in ogni specie è un buon determinante della sopravvivenza delle specie sotto l'approvvigionamento idrico fluttuante². Inoltre, lo studio dello stato dell'acqua dei condotti xylem è importante per la valutazione delle condizioni di salute dei singoli alberi sottoposti a stress abiotico o biotico. La misurazione del flusso di linfa o del potenziale idrico può fornire stime dello stato dell'acqua di un impianto legnoso a causa della funzione idraulica integrata dei condotti xylem. Inoltre, la visualizzazione della distribuzione dell'acqua nelle cellule xiliere può chiarire la condizione dei singoli componenti del sistema idraulico xylem.

Diverse tecniche per visualizzare lo stato dell'acqua dei condotti xylem esistono³. I metodi classici e utili per osservare le vie dell'acqua nel tessuto legnoso comportano la colorazione della colonna d'acqua immergendo le estremità dei rami tagliati in un colorante o iniettando un colorante nei gambi degli alberi in piedi⁴. La fotografia a raggi X morbida consente anche la visualizzazione della distribuzione dell'acqua dei dischi di legno a fette a causa dell'intensità differenziale di assorbimento dei raggi X dell'umidità nello xilarem^5,6. Questi metodi, tuttavia, forniscono solo tracce di movimento dell'acqua o dimostrano distribuzioni macroscopiche di acqua. Recentemente, tecniche di osservazione non distruttiva, come la tomografia computerizzata a raggi X micro-fuoco (CT)^7,8,9,10e la risonanza magnetica (RM)^{11, 12}, sono stati notevolmente migliorati per consentire l'osservazione dell'acqua nei condotti xylem all'interno di alberelli intatti. Questi metodi non distruttivi hanno grandi vantaggi in quanto possiamo osservare lo stato dell'acqua dello xylem senza effetti di taglio artificiale, e possiamo monitorare le dinamiche del flusso d'acqua mediante imaging sequenziale o introducendo un agente di contrasto¹⁰. Tuttavia, dobbiamo utilizzare una risonanza magnetica personalizzata per l'imaging delle piante o un impianto specializzato per la TC a base di sincrotrone al fine di ottenere le immagini in grado di identificare il contenuto di acqua a livello cellulare. Inoltre, anche se il sistema CT basato sul sincrotrone ha permesso di ottenere immagini pregiate ad alta risoluzione spaziale, che è paragonabile alla microscopia leggera^7,8,9, le cellule viventi possono essere ferite radiazione di raggi X ad alta energia^13,14. L'impiego di un microscopio elettronico a scansione in cui sono installate crio-unità (crio-SEM) è un metodo molto utile per localizzare con precisione l'acqua nello xilem a livello cellulare, anche se questo richiede la raccolta distruttiva del campione per l'osservazione. Per fissare l'acqua nei condotti xylem, una parte dei gambi (ad esempio, ramoscelli, rami o steli) viene congelata in situ con azoto liquido (LN₂). Le osservazioni della superficie degli esemplari rifilati e congelati da crio-SEM forniscono immagini altamente ingrandite della struttura xylem da cui possiamo identificare l'acqua nei condotti xylem come ghiaccio. Una limitazione significativa di questo metodo è che l'osservazione sequenziale della movabilità dell'acqua all'interno dello stesso campione è impossibile. Tuttavia, l'applicazione di CT o RM per l'osservazione sequenziale di alberi che vivono in un campo è estremamente impegnativa perché questi strumenti non sono portatili. Al contrario, il crio-SEM ha il potenziale per utilizzare questa tecnica su grandi alberi negli esperimenti sul campo per visualizzare chiaramente il contenuto dell'acqua non solo a livello cellulare, ma anche a un livello di struttura più fine, ad esempio acqua nei pozzi intervascolari¹⁵, acqua in spazi intercellulari¹⁶, o bolle nella colonna d'acqua¹⁷.

