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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di una soluzione di lavoro di granuli di Gushukang per studi sugli animali e granulo GSK contenenti siero per esperimenti in vitro. Questo protocollo può essere applicato alle indagini farmacologiche di farmaci a base di erbe, nonché alle prescrizioni sia per esperimenti in vivo che in vitro.

Abstract

La medicina tradizionale cinese a base di erbe svolge un ruolo come metodo alternativo nel trattamento di molte malattie, come l'osteoporosi postmenopausale (POP). I granuli di Gushukang (GSK), una prescrizione commercializzata in Cina, hanno effetti ossei-protettivi nel trattamento del POP. Prima della somministrazione al corpo, una procedura di preparazione standard è comunemente necessaria, che mira a promuovere il rilascio di costituenti attivi da erbe crude e migliorare gli effetti farmacologici così come gli esiti terapeutici. Questo studio propone un protocollo dettagliato per l'utilizzo di granuli GSK in vivo e in analisi sperimentali in vitro. Gli autori forniscono innanzitutto un protocollo dettagliato per calcolare i dosaggi adatti agli animali dei granuli per l'indagine in vivo: pesatura, dissoluzione, stoccaggio e somministrazione. In secondo luogo, questo articolo descrive i protocolli per la scansione micro-CT e la misurazione dei parametri ossei. Sono stati valutati i protocolli per l'esecuzione della macchina micro-CT e la quantificazione dei parametri ossei. In terzo luogo, vengono preparati granuli GSK contenenti siero e il siero contenente farmaci viene estratto per l'osteoclastogenesi in vitro e l'osteoblastogenesi. I granuli GSK sono stati somministrati intragastricamente due volte al giorno ai ratti per tre giorni consecutivi. Il sangue è stato poi raccolto, centrifugo, inattivato e filtrato. Infine, il siero è stato diluito e utilizzato per eseguire l'osteoclastogenesi e l'osteoblastogenesi. Il protocollo qui descritto può essere considerato un riferimento per le indagini farmacologiche di farmaci a base di erbe, come i granuli.

Introduzione

La medicina tradizionale cinese (TCM) è uno degli importanti approcci complementari e alternativi per il trattamento dell'osteoporosi1,2. Il decotto d'acqua è la forma di base e più comunemente utilizzata della formula3. Tuttavia, esistono anche inconvenienti: cattivo gusto, disagio per il trasporto, breve durata di conservazione e protocolli incoerenti, limitando gli usi così come gli effetti curativi. Per evitare gli svantaggi di cui sopra e per perseguire effetti migliori, granuli sono stati sviluppati e sono stati ampiamente utilizzati4. Anche se molti studi hanno esplorato i meccanismi farmacologici di uno o più componenti efficaci dai granuli5,6,7, i meccanismi esatti e i processi farmacologici sottostanti sono ancora difficile da identificare. Questo perché troppi componenti efficaci da un granulo possono contemporaneamente esercitare effetti simili o opposti4. Pertanto, lo sviluppo di un protocollo standard per preparare i granuli prima di consegnare al corpo non solo avrebbe un grande impatto sugli esiti terapeutici, ma è richiesto anche per i saggi in vivo e in vitro.

Inoltre, gli effetti curativi dei granuli in clinica sono difficili da confermare ed identificare esattamente utilizzando studi in vitro o ex vivo, il che crea una sfida perché i meccanismi farmacologici sono troppo complessi. Per risolvere questo problema, la preparazione del siero contenente farmaci è stata proposta per la prima volta da Tashino neglianni '80 8. Da allora in poi, numerosi ricercatori hanno applicato il siero contenente farmaci alla medicina a base di erbe, compresi i granuli9,10,11. Attualmente, la scelta del siero contenente di farmaci per le indagini in vitro è considerata come una strategia che imita da vicino le condizioni fisiologiche.

