Un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dall'epatocito del cancro epatocellulare in aumento nell'impostazione dell'infiammazione epatica e della fibrosi

Riepilogo

Qui, descriviamo lo sviluppo di un modello murino clinicamente rilevante del cancro al fegato che riassume le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC).

Abstract

L'assenza di un modello animale clinicamente rilevante che affronti le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC) ha ostacolato significativamente la chiarimento dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative. Per sviluppare un modello animale ideale che riassume l'HCC umano, i topi maschi immunocompetenti C57BL/6J ricevono prima un'iniezione di tetracloruro di carbonio (CCl₄₎per indurre la fibrosi epatica, quindi ricevono epatociti oncogenici istogenici-normali dal giovane maschio L'antigene SV40 T (TAg)-mice transgenico (MTD2) per inoculazione intrasplenica (ISPL). Androgeno generato in topi maschi destinataria alla pubertà avvia l'espressione TAg sotto il controllo di un promotore specifico del fegato. Di conseguenza, gli epatociti trasferiti diventano cellule tumorali e formano masse tumorali nell'impostazione della fibrosi epatica/cirrosi. Questo nuovo modello imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC nel contesto della fibrosi/cirrosi epatica e riflette le caratteristiche più tipiche dell'HCC umano, inclusa la disfunzione immunitaria.

Introduzione

Il cancro epatocellulare (HCC) è il tipo di cancro in più rapido aumento negli Stati Uniti (USA)^1,2,3. Ogni anno, circa 850.000 nuovi casi vengono diagnosticati^4,5 e 700.000 pazienti muoiono per questa malattia letale^6,7,8,9,10 , rendendola la seconda causa più alta di morte legata al cancro al mondo. La gestione dell'HCC comprende resezione chirurgica, trapianto, ablazione, chemioembolizzazione, o terapie sistemiche, come sorafenib¹¹. La diagnosi precoce e la gestione con resezione chirurgica o trapianto hanno il più alto beneficio di sopravvivenza complessiva⁴. Purtroppo, la maggior parte dei pazienti presentano in una fase successiva e richiedono la gestione con ablazione, chemioembolizzazione o sorafenib¹². Sorafenib, un inibitore della chinasi recettore (RTKI), è stato approvato dalla Food and Drug Administration nel 2008 come l'unica terapia farmacologica sistemica disponibile per il trattamento di HCC non aggiornabile. Anche se il farmaco fornisce solo un modesto aumento della sopravvivenza complessiva, da 7,9 a 10,7 mesi¹³, ha fornito una nuova strategia terapeutica che potrebbe essere utilizzata per gestire l'HCC.

La manipolazione del sistema immunitario per eliminare i tumori stabiliti è un settore in rapida crescita nella ricerca sul cancro¹⁴. Gli studi sui checkpoint immunitari hanno notevolmente avanzato lo sviluppo di farmaci immunoterapeutici nel trattamento del cancro^15,16. La FDA ha approvato l'uso di anticorpi (Abs) contro l'antigene citotossico T-linfocito 4 (CTLA-4), la proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1), e la sua PD-L1 legante per il trattamento del melanoma, del cancro ai polmoni, al cancro della testa e del collo e cancro alla vescica^{17, 18} mi lato ^{, 19} del 12 ^{, 20.}Le sperimentazioni cliniche di monoterapia o terapia combinata utilizzando uno o più anticorpi contro PD-1, PD-L1 o CTLA-4 per il trattamento di HCC avanzato sono in corso^21,22,23e alcuni hanno mostrato risultati favorevoli. Nel 2017, la FDA ha concesso l'approvazione accelerata per gli anticorpi anti-PD-1 per il trattamento dei pazienti HCC, che sono resistenza allo sorafenib, ma il tasso di risposta complessivo di questa terapia è solo del 14,3%. Altre strategie non sono state tradotte in pratica clinica in questo momento^24,25. Superare la tolleranza immunitaria profonda indotta dal tumore per migliorare la terapia del checkpoint immunitario²⁶; prevedere l'efficacia della terapia con checkpoint immunitario; prevenire eventi avversi legati al sistema immunitario; ottimizzazione del percorso amministrativo, del dosaggio e della frequenza; e trovare combinazioni efficaci di terapie^27,28,29 tutti rimangono compiti estremamente impegnativi.