Molti studi che osservano l'acqua xilem da crio-SEM sono stati segnalati ^5,12,^{18,19,20,21,23}. Utsumi et al. (1996) inizialmente stabilì il protocollo per l'osservazione dello xylem in situ con gelata di un tronco vivente tramite il riempimento di LN₂ in un contenitore impostato sul gambo²¹. La temperatura del campione è stata mantenuta al di sotto dei -20 gradi centigradi durante la raccolta del campione e durante la preparazione crio-SEM al fine di evitare lo scioglimento del ghiaccio all'interno dei condotti xylem. Questo metodo è stato utilizzato per osservare l'acqua nello xilem al fine di chiarire la distribuzione dell'acqua in condizionando il regime idrico^{11,12,24,25,26, 27,28}, la variazione stagionale della distribuzione dell'acqua^21,29,30, l'effetto dei cicli di congelamento-scongelamento^{17,31, 32}, la distribuzione dell'acqua nel legno bagnato⁵, cambiamenti nella distribuzione dell'acqua durante il passaggio da sapwood a heartwood²⁰, corso di tempo stagionale di attività cambiale e differenziazione dei vasi³³, e cavitazione indotta da alcuni stress biotici^23,34. Anche la conduttività idraulica e la vulnerabilità dei condotti alla cavitazione sono stati verificati utilizzando crio-SEM^35,36. Cryo-SEM dotato di spettrometria a raggi X di dispersione energetica (EDX o EDS) è stato utilizzato per studiare la distribuzione degli elementi sulla superficie di un campione contenente acqua³⁷.

Fissazione del congelamento di un tronco vivente che contiene condotti sotto alta tensione idraulica a volte provoca cavitazioni artificiali che vengono osservate dal crio-SEM come cristalli di ghiaccio fratturati nel lume dei condotti^38,39. In particolare, le specie a foglia larga con condotti più lunghi e larghi sono vulnerabili a manufatti indotti dalla tensione, come la cavitazione causata dal taglio del campione, anche se condotta sott'acqua^3,40. I manufatti di cavitazione diventano evidenti dopo il campionamento di un albero traspirante (cioè il campionamento durante il giorno) o in condizioni di siccità gravi e possono indurre in errore a soprastare l'occorrenza della cavitazione^{3,38, 39}. Pertanto, la tensione di lavoro nei condotti deve essere liberata per evitare la cavitazione artifactualiva^3,12,39.

La tecnica di congelazione con un coltello installato in una camera di campioni è spesso impiegata per esporre la superficie del campione per l'osservazione crio-SEM. Tuttavia, i piani congelato di tessuti vegetali legnosi, in particolare sezioni trasversali di xylem secondari, sono troppo ruvidi per osservare chiaramente le caratteristiche anatomiche e l'acqua nel tessuto⁶. L'applicazione di un criostato per il taglio di un campione consente una preparazione rapida e di alta qualità delle superfici campione^20,23. L'obiettivo generale di questo metodo è fornire prove con la risoluzione della microscopia elettronica della distribuzione dell'acqua in vari tipi di cellule xilime in situ senza la comparsa di artefatti di campionamento. Introduciamo la nostra procedura aggiornata, che è stata costantemente migliorata da quando l'abbiamo adottata per la prima volta, per quanto riguarda il campionamento, il taglio e la pulizia della superficie del campione per ottenere micrografie elettroniche di alta qualità di campioni crio-fissi di xilema.

Protocollo

NOTA: un grafico schematico di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.

1. Campionamento: Rilassamento della tensione all'interno della colonna d'acqua dei condotti Xylem

NOTA: Il seguente trattamento di rilassamento della tensione è raccomandato prima dell'applicazione LN₂ per evitare sia il congelamento che gli artefatti indotti dalla tensione nella distribuzione dell'acqua xylem.