I granuli di Gushukang (GSK) sono stati sviluppati per trattare l'osteoporosi postmenopausale (POP) basata sulla pratica clinica alla luce della teoria della MTC. I granuli GSK prevengono la perdita ossea nei topi ovariati (OVX) in vivo, inibiscono il riorspo osseo osteoclasta e stimolano la formazione ossea osteoblastica4. Di conseguenza, Li et al.12 ha scoperto che i granuli GSK hanno effetti protettivi ossei nei topi OVX migliorando le attività del recettore del calcio per stimolare la formazione ossea. Per confermare gli effetti ossei-protettivi e gli effetti farmacologici dei granuli GSK, gli autori qui forniscono una procedura dettagliata per la preparazione di soluzioni di lavoro e siero contenente farmaci (granulo GSK). Inoltre, questo articolo descrive l'applicazione dei granuli GSK in un modello di topo osteoporotico indotta da OVX e nel siero contenente granulo GSK per l'osteoclastogenesi in vitro/osteoblastogenesi.

I granuli GSK sono composti da diverse erbe13,14 e possono essere completamente disciolti in salina facilmente. Pertanto, salina serve come veicolo. I topi a sham (Sham) e OVX sono stati somministrati lo stesso volume di salina dei topi somministrati al granulo. Le dosi equivalenti di granuli GSK per il topo sono state calcolate in base all'equazione Meeh-Rubner15. Questa equazione non solo ha il vantaggio di ottenere dosaggi sicuri, ma garantisce anche effetti farmacologici15. I tre dosaggi di granuli GSK sono stati generati come segue: (1) GSKL: OVX - granuli GSK a basso dosaggio, 2 g/kg/giorno. (2) GSKM: OVX - granuli GSK a media dose, 4 g/kg/giorno. (3) GSKH: OVX - granuli GSK ad alta dose, 8 g/kg/giorno. I topi dei gruppi GSKL, GSKM e GSKH sono stati somministrati intragastricamente i granuli GSK. Il carbonato di calcio di calcio (600 mg/compressa) con vitamina D3 (125 unità/compressa internazionale), ad esempio, in un prodotto maturo e commercializzato (ad esempio, Caltrate [CAL]) per il trattamento e la prevenzione dell'osteoporosi, è stato utilizzato come controllo positivo.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite con l'approvazione di Institutional Animal Care and Use Committee della Shanghai University of TCM (S -Y201604005).