Ci sono diversi approcci convenzionali utilizzati per indurre HCC nei modelli murini attualmente e sono utilizzati a seconda della particolare domanda di ricerca dello sperimentatore³⁰. I modelli murini HCC indotti chimicamente con composti genotossici imitano la malignità indotta da lesioni. I modelli di Xenotrapianto attraverso l'impianto ectopico o ortotopico delle linee cellulari HCC sono adatti per lo screening farmacologico. Un certo numero di topi geneticamente modificati sono stati progettati per studiare la fisiofisiologia dell'HCC. I topi transgenici che esprimono geni virali, oncogeni e/o fattori di crescita consentono l'identificazione delle vie coinvolte nell'epatocarcinogenesi. A causa di limitazioni intrinseche, questi modelli non riassumono le caratteristiche immunitarie tipiche osservate nell'HCC umano, il che ha ostacolato significativamente la chiarificazione dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative^{14 ,15}. Recentemente abbiamo creato un modello murino clinicamente rilevante. Questo nuovo modello non solo imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC, ma riflette anche le caratteristiche più tipiche della malattia umana, inclusa la disfunzione immunitaria. Abbiamo caratterizzato le sue caratteristiche biologiche e immunologiche. Sfruttando questo nuovo modello, abbiamo esplorato varie strategie immunoterapeutiche per trattare HCC^{31,32,33,34,35,36, 37}. Questa piattaforma unica ci permette di studiare i meccanismi dell'immunotolleranza indotta dal tumore e di sviluppare strategie terapeutiche proof-of-concept per l'HCC verso un'eventuale traduzione clinica.

Protocollo

NOTA: Tutta la procedura, inclusi i soggetti animali, è stata approvata dall'IACUC presso l'Università del Missouri. Tutti i topi hanno ricevuto cure umane secondo i criteri delineati nella "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio". La seguente procedura per l'isolamento cellulare e l'inoculazione deve essere eseguita in un cofano. Tutti gli esecutori devono indossare l'attrezzatura protettiva personale standard per la manipolazione dei topi e dei tessuti.

1. Induzione di fibrosi e cirrosi del fegato con iniezione IP di tetracloruro di carbonio (CCl₄)

NOTA: vedere la figura 1. (CCl₄ è reagente altamente pericoloso, deve essere maneggiato con attenzione e indossando guanti resistenti alle sostanze chimiche)

1. Ottenere topi maschi C57BL/6J di età di sei-otto settimane (vedere Tabella dei materiali).
2. Preparare la soluzione 10% CCl₄ (v/v) nell'olio di mais in un tubo di centrifuga. Determinare il volume totale in base al numero di mouse da inimettere (vedere il passaggio 1.6).
3. Utilizzare la tecnica di manipolazione dei mouse appropriata per selezionare un mouse per l'iniezione.
4. Trattenere manualmente il mouse con il suo lato dorsale (addome) verso l'alto.
5. Pulire il sito di iniezione sulla parete addominale del topo strofinando con 70% alcol.
6. Iniettare i topi maschi C57BL/6J con 160 gradi l di 10% soluzione CCl₄ mediante iniezione intraperitoneale (IP) utilizzando un ago monouso da 25 calibro.
7. Assicurarsi che l'ago penetri appena attraverso la parete addominale (circa 4-5 mm) con smusso rivolto verso l'alto e leggermente angolato a 15-20 gradi.
8. Iniettare i topi due volte a settimana per un totale di quattro settimane-ogni topo riceverà un totale di otto iniezioni.
   NOTA: Due settimane dopo l'ultima iniezione, i topi trattati sono pronti per l'inoculazione ISPL di epatociti oncogeni da topi MTD2.

2. Isolamento degli epaticiti tag transgenici dai topi Line MTD2

NOTA: vedere la Tabella 1 per le ricette della soluzione.

10x Soluzione di sale bilanciato di Earle senza Ca o Mg (EBSS senza Ca o Mg)	4 g di KCl 68 g NaCl 1,4 g NaH2PO4 H2o 10 g di destrosio Aggiungere acqua a 1 litro, pH a 4,32 Filtro passa attraverso
Soluzione 1	20 mL 10x EBSS senza Ca o Mg 44 g di NaHCO3 1,33 mL 1,5M Di hepes 10 mL da 10 mL EGTA Aggiungere acqua a 200 mL
Soluzione 2	100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Aggiungere acqua a 1 litro
Soluzione di collagenasi dello 0,75%	15 mg di collagenasi tipo 1 20 mL della soluzione 2
Mezzo completo	2 giri al rin 50 mL FBS 5 mL 100x Penicillina-Streptomicina

Tabella 1: Ricette di soluzione.