1. Racchiudere un ramo e le foglie per il campionamento con un sacchetto di plastica nera per eclacazione il potenziale idrico tra xylem e foglie più di due ore prima del campionamento.
2. Determinare il potenziale idrico di almeno due foglie dal campione utilizzando una camera di pressione o uno psichiatra. Quando il potenziale idrico è superiore a quello di ca. 0,5 MPa (cioè, non esiste alcuna tensione o molto bassa), un campione può essere raccolto dopo il congelamento (fare riferimento alla sezione 2: Fissareil congelamento). Quando il potenziale idrico è inferiore a 0,5 MPa, è necessario un trattamento per il rilassamento, come descritto di seguito.
3. Fissare un collare a tenuta stagna intorno allo stelo per essere riempito con acqua. Una tazza di plastica senza fondo può servire come un collare a tenuta stagna. Occorre prestare attenzione a sigillare strettamente gli spazi tra lo stelo e il collare utilizzando un nastro adesivo per prevenire la fuoriuscita di supporti liquidi che vengono utilizzati successivamente. Per la raccolta di steli flessibili come rami sottili o ramoscelli, affondare una porzione di taglio in un secchio pieno d'acqua piegando lo stelo. Tagliare sotto la superficie dell'acqua utilizzando cesoie di potatura o una sega. Trasferire il campione in un altro contenitore d'acqua il più rapidamente possibile per ridurre al minimo l'esposizione dell'estremità di taglio all'aria.
4. Mantenere l'estremità di taglio del campione sott'acqua. Per le specie a foglia larga, assicurarsi che la lunghezza dal punto in cui sarà ottenuto un criocampione per seM al bordo tagliato dello stelo raccolto sia più lunga della lunghezza massima del vaso dei campioni al fine di evitare manufatti indotti dalla tensione all'interno del campione crio.
5. Coprire il campione contenente le foglie con un sacchetto di plastica nera per ridurre la traspirazione. Mantenere l'estremità di taglio del campione in acqua e mantenere questa condizione per circa 30 min al fine di rilassare la tensione xylem. Evitare un tempo di relax più lungo (>1 h) a causa di un possibile riempimento artificiale di condotti cavitati¹².
6. Misurare nuovamente il potenziale dell'acqua per confermare il rilassamento della tensione degli xilim (quasi 0 MPa).
   NOTA: Prima del campionamento, la lunghezza massima della nave delle specie bersaglio deve essere studiata o determinata con campioni simili mediante il metodo di iniezione dell'aria. Quando si campiona un albero di grandi dimensioni, o un grande ramo, è difficile condurre le procedure di rilassamento della tensione descritte sopra. Pertanto, i campioni provenienti da grandi alberi devono essere raccolti durante il periodo precedente, quando il potenziale di acqua xylem è più alto.

2. Congelare la fissazione con LN₂

1. Tagliare e aprire un lato di un collare a tenuta stagna con forbici o un coltello di utilità. Fissare saldamente il collare intorno al gambo con un nastro adesivo tenendo l'apertura orizzontalmente.
2. Indossare guanti isolanti / guanto, ma assicurarsi di tenere la bottiglia di LN₂ in modo sicuro, ed eseguire LN₂ nel collare per riempirlo con LN₂. Tenerlo riempito aggiungendo costantemente LN₂ per congelare completamente l'acqua nello xylem. Il tempo necessario per il congelamento dipende dalla dimensione del campione; 1 min dopo l'ebollizione di LN₂ versato si è fermato è sufficiente per un piccolo ramoscello o una piantità, mentre più di 20 min è necessario per uno stelo di un albero più grande²⁰. Aggiungere LN₂ continuamente durante il congelamento mentre evapora rapidamente a causa delle grandi differenze di temperatura tra LN₂ e le temperature ambientali.
3. Staccare il collare dalla parte congelata del gambo del campione per rimuovere LN₂ dopo il tempo di congelamento sufficiente. Assicurarsi di indossare guanti isolanti per evitare il contatto con potenziali fuoriuscite di LN₂ causate dallo scollegamento del collare.
4. Raccogliere immediatamente il campione con una sega a mano fine.
5. Coprire il campione congelato con un pezzo di foglio di alluminio o metterlo in un tubo campione, su cui sono scritti i numeri ID del campione. Mettere rapidamente il campione raccolto in un contenitore riempito con LN₂ o imballare in una scatola isolata riempita di ghiaccio secco.
6. Conservare i campioni in un congelatore profondo fino all'osservazione. La temperatura preferita per lo stoccaggio è di 80 gradi centigradi per prevenire la sublimazione del ghiaccio e la sua cristallizzazione durante la conservazione.

3. Preparazione degli spettri

NOTA: Per l'osservazione, un campione deve essere tagliato e la sua superficie per l'osservazione deve essere pianificata a temperature sotto zero al fine di mantenere la distribuzione dell'acqua nel suo xylem in situ. Un microtoma biologico con sistema criostatista (criostat) è ideale per tagliare ed esporre la superficie di un campione in questo tipo di osservazione da crio-SEM.