1. Preparazione e somministrazione della soluzione di lavoro GSK

  1. Calcolare le dosi equivalenti di granuli GSK per il mouse.
    1. Calcolare la superficie del corpo in base all'equazione Meeh-Rubner15: superficie del corpo - K x (peso corporeo2/3)/1000, dove i valori K sono 10.6 per umano e 9.1 per il mouse. Supponendo un peso corporeo umano di 70 kg, quindi superficie corporea umana (m2) - 10,6 x (70 2/3)/1000 x 1,8 m2. Supponendo un peso corporeo del mouse di 20 g (0,02 kg; ad esempio, 1 mese, femmina, C57/BL6), quindi la superficie del corpo del mouse (m2) - 9,1 x (0,022/3)/1000 - 0,0067 m2.
    2. In base alla superficie del corpo calcolata, calcolare il rapporto di trasformazione del corpo per l'uomo e il mouse. Umano: 70 kg/1,8 m2 x 39. Mouse: 0,02 kg/0,0067 m2 Granulo GSK 20 g/70 kg x 39/3 , 3,72 g/kg , 4 g/kg.
    3. Sulla base di un peso corporeo di 20 g per topo, calcolare il dosaggio equivalente per il mouse: 4 g/kg x 0,02 kg e 0,08 g.
    4. Calcolare tre dosi equivalenti di granuli GSK basati su 20 topi per gruppo e un intervento della durata di 3 mesi (90 giorni): (1) GSKL (OVX - granuli GSK a basso dosaggio [2 g/kg/giorno]): 0,04 g di topi al giorno x 20 mouse x 90 giorni x 72 g. (2) GSKM (OVX - medio dose GSK granules [4 g/g/g/4g/g/g/g/granules/4 g/g/g/4g/g/g/g/g/g/m./ giorno]): 0,08 g di mouse/giorno x 20 topi x 90 giorni : 144 g. (3) GSKH (OVX : granuli GSK ad alta dose [8 g/kg/giorno]): 0,12 g di mouse/giorno x 20 topi x 90 giorni
      NOTA: Preparare un ulteriore 20% di granuli GSK in pratica per compensare la perdita.
  2. Calcolare il volume del granulo GSK per mouse in base al peso corporeo15: ad esempio, il volume (V) - 0,24 mL/mouse/giorno.
    NOTA: Il volume per la somministrazione intragastrica per il mouse è di 0,12 mL/10 g.
  3. Pesare 10 giorni di tre dosi di granuli GSK. Pesare 8 g, 16 g, e 24 g di granuli GSK e servire come GSKL, GSKM, e GSKH, rispettivamente.
  4. Calcolare la dose equivalente di carbonato di calcio con vitamina D3 (CAL) per il topo in base all'equazione Meeh-Rubner15 come nei passaggi 1.1.1 e 1.1.2: dosaggio CAL : 2 compresse/70 kg x 39/3 - 0,372 compresse kg , 0,4 compresse/kg.
  5. Sulla base di un peso corporeo di 20 g per mouse (ad esempio, 1 mese, femmina, C57/BL6), calcolare il dosaggio equivalente di CAL per mouse: 0,4 compresse/kg x 0,02 kg x 0,008 compresse. Calcolare quindi la dose equivalente di CAL in base a 20 mouse per gruppo e un intervento della durata di 3 mesi (90 giorni): 0,008 compresse x 20 x 90 x 14,4 compresse. Pesa 10 giorni di CAL (1,6 compresse).
  6. Dissoluzione
    1. Mettere 8 g di granuli GSK in un tubo da 50 mL. Aggiungere 48 mL di salina e agitare il tubo per sciogliere completamente.
      NOTA: lo standard per la dissoluzione completa è l'assenza di sedimenti. La dissoluzione completa può essere ulteriormente confermata se un ago gavage può elaborare la soluzione di lavoro e poi espellerla senza intoppi.
    2. Ripetere il passaggio 1.5.1 con 16 g e 24 g di granuli GSK.
    3. Mettere 1,6 compresse (10 giorni) di CAL in un tubo da 50 mL. Aggiungere 48 mL di salina e agitare il tubo per sciogliere completamente.
      NOTA: Le soluzioni di lavoro possono essere conservate a -4 gradi centigradi e preparate ogni 10 giorni.
  7. Somministrazione intragastrica
    1. Afferrare la parte posteriore del mouse (1 mese, femmina, C57/BL6) con il mouse rivolto in avanti e assicurarsi che rimanga saldamente in quella posizione. Mantenere il mouse calmo per 2/3 min prima della somministrazione.
      NOTA: Assicurarsi che il ricercatore può vedere chiaramente la parte anteriore del mouse. Indossare guanti per prevenire i morsi di topo, in particolare per i nuovi ricercatori.
    2. Posizionare l'ago gavage (dimensioni: #12, 40 mm) nella soluzione di lavoro dei granuli GSK e disegnare 0,24 mL della soluzione di lavoro.
    3. Mettere l'ago gavage nel mouse attraverso un lato della bocca fino a quando l'ago gavage raggiunge lo stomaco.
      NOTA: Per confermare che l'ago gavage ha raggiunto lo stomaco: (1) L'ago di gavage incontra la sensazione di resistenza. Nel frattempo, il topo mostra l'azione di deglutizione prima che l'ago della gavage passi il restringimento fisico dell'esofago. (2) Iniettare circa 0,5 mL della soluzione di lavoro nel mouse e attendere 1 min. Se non c'è soluzione che escono dal mouse, questo significa che l'ago gavage ha raggiunto lo stomaco.
    4. Iniettare la soluzione di lavoro del granulo GSK (0,24 mL/mouse) nello stomaco e quindi estrarre l'ago di gavage. Riportare il topo nella sua gabbia.
    5. Ripetere il passaggio 1.6.4 con la soluzione CAL e inserire 0,24 mL della soluzione CAL per mouse.
      NOTA: il volume della soluzione CAL viene calcolato come nel passaggio 1.2.

