Analisi 3D delle risposte multi-cellulari ai gradienti chemoattractant

Riepilogo

Descriviamo un metodo per costruire dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari. Questo dispositivo consente l'analisi delle risposte cellulari ai segnali solubili in microambienti 3D con gradienti chemioattrattante definiti. Gli organoidi sono meglio di cellule singole al rilevamento di ingressi rumorosi deboli.

Abstract

Varie limitazioni dei sistemi di coltura cellulare 2D hanno suscitato interesse per le piattaforme di analisi e coltura cellulare 3D, che simulerebbero meglio la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi e mimano le funzioni tissutali in vivo. I recenti progressi nelle tecnologie di microfabbricazione hanno facilitato lo sviluppo di ambienti 3D in vitro in cui le cellule possono essere integrate in una matrice extracellulare ben definita (ECM) e un set definito di biomolecole solubili o a matrice associata. Tuttavia, le barriere tecnologiche hanno limitato il loro uso diffuso nei laboratori di ricerca. Qui, descriviamo un metodo per costruire semplici dispositivi per la cultura 3D e la sperimentazione con cellule e organoidi multicellulari in microambienti 3D con un gradiente chemioattrattante definito. Illustreremo l'uso di questa piattaforma per l'analisi della risposta delle cellule epiteliali e degli organoidi ai gradienti dei fattori di crescita, come il fattore di crescita epidermico (FEG). I gradienti del FEG erano stabili nei dispositivi per diversi giorni, portando alla formazione di rami diretti negli organoidi del seno. Questa analisi ci ha permesso di concludere che il rilevamento del gradiente collettivo da parte di gruppi di cellule è più sensibile rispetto alle singole cellule. Descriviamo anche il metodo di fabbricazione, che non richiede strutture fotolitografiche né tecniche avanzate di Litografia morbida. Questo metodo sarà utile per studiare i comportamenti cellulari 3D nel contesto dell'analisi dello sviluppo e degli stati patologici, compreso il cancro.

Introduzione

In ambiente fisiologico, le cellule sono incorporate in una matrice extracellulare (ECM) ed esposte a una pletora di biomolecole. Le interazioni tra le cellule e il microambiente circostante regolano i processi intracellulari che controllano diversi fenotipi, tra cui la migrazione, la crescita, la differenziazione e la sopravvivenza^1,2. Molto è stato appreso sui comportamenti cellulari in una coltura cellulare 2D convenzionale. Tuttavia, con l'avvento dell'imaging intravitale e della sperimentazione con cellule incorporate in idrogel 3D, importanti differenze nei comportamenti delle cellule sono state riconosciute nelle colture 2D in vitro semplificate rispetto agli ambienti simili a tessuti 3D. Mentre le cellule interagiscono con le fibre ECM e percepiscono le loro proprietà meccaniche all'interno della matrice 3D, la rigidità del materiale del gel non è una variabile completamente indipendente in un sistema 2D in vitro. La dimensionalità altera la formazione di adesione focale, con conseguente morfologia e comportamento delle cellule differenti. Inoltre, le celle su una superficie 2D sono esposte a meno segnali di segnalazione rispetto alle celle aperte a tutte le direzioni in 3D.

Queste limitazioni hanno aumentato gli interessi dei sistemi 3D che rappresentano la complessità spaziale e chimica dei tessuti viventi e prevedono meglio le funzioni tissutali in vivo. Sono stati sviluppati in molte forme da organoidi come microstrutture cellulari auto-assemblaggio alle cellule intervallate casualmente in ECM^3,4. I recenti progressi nelle tecnologie di microfabbricazione hanno facilitato l'avvento di vari tipi di sistemi di coltura 3D^{5, 6,7,8,9} per lo studio dei cambiamenti fenotipici e risposte cellulari ai segnali solubili; Tuttavia, le barriere tecnologiche limitano l'uso diffuso nei laboratori di ricerca. In molti casi, i processi di fabbricazione richiedono tecniche di fotolitografia e conoscenze di fondo per la litografia morbida. Inoltre, vari fattori devono essere controllati per costruire con successo un dispositivo e per ottenere una funzione ottimale del dispositivo per un lungo periodo di tempo.