1. Ottenere la linea MTD2 topi³⁸ per servire come fonte di epatociti oncogenici.
2. Anestesizzai i topi MTD2 di 5 settimane usando il 2,5% di isoflurane.
   NOTA: l'anestesizzazione corretta verrà controllata con il metodo del pizzico dei dipighi. In breve, con due dita, dare il topo del mouse / piede una buona stretta. Se non c'è una reazione di astinenza, l'animale viene giudicato abbastanza profondo da iniziare l'intervento chirurgico.
3. Quando adeguatamente sedati, posizionare i topi in una posizione supina e fissare le estremità con nastro adesivo per fornire un'adeguata esposizione della superficie addominale.
4. Eseguire un'incisione laparotomia mediana utilizzando forbici lungo la lunghezza della linea alba abbastanza grande da fornire un'adeguata esposizione del fegato.
5. Sposizionare l'intestino a sinistra per fornire una migliore esposizione del fegato e triade portale.
6. Dissezitto sopra il fegato per esporre la vena cava inferiore (IVC).
7. Ligate l'IVC sopra il fegato utilizzando un morsetto dell'arteria.
8. Tornando al bordo inferiore del fegato, utilizzare un ago farfalla (vedi materiali) per ottenere l'accesso IV alla vena del portale. Fissare il catetere a mano.
9. Successivamente perfondere il fegato del topo utilizzando una siringa di iniezione a 8,9 mL/min con 15 mL di soluzione 1, 15 mL di 0.75% soluzione collagenasi 2, e 15 mL di soluzione 2 tramite il catetere.
10. Raccogliere il fegato perfuso tagliando e prendendo la massa tumorale dai topi MTD2 in un tubo conico 50 mL con 10-15 mL di PBS.
11. Rimuovere PBS e lavare un tempo aggiuntivo con PBS; non centrifugare in questo passaggio.
12. Tagliare il fegato in pezzi più piccoli utilizzando le forbici e poi lavare di nuovo con PBS 2x per rimuovere il sangue rimanente.
13. Aggiungere 5 mL di mezzo RPMI completo al tubo conico e tritare continuamente il fegato con le forbici a piccoli pezzi (<3 mm) tessuto dovrebbe passare senza intoppi attraverso una pipetta 5 mL.
14. Aggiungere l'RPMI completo a un volume finale di 30 mL e sospendere il fegato utilizzando una pipetta da 5 mL.
15. Filtrare la soluzione mista con un colino da 70 m in un tubo conico da 50 ml.
16. Lavare il colino più volte con RPMI completo e regolare il volume finale a 50 mL aggiungendo ulteriore supporto RPMI.
17. Ruotare rapidamente la sospensione con una centrifuga fino a un massimo di 500 giri/min; una volta che la velocità è accelerata a 50 x g, la centrifuga deve essere fermata.
18. Decant il supernatante e sospendere pellet in 20 mL di PBS.
19. Contare le cellule utilizzando l'esclusione blu Trypan e un emocitometro, quindi regolare la concentrazione cellulare a 2,5 x 10⁶/mL per la seguente inoculazione cellulare.
    NOTA: Il rendimento previsto da 5 grammi di tessuto tumorale è 80 milioni di epatociti con vitalità >95%.