1. Impostare la temperatura della camera campione del criostato a 30 gradi centigradi, che di solito è abbastanza fredda da mantenere la linfa xylem della maggior parte delle piante in uno stato congelato.
2. Tagliare un campione in un piccolo pezzo (< ca. 2 cm di altezza e < ca. 1 cm di larghezza o diametro) che può essere regolato per il portacampioni di un crio-SEM. Nel caso di un campione più grande che non può essere tagliato con un coltello, pre-tagliare rapidamente con una sega raffreddata in una scatola congelatore.
3. Attacca il pezzo tagliato a un mandrino, un supporto per un criostato montando su un mezzo di incorporamento di congelamento dei tessuti (ad esempio, composto dello strumento di personalizzazione di Office) per la crio-sezione. Quindi, attaccare il mandrino a un portacampioni di un microtome del criostato.
4. Tagliare la superficie radendosi ripetutamente con 5-7 sezioni di spessore. Tagliare tagliando via più di 1.000-2.000 m, in profondità totale dalla superficie iniziale al momento della raccolta dei campioni, è utile per eliminare la porzione danneggiata del campione causata dal pre-taglio con un coltello o sega come descritto nel passaggio 3.2.
5. Dopo aver tagliato approssimativamente una superficie del campione, regolare una porzione inutilizzata della lama del microtoma sopra la superficie del campione. Non permettere alla lama di toccare il campione che supererebbe l'impostazione dello spessore.
6. Prima del primo taglio da parte della lama inutilizzata, allargare leggermente la distanza tra la superficie del campione e la lama.
7. Tagliare la superficie del campione solo una o due volte. Inoltre, far scorrere nuovamente la lama regolando una porzione di lama inutilizzata sulla superficie del campione.
8. Ripetere i passaggi 3.6 e 3.7 o quattro volte. Questo è importante al fine di ottenere una superficie chiara senza "segni di coltello" (Figura 4).
9. Dopo il taglio finale, impostare la posizione della lama lontano dal campione per evitare che la polvere si attacchi sul campione.
10. Staccare il mandrino dal portacampioni e staccare il provino dal mandrino rimuovendo il mezzo di incorporamento congelato con un coltello affilato. Assicurarsi che il campione sia posto nella camera criostatta per evitare che la sua superficie planata si dica dalla polvere di gelo.
11. Attaccare il campione a un portacampioni crio-SEM con un mezzo di incorporamento per il congelamento dei tessuti nella camera criostat.

4. Trasferimento alla camera degli esemplari di Cryo-SEM

NOTA: L'esemplare preparato in superficie deve essere protetto da un aumento della temperatura o dell'accumulo di gelo durante il trasferimento dalla camera criostata alla fase di osservazione nella camera campione crio-SEM.

1. Mantenere la temperatura dello stadio freddo nella camera del campione crio-SEM a un valore inferiore a –120 gradi centigradi con LN₂ secondo il manuale d'uso dell'apparecchiatura.
2. Collocare il supporto del provino con il campione preparato in un contenitore isolante riempito con LN₂ nella camera criostatta.
3. Tenere il supporto dell'specimen con un'asta di scambio di campioni sotto l'LN₂. Evitare di esporre il supporto del campione all'aria quando possibile.
4. Impostare rapidamente il supporto del provino sulla camera di pre-evacuazione della camera del crio-SEM non appena si inizia l'evacuazione della camera di pre-evacuazione. Quindi, posizionare il supporto del campione sulla fase fredda dopo che l'aria è completamente evacuata. Anche se un po 'di accumulo di gelo è inevitabile, la procedura di "freeze-etching" (passaggio 6) può rimuoverlo.

5. Impostazione in SEM

NOTA: l'impostazione tipica per l'osservazione è descritta di seguito. Alcune modifiche sono necessarie a seconda della condizione di vuoto o del fascio di elettroni.