Il nostro metodo descrive come costruire un dispositivo 3D PDMS per incorporare le cellule e gli organoidi multicellulari in un microambiente 3D con gradienti chemioattrattante definiti e quindi analizzare le risposte epiteliali a EGF¹⁰. I nostri dati rivelano che la capacità degli organoidi di reagire ai gradienti del FEG superficiali deriva dall'accoppiamento chimico intercellulare attraverso incroci di Gap. Suggerisce il potenziale degli organoidi per una rilevazione più precisa di ingressi deboli e rumorosi spazialmente graduati. Il processo di fabbricazione non richiede una struttura per camera bianca né tecniche di fotolitografia. Tuttavia, il dispositivo 3D PDMS include i fattori necessari dell'ambiente fisiologico 3D. Questo metodo sarà utile per studiare i comportamenti cellulari 3D e ha un grande potenziale di ricerca con diversi tipi di cellule, chemoattractants, e combinazioni ECM.

Protocollo

Tutto il lavoro animale è stato condotto in conformità con i protocolli esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali, Johns Hopkins University, School of Medicine.

1. fabbricazione del dispositivo mesofluidico

1. Progettare la maschera dello stampo per il dispositivo PDMS utilizzando un software CAD 3D.
2. Stampare lo stampo utilizzando apparecchiature di stereolitografia con una resina termoresistente.
   Nota: le procedure qui descritte sono state svolte da un servizio di stampa 3D commerciale.
3. Miscelare accuratamente una soluzione di monomero PDMS con l'agente polimerizzante in un rapporto di 10:1. per la fabbricazione del dispositivo è stato richiesto 3 mL di miscela PDMS. Il volume totale dipende dal numero degli stampi da fabbricare.
4. Degas la miscela applicando un vuoto con l'uso di un laboratorio in-House vuoto o pompa a vuoto in un essiccatore sottovuoto per 1 ora.
5. Tamponare la superficie dello stampo con un nastro adesivo per rimuovere la polvere, quindi versare la miscela di PDMS allo stampo. Se si introducono bolle nel processo, ripetere il degassamento nell'essiccatore a vuoto. Le bolle intrappolate tra i pilastri dello stampo possono essere rimosse infilandole con un ago affilato.
   Nota: il processo di degassamento a temperatura ambiente deve essere fatto entro 1 ora o meno.
6. Curare il PDMS riscaldando a 80 ° c per 2 ore. Lasciare raffreddare lo stampo a temperatura ambiente.
7. Tagliare il confine tra lo stampo e PDMS con una lama e poi staccare PDMS dallo stampo con attenzione.
8. Tagliare la parte PDMS per adattarla al coprioggetti da 22 mm x 22 mm e perforare un foro all'ingresso.
   Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui.
9. Pulire la parte PDMS e il vetrino coprioggetti da 22 mm x 22 mm asciugando le superfici con tessuti a basso contenuto di lanugine e 70% di etanolo. Quindi rimuovere grandi particelle di polvere da afferrare con un nastro adesivo.
10. Sterilizzare la parte PDMS e il vetrino coprioggetti in autoclave (121 ° c per 8 minuti bagnati, 15 minuti a secco) o l'esposizione alla luce UV per 1 ora.
11. Trattare la superficie inferiore della parte PDMS e coprire con pistola di scarico corona per 5 min nel cappuccio cultura del tessuto e poi legarli insieme.
    Attenzione: posare qualsiasi materiale non conduttivo come polistirolo espanso sul fondo e rimuovere tutti i materiali conduttori durante questo processo. Iniettare il collagene nel dispositivo immediatamente, entro 5 minuti, dopo il trattamento per aumentare l'incollaggio tra gel di collagene e vetrino coprioggetti.

2. preparazione delle cellule: isolamento organoide primario mammario

Nota: i dettagli dell'isolamento organoide mammario possono essere trovati in un lavoro precedente¹¹. Qualsiasi tipo di singola cellula o organoide può essere preparato secondo i propri protocolli di isolamento/distacco.

1. Tritare il tessuto mammario della ghiandola dei topi con un bisturi fino a quando il tessuto si rilassa e scuoterlo per 30 minuti a 37 ° c in 50 mL di soluzione di collagenasi/tripsina (10 mL per topo) in DEME/F12 completato con 0,1 g di tripsina, 0,1 g di collagenasi , 5 mL di FBS, 250 μL di 1 μg/mL di insulina e 50 μL di gentamicina da 50 μg/mL.
2. Centrifugare la soluzione di collagenasi/tripsina a 1.250 x g per 10 min. rimuovere il supernatante per aspirazione. Disperdere le cellule in 10 mL di DMEM/F12 e centrifugare a 1.250 x g per 10 min. Dopo aver rimosso DMEM/F12 per aspirazione, risospendere le cellule in 4 mL di DMEM/F12 completati con 40 μL di DNase (2 unità/μL).
3. Agitare la soluzione DNase a mano per 2-5 minuti e quindi centrifugare a 1.250 x g per 10 min.
4. Separare gli organoidi da singole cellule attraverso quattro centrifugazioni differenziali (impulso a 1.250 x g e fermare la centrifuga 3-4 s dopo che raggiunge la velocità prevista). Tra ogni impulso, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di DMEM/F12.
5. Risospendere il pellet finale nella quantità desiderata di mezzo di crescita di DMEM/F12 con 1% di penicillina/streptomicina e 1% di insulina-transferrina-selenio-X per la preparazione del collagene.