2. Scansione micro-CT

  1. T ibia raccolta e preparazione
    1. Anestesizzare inmodo il topo con 300 mL/100 g di 80 mg/kg di ketamina il giorno successivo all'intervento di 90 giorni. Utilizzare un pizzico di ago delle dita dei dei pipi'per confermare se il mouse è completamente anetizzato. Nessuna risposta indica che l'anestesia di successo. Quindi uccidere il topo con lussazione cervicale.
    2. Fissare il mouse con le braccia e le gambe su schiuma con tacche.
    3. Tagliare la pelle con forbici (dimensioni: 8,5 cm) e pinzette (dimensioni: 10 cm) delle gambe dal proximal all'estremità dissalare e poi raccogliere le tibie.
    4. Mettere immediatamente le tibie nel 70% di alcool etilico e lavare per 3 volte.
  2. Avvolgere la tibia sinistra del mouse con schiuma di spugna e metterla in un tubo campione (35 mm di diametro, 140 mm di lunghezza).
    NOTA: L'asse lungo del campione deve essere insieme a quello del tubo campione. Assicurarsi che l'estremità prossimale dei punti tibia verso l'alto.
  3. Esecuzione della macchina di scansione micro-CT 80
    1. Avviare la macchina di scansione micro-CT 80 a temperatura ambiente.
    2. Impostare il tubo campione in micro-CT 80 e avviare la scansione trasversale con i seguenti parametri di scansione: dimensione in pixel 15,6 m, tensione del tubo 55 kV, corrente del tubo 72 A, tempo di integrazione 200 ms, risoluzione spaziale 15,6 m, risoluzione pixel 15,6 m e matrice dell'immagine 2048 x 2048.
      NOTA: l'osso cancellosi si distingue dall'osso corticale mediante la pre-scansione. L'area di scansione della tibia è definita come l'area ossea annullata da 5 mm sotto l'altopiano tibiale fino all'estremità distale.
  4. Quantificazione del parametro osseo
    1. Dopo aver completato la scansione trasversale, ottenere le immagini dei tibi di sinistra.
    2. Impostare la soglia di densità su 245-1000. Utilizzare il programma di valutazione micro-CT V6.6 per misurare i seguenti parametri ossei: densità minerale ossea (BMD), volume osseo su volume totale (BV/TV), numero osseo trabecolare (Tb.N), spessore osseo trabecolare (Tb.Th), nonché separazione ossea trasbecolare ( Tb.Sp).