1. Impostare i parametri SEM per l'osservazione come segue:
   Tensione di accelerazione: 3-5 kV
   Temperatura dello stadio del campione: <
   Rilevatore: Emissione secondaria

6. Congelamento-incisione

NOTA: Il congelamento è la procedura per accentuare il bordo delle pareti cellulari del campione con una leggera sublimazione del cristallo di ghiaccio. Il congelamento dell'incisione comporta anche la rimozione delle polveri di gelo superficiale.

1. Accendere la tensione di accelerazione del cannone elettrico durante il freeze-etching. È meglio condurre il congelamento durante l'osservazione del campione.
2. Alzi la temperatura dello stadio del campione fino a 100 gradi centigradi.
3. Attendere alcuni minuti fino a quando la polvere di gelo viene rimossa e il livello superficiale del ghiaccio nelle cellule xilem è diminuito leggermente rispetto alle pareti cellulari.
4. Abbassare la temperatura dello stadio del campione a 120 gradi centigradi.
   NOTA: Se non è installato alcun regolatore di temperatura installato per la fase del campione, tenere il campione utilizzando l'asta di scambio e staccarlo dalla fase del provino per alcuni minuti. Osservare il campione più volte durante questo processo di congelamento per verificare lo stato di sublimazione del campione.

7. Rivestimento metallico (opzionale)

NOTA: i recenti miglioramenti apportati allo strumento SEM e all'elaborazione delle immagini possono fornire immagini di alta qualità di campioni isolanti elettrici senza rivestimento metallico. Tuttavia, i campioni non conduttivi, come i materiali biologici, sono talvolta soggetti a carica; maggiore luminosità in posizioni specifiche del campione a causa dell'accumulo di elettroni ("carica"). Esponendo il campione a fasci di elettroni per un periodo di tempo più lungo o per un ingrandimento elevato, aumenta gli effetti di carica. Il rivestimento della superficie del campione con materiali metallici elettrici-conduttivi impedisce il verificarsi della ricarica. Utilizzare il sistema di rivestimento sottovuoto installato all'interno dell'unità crio-SEM per evitare che la temperatura del campione aumenta durante il rivestimento.

1. Assicurarsi che il materiale di rivestimento sia installato in una testina evaporatrice designata del sistema di rivestimento.
2. Mantenere la temperatura dello stadio freddo nel sistema di rivestimento al di sotto di 170 gradi centigradi.
3. Posizionare il supporto del provino sullo stadio freddo del sistema di rivestimento dopo una sufficiente incisione congelata.
4. Aprire una partizione tra la fase fredda e la testa dell'evaporatore.
5. Impostare il valore corrente e il valore di tensione della testa dell'evaporatore rispettivamente a ca. 30 mA e ca. 5 V.
6. Materiale di rivestimento evaporato per ca. 30 s per rivestire la superficie del campione.
7. Impostare entrambi i valori di corrente e di tensione della testa dell'evaporatore a zero e chiudere la partizione.
8. Posizionare il supporto del campione sullo stadio freddo della camera del campione per l'osservazione.

Risultati

Immagini rappresentative di superfici trasversali di xylem di conifere e a foglia larga, osservate dal crio-SEM, sono mostrate nella Figura 2. A basso ingrandimento, l'area nera nelle immagini indica le cavità da cui l'acqua scompare interamente o parzialmente e l'area grigia indica pareti di cellule xylem, citoplasma e acqua (Figura 2A). Ad alto ingrandimento, è evidente che l'acqua non è completamente persa ...

Discussione

I metodi di osservazione crio-SEM introdotti in questo documento sono pratici per visualizzare chiaramente la distribuzione dell'acqua su scala cellulare. Attraverso questo metodo, esplorare i cambiamenti nella distribuzione dell'acqua all'interno di xylem può potenzialmente aiutare a chiarire il meccanismo di tolleranza delle specie arboree allo stress abiotico (carenza di acqua o congelamento) o allo stress biotico (malattia degli alberi).

Il passo più importante in questo metodo è preser...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
coating material	JOEL Ltd., Japan	Gold wire, 0.50 × 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499
cryo scanning electron microscope	JOEL Ltd., Japan	JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS
cryostat	Thermo Scientific	CryoStar NX70
microtome blade	Thermo Scientific	HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735
tissue freezing embedding medium	Thermo Scientific	Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006