3. Inoculare gli epatociti dai topi MTD2 al fegato di topi selvatici C57BL/6J mediante iniezione ISPL

1. La tecnica asettica deve essere utilizzata in tutte le procedure
2. Anestesizzare i topi maschi CCl₄trattati C57BL/6J con 2,5% isoflurane, i topi devono essere trattati con lubrificante oculare per evitare che gli occhi si asciughino.
3. Preparare le siringhe con 200 o più l of epatociti per l'iniezione.
4. Quando adeguatamente sedati, posizionare i topi con il lato sinistro verso l'alto.
5. Rasare l'intero fianco sinistro dei topi, quindi strofinare l'area, alternando tra 70% alcol e betadine tre volte.
6. Somministrare 5 mg/kg di carprofen sottocutaneamente prima dell'incisione chirurgica.
7. Fai un'incisione di 1 cm sul fianco sinistro parallela alla costola 13^dall'estremo dorsale che inizia appena sotto il muscolo della colonna vertebrale.
8. Identificare la milza, quindi esternarla con pinze a punta smussata.
9. Ritagliare la milza con due clip in titanio di medie dimensioni. Posizionare entrambe le clip tra l'arteria splenica e la vena, lasciare spazio tra le clip per tagliare in seguito dopo l'inoculazione.
   NOTA: L'obiettivo è quello di isolare il polo inferiore della milza per ridurre il rischio di semina.
10. Iniettare 200 l (0,5 milioni) degli epatociti preparati nel polo inferiore della milza utilizzando un ago da 27 G.
11. Ritagliare il ramo inferiore del pedicolo (vasi a palo splenico inferiori) con una clip di medie dimensioni.
12. Tagliare la milza tra le due clip posizionate inizialmente.
13. Rimuovere il polo inferiore della milza che è stato iniettato direttamente con cellule tumorali.
14. Utilizzare 3-0 polyglactin 910 interrotto sutura per chiudere lo strato muscolare interno.
15. Utilizzare clip di ferita d'acciaio sterilizzato per chiudere lo strato cutaneo esterno.
    NOTA: Le clip in acciaio sono preferite rispetto alle suture per evitare che gli animali mastichino le suture, lasciando una ferita spalancata.
16. Somministrare 5 mg/kg di carprofen subcutaneo dopo la sutura.
17. Posizionare tutti gli animali che recuperano su un cuscinetto di riscaldamento a temperatura controllata e monitorare attentamente fino a completa ripresa dall'anestesia.
18. Dare ai topi libero accesso all'acqua dopo l'intervento chirurgico. Se il topo si disidrata durante l'intervento chirurgico, somministrare i fluidi sottocutanei (<1 mL).
19. Rimuovere le clip della pelle a 7-10 giorni post-operatori.

Risultati

Gli epatociti oncogeni isolati dai topi transgenici TAg (Figura 2) sono stati seminati nel fegato di topi selvatici mediante iniezione intrasplenica (Figura 3). Gli epatociti trapiantati con successo e in modo affidabile sono cresciuti con successo e in modo affidabile tumori HCC ortotopici (Figura 4) con antigene tumorale specifico SV40 TAg (Figura 5) nell'impostazione di infiammazione epatica e fibrosi ( Figura1).

Discussione

Con questo protocollo, abbiamo stabilito un modello murino affidabile e riproducibile di HCC che imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC. Clinicamente, molti fattori di rischio successivamente inducono lesioni epatiche, fibrosi epatica, cirrosi e la fase finale di HCC. Nel nostro protocollo, l'iniezione IP di CCl₄ viene utilizzata per produrre prima fibrosi epatica in topi selvatici, che consente ai successivi epatociti oncogeni di formare i tumori nell'impostazione della fibrosi epatica. Abbiamo scope...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia machine	VETEQUIP	IMPAC6	anesthesia machine for surgery
Butterfly needle	BD	8122963	Needle used for liver perfusion
C57BL/6 mice	Jackson Lab	000664	mice used in prototol
Carprofen	CRESCENT CHEMICAL	20402	carprofen for pain release
Cell Strainer	CORNING	REF 431751	Cell strainer, 70µm, for hepatocytes isolation
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-30R	centrifuge for cell isolation
Clips	Teleflex Medical	REF 523700	Titanium Clips for spleen
Microscope	Zeiss	Primovert	microscope for cell observation
Mtd2 mice	N/A		Gift from Dr. William A Held at roswell Park Cancer Institute in 2002, maintained in our lab
Needle	BD	REF 305109	BD precisionglide needle, 27G x 1/2 (0.4mm x 13mm)
Suture	ETHICON	J303H	coated VICRYL suture
SV40 T Ag antibody	Abcam	ab16879	anti-SV40 T-antigen antibody for IHC
Syringe	BD	REF 309626	1 mL TB syringe for cell injection
Trypan blue	SIGMA	T 8154	Trypan blue solution for cell viability test
Wound clips	Reflex	reflex9, Part. No. 201-1000	stainless steel wound clips for wound close