3. Preparazione del siero del sangue per esperimenti in vitro

  1. calcolo
    1. Sulla base di un peso corporeo del ratto di 0,2 kg (1 mese, femmina, Sprague-Dawley), calcolare il dosaggio del granulo GSK: dosaggio umano/giorno x peso corporeo del peso umano x K/peso corporeo del ratto - 20 g/70 kg/giorno x 70 kg x K (K x 0,018) /0,2 kg - 2 g/kg/giorno.
      NOTA: K è il coefficiente di trasformazione farmacologica tra umano e tono15 (K - 0,018).
    2. Ripetere il passaggio 3.1.1 e calcolare i seguenti dosaggi.
      1. Calcolare il dosaggio di GSKL: 10 g/70 kg/giorno x 70 kg x K/0,2 kg x 1 g/kg/giorno.
      2. Calcolare il dosaggio di GSKM: 20 g/70 kg/giorno x 70 kg x K/0,2 kg - 2 g/kg/giorno.
      3. Calcolare il dosaggio di GSKL: 40 g/70 kg/giorno x 70 kg x K/0,2 kg : 4 g/kg/giorno.
      4. Calcolare il dosaggio di CAL: 2 compresse /70 kg/giorno x 70 kg x K/0,2 kg : 0,2 compresse/kg/giorno.
    3. Calcolare il dosaggio totale di granulo GSK e CAL.
      1. Calcolare il dosaggio totale per GSKL: 1 g/kg/giorno x 0,2 kg x 6 ratti x 3 giorni x 3,6 g.
      2. Calcolare il dosaggio totale per GSKM: 2 g/kg/giorno x 0,2 kg x 6 ratti x 3 giorni x 7,2 g.
      3. Calcolare il dosaggio totale per GSKH: 4 g/kg/giorno x 0,2 kg x 6 ratti x 3 giorni x 14,4 g.
      4. Calcolare il dosaggio del CAL: 0,2 compresse/kg/giorno x 0,2 kg x 6 ratti x 3 giorni , 0,72 compresse.
        NOTA: è necessario un totale di 10 mL di siero contenente granuli GSK per preparare un supporto di coltura di 100 mL (20% siero contenente granulo GSK). Ogni ratto (6 ratti/gruppo) dovrebbe fornire 1,5 mL di siero contenente granuli GSK dopo la centrifugazione.
    4. Calcolare il volume dei granuli GSK applicati per ratto in base al peso corporeo15: ad esempio, volume (V) - 2 mL/ratto/giorno.
      NOTA: Il volume per la somministrazione intragastrica per il ratto è di 0,1 mL/10 g.
  2. Pesare 3 giorni di tre dosi di granuli GSK. Pesare 3,6 g, 7,2 g, e 14,4 g di granuli GSK e servire rispettivamente come GSKL, GSKM e GSKH. Pesare 0,72 compresse per il gruppo CAL.
  3. Mettere 7,2 g di granuli GSK in un tubo da 50 mL. Aggiungere 36 mL di salina e agitare il tubo per sciogliere completamente. Ripetere questo con 3,6 g e 14,4 g di granuli GSK.
  4. Ripetere la sezione 1.6 per la somministrazione intragastrica con 2 mL di soluzione di lavoro GSK.
    NOTA: Amministrare lo stesso volume di salina (2 mL per ratto) per preparare il siero e funge da gruppo di controllo vuoto per i saggi in vitro.
  5. Preparazione del siero contenente GSK
    1. Anestesizzare inmodo i ratti con 300 mL/100 g di 80 mg/kg di ketamina 1 h dopo l'ultima somministrazione di granuli GSK. Utilizzare un pizzico di ago delle dita dei dei pipi' per confermare se il ratto è completamente anetizzato. Nessuna risposta indica che l'anestesia di successo.
    2. Esporre l'addome sul fondo del torace dei ratti utilizzando forbici operanti dopo aver inciso la pelle e il peritoneo.
      NOTA: Lo strumento chirurgico deve essere sterilizzato ad alte temperature e pressioni elevate prima dell'uso. L'area chirurgica deve essere sterilizzata con il 70% di etanolo durante la raccolta del sangue.
    3. Rimuovere il tessuto connettivo dell'aorta addominale con carta velina per esporre chiaramente il vaso.
    4. Estrarre sangue dall'aorta addominale utilizzando una siringa da 10 mL e 22 G. Quindi rimuovere l'ago e trasferire il sangue in un tubo sterile da 15 mL. Di solito, 6-8 mL di sangue possono essere ottenuti da un ratto.
      NOTA: Ogni ratto deve essere tenuto a vivere quando preleva sangue. Un indicatore è che l'aorta addominale pulsa quando il ratto è vivo. Il ratto è morto dopo l'estrazione del sangue.
    5. Mantenere il tubo in posizione verticale a temperatura ambiente per 30-60 min fino a quando il sangue è coagulato nel tubo. Quindi centribugiare il tubo a 500-600 g per 20 min. Trasferi tutti i supernatali (siero) da un gruppo (6 ratti) a un tubo sterile da 50 mL e agitati per mescolare.
    6. Inattivare il siero incubando in un bagno d'acqua a 56 gradi centigradi per 30 min. Filtrare il siero utilizzando un filtro di siringa idrofilo di dimensioni di 0,22 m.a.m. Conservare a -80 gradi centigradi per un utilizzo a lungo termine (meno di 1 anno).
      NOTA: Il siero filtrato può essere utilizzato per l'osteoclastogenesi in vitro e l'osteoblastogenesi.
  6. domanda
    1. Osteoclastogenesi in vitro
      1. Diluire i tre dosaggi del siero contenente GSK (GSKL, GSKM, GSKH) al rapporto di 1:4 con il mezzo minimo dell'aquila contenente L-glutamine, ribonucleosides e deoxyrinucleobosides.
        NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di siero contenente GSK per l'osteoclastogenesi in vitro e l'osteoblastogenesi sia del 20%.
      2. Aggiungere il siero diluito contenente GSK (200 s/pozza) dal passo 3.6.1.1 ai macrofagi del midollo osseo (BMS) da 4/6 settimane vecchio C57BL/6 topi per l'osteoclastogenesi e stimolare i BMM con macrofro centro-stimolante fattore (M-CSF, 10 ng/mL) e il recettore per il ligando di fattore nucleare-B (RANKL, 100 ng/mL) come descritto in precedenza2.
    2. Osteoblastogenesi in vitro
      1. Ripetere il passaggio 3.6.1.1.
      2. Aggiungere il siero diluito contenente GSK (2 mL/bene) alle cellule staminali mesenchymale osseo (BMSC) dai topi C57BL/6 di 4-6 settimane per generare osteoblasto come descritto in precedenza16.