3. preparazione e iniezione del collagene

Nota: altri tipi di gel ECM possono essere preparati secondo i propri protocolli di gelazione.

1. Preparare la soluzione di tipo I di collagene (3,78 mg/mL), 10x DMEM, soluzione 1 N NaOH, normale supporto di crescita sul ghiaccio.
   Nota: mantenere il ghiaccio fino al completamento della procedura.
2. Aggiungere 6 μL di soluzione 1 N NaOH, 200 μL di mezzo di crescita e 50 μL di DMEM 10x in una provetta per microcentrifuga pre-refrigerata e miscelare accuratamente la soluzione.
3. Aggiungere 425 μL di collagene nella soluzione premiscelata e miscelare accuratamente con il pipettaggio.
4. Centrifugare la miscela di collagene brevemente (meno di 5 secondi) per separare e rimuovere le bolle dalla miscela.
5. Mantenere la soluzione di collagene neutralizzato su ghiaccio per 1 ora per indurre la formazione di fibre.
6. Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare nella miscela di collagene e mescolare accuratamente.
   Nota: la concentrazione finale di collagene è di 2 mg/mL.
7. Iniettare la soluzione utilizzando 200 μL di Pipet attraverso l'ingresso del dispositivo PDMS fino a riempire l'intera camera. Se la miscela di collagene trabocca attraverso le lacune dei pilastri, tagliare il gel di collagene in eccesso con lama chirurgica affilata dopo la gelazione.
8. Tenere il dispositivo nell'incubatore a 37 ° c con 5% di CO₂ per 1 ora per indurre la gelazione.
9. Riempire i serbatoi su entrambi i lati con il mezzo di crescita e mantenere il dispositivo nell'incubatore a 37 ° c con il 5% di CO2 fino a quando non viene eseguita l'imaging confocale.

4. Imaging e quantificazione 3D

1. Installare una camera di coltura di imaging a cellule vive in un microscopio confocale e pre-impostare la temperatura e CO₂ a 37 ° c e 5%, rispettivamente. Per ottenere umidità fino, aggiungere acqua nel serbatoio della camera e posizionare salviette umide nella camera, se necessario.
2. Collocare il dispositivo PDMS nella camera e aggiungere il FEG a uno dei serbatoi come "fonte" del FEG nella formazione del gradiente. L'altro bacino servirà un "lavandino" necessario per lo sviluppo della distribuzione del FEG a livello spaziale. 2,5 nM di FEG è stato aggiunto nel lavello per rendere il gradiente di 0,5 nM/mm in questo studio.
3. Impostare l'intervallo di Z-stack che copre il volume di organoidi di interesse e avviare l'imaging.
   Attenzione: per evitare la fototossicità, provate un'intensità laser più bassa nell'imaging confocale o utilizzate tecniche di imaging multi-Foton.
4. Ricostruisci un'immagine 3D da stack di immagini 2D utilizzando un software commerciale o un programma personalizzato. Misurare la lunghezza e l'angolo dei rami che si estendono dagli organoidi o dalla migrazione delle singole cellule. Qui, eseguire la quantificazione disegnando un contorno a mano libera intorno al corpo organoide utilizzando ImageJ.

Risultati

Il FEG è un regolatore essenziale della morfogenesi ramificazione nelle ghiandole mammarie e di un chemioattrattante critico che guida la migrazione delle cellule epiteliali del seno nella crescita invasiva del cancro. Abbiamo usato i dispositivi fluidi mesoscopici sopra descritti per studiare la risposta delle cellule ai gradienti del FEG definiti (Figura 1a, B)¹⁰. Il dispositivo produce un'area di coltura larga 5 mm...

Discussione

La fabbricazione di stampi PDMS è stata eseguita utilizzando un servizio di stampa 3D commerciale, ma può anche essere realizzato da una stampante 3D di fascia alta in-House. Tra i vari metodi di fabbricazione 3D, la stereolitografia è consigliata per la generazione di stampi ad alta risoluzione. Poiché la polimerizzazione PDMS si verifica ad una temperatura elevata (80 ° c), i materiali devono essere sufficientemente resistenti al termicamente, che devono essere specificati esplicitamente, se la stampa è esternali...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935