Risultati

I risultati della scansione micro-CT hanno indicato che i topi OVX hanno mostrato una perdita ossea significativa rispetto ai topi di controllo salino (Figura 1A). L'intervento (90 giorni) dei granuli GSK ha notevolmente aumentato il BMD, in particolare nel gruppo GSKM (Figura 1B). Sono stati quantificati i parametri della struttura ossea, come BMD, BV/TV, Tb.N e Tb.Th. I trattamenti di granuli GSK hanno portato a un aumento del ...

Discussione

I granuli degli agenti MTC sono diventati una delle scelte comuni per formulazioni o prescrizioni. Granuli GSK sono composti da diversi farmaci a base di erbe basati su esperienze cliniche o la teoria TCM, ed esercitano migliori effetti curativi con meno effetti collaterali4. Rispetto al decotto dell'acqua, i granuli hanno questi vantaggi: buon gusto, convenienza di consegna, stoccaggio a lungo termine, protocollo standard ed effetti curativi coerenti, nonché una maggiore produttività. Attualmen...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 e 81330085), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ Team innovativo, Ministero dell'Educazione della Cina (Da IRT1270 a WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017-01010 a WYJ), Tripyears Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (Y(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), e progetti chiave per lo sviluppo della ricerca (2018YFC1704302).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
α-MEMHyclone
laboratories		SH30265.018For cell culture
β-GlycerophosphateSigmaG5422Osteoblastogenesis
Caltrate (CAL)WyethL96625Animal interventation
C57BL/6 miceSLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		RandomAinimal preparation
DexamethsomeSigmaD4902
Dimethyl sulfoxideSigmaD2438Cell frozen
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)Sangon Biotech60-00-4Samples treatmnet
Fetal bovine serumGibcoFL-24562For cell culture
Gushukang granuleskangcheng companyin chinaZ20003255Herbal prescription
Light microscopeOlympus BX50Olympus BX50Images for osteoclastogenesis
L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrateSigmaA8960-5GOsteoblastogenesis
MicroscopeLeicaDMI300BOsteocast and osteoblast imagine
M-CSFPeprotechAF-300-25-10Osteoclastogenesis
Μicro-CTScanco
Medical AG		μCT80 radiograph microtomographBone Structural analsysis
RANKLPeprotech11682-HNCHFOsteoclastogenesis
Sprague DawleySLAC Laboratory
Animal Co. Ltd.		RandomBlood serum collection
Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) KitSigma-Aldrich387A-1KTTRAP staining

Riferimenti

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