Nitropeptide Profilazione e identificazione illustrata da Angiotensin II

Riepilogo

La profilazione proteomica delle proteine tirosine-nitrirate è stata una tecnica impegnativa a causa della bassa abbondanza della modifica 3-nitrotyrosine. Qui descriviamo un nuovo approccio per l'arricchimento e la profilazione dei nitropeptidi usando Angiotensin II come modello. Questo metodo può essere esteso per altri sistemi in vitro o in vivo.

Abstract

La nizione proteica è una delle più importanti modifiche post-traduzionali (PTM) sui residui di tirosina e può essere indotta da azioni chimiche di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e specie reattive di azoto (RNS) nelle cellule eucariotiche. L'identificazione precisa dei siti di nitrazione sulle proteine è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici correlati alla nitrazione delle proteine, come infiammazione, invecchiamento e cancro. Poiché le proteine netorate sono di scarsa abbondanza nelle cellule anche in condizioni indotte, non sono stati sviluppati metodi universali ed efficienti per la profilazione e l'identificazione di siti di nitrazione proteica. Qui descriviamo un protocollo per l'arricchimento dei nitropeptidi utilizzando una reazione di riduzione chimica e l'etichettatura della biotina, seguita da spettrometria di massa ad alta risoluzione. Nel nostro metodo, i derivati nitropeptici possono essere identificati con alta precisione. Il nostro metodo presenta due vantaggi rispetto ai metodi precedentemente riportati. In primo luogo, l'etichettatura dimetila viene utilizzata per bloccare l'ammina primaria sui nitropeptidi, che può essere utilizzata per generare risultati quantitativi. In secondo luogo, per l'arricchimento viene utilizzato un'obbligazione disulfida contenente reagente NHS-biotina, che può essere ulteriormente ridotta e alchilata per migliorare il segnale di rilevamento su uno spettrometro di massa. Questo protocollo è stato applicato con successo al modello peptide Angiotensin II nel documento attuale.

Introduzione

Nileggia dei residui di tirosina nelle proteine per formare 3-nitrotyrosine regola molti processi biologici. A causa delle diverse proprietà chimiche tra tirosina e 3-nitrotyrosine, una proteina nitrata può aver perturbato l'attività di segnalazione^1,2. Pertanto, è importante sviluppare metodi in grado di arricchire e identificare i siti di nitrazione sulle proteine in modo efficiente. Poiché 3-nitrotyrosine è una modifica a bassa abbondanza sulle proteine rispetto ad altre forme di PTM, come la fosforolalazione e l'acetilazione, è difficile identificare siti di nitrazione endogeni direttamente da linee cellulari o campioni di tessuto. Tuttavia, è stata sviluppata la metodologia dell'utilizzo della spettrometria di massa (MS) per caratterizzare il modello di frammentazione del nitrotpeptide (ad esempio, ,han & Desiderio³), che getta le basi per nuovi metodi di nitroproteomica.

Attualmente, un passo di arricchimento seguito da MS è la strategia più potente per la profilazione nitropeptide^4,5. I metodi di arricchimento possono essere classificati in due classi. Una classe si basa su anticorpi in grado di riconoscere 3-nitrotyrosine in modo specifico, mentre l'altra classe si basa sulla derivazione chimica che riduce un gruppo nitro a un gruppo di ammine^4,5. Per il metodo basato sugli anticorpi, la colonna di affinità nitrotyrosine viene utilizzata per l'arricchimento, da cui il materiale eluito viene ulteriormente risolto e analizzato dall'alta risoluzione MS^6,7. Per il metodo basato sulla derivazione chimica, i gruppi di ammine al n-terminus del peptide o della lisina devono essere bloccati nel primo passaggio da acetilazione, tag isobarici per quantitazione relativa e assoluta (iTRAQ), o tag di massa tandem (TMT) reagenti. Successivamente, viene utilizzato un riduttore per ridurre la nitrotilsina all'aminotirosofina seguita dalla modifica del gruppo di ammine appena formato, che include la legatura di biotina, la conversione di peptide sulfittra o altri tipi di sistemi di etichettatura^{8,9, 10,11}. La maggior parte dei protocolli stabiliti finora si basano su proteine in vitro sovranitate, invece di proteine endogenamente nitonate.

Nel presente studio, una procedura modificata della derivazione chimica della nitrotyrosine è sviluppata per l'arricchimento e l'identificazione del nitropeptide, che mostra una maggiore sensibilità durante il rilevamento della SM ed è adatto allo scopo di quantificazione. Il nostro recente studio sull'utilizzo di questo metodo nei sistemi biologici ha identificato che la nizione della crosina di tirosina (LCK) specifica del linfocito (LCK) al Tyr394 da RNS prodotta da cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC) svolge un ruolo importante immunosoppressione del microambiente tumorale¹². Pertanto, il nostro metodo di identificazione nitropeptide può essere applicato anche a campioni biologici complessi. Qui, descriviamo il nostro protocollo utilizzando il modello peptide Angiotensin II, di cui il modello di frammentazione è noto e ampiamente utilizzato negli studi nitroproteomici^8,9,10,11, come esempio.

Protocollo

1. Nirazione di Angiotensina II

1. Per generare un peptide nito, diluire 10 - L di AngiotensinI (DRVYIHPF) soluzione madre (2 mM in acqua) in 390 soluzione PBS l (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,4) alla concentrazione finale di 50 M.
2. Aggiungere 10 l di peroxynitrite (200 mM in 4,7% NaOH) alla soluzione Angiotensin II per rendere la concentrazione finale di perossintetazione 5 mM.
   NOTA: La peroxynitrite è instabile e facile da risolvere quando è in forma acida, quindi la soluzione madre di peroxynitrite viene mantenuta in soluzione di base e conservata in -80 gradi centigradi.
3. Regolare il valore di pH della soluzione a 7-8 da 1 M HCl. Per avviare la reazione di nitrazione, scuotere il tubo a 400 rpm per 5 min.
4. Utilizzare una colonna SPE in fase inversa disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) per il dissalamento.
   1. Preparare 2 soluzioni per il dealare, il 5% di metanolo in acqua per il lavaggio e l'80% di metanolo in acqua per l'elusione.
   2. Aggiungere 500 l di metanolo, seguito da 500 l' di acqua per pre-condizionare la colonna, mettere 1 pipettor mL con la punta sulla parte superiore della colonna, premere il pipettor per accelerare il flusso.
   3. Caricare 410 l del campione nel passaggio 1.3 sulla colonna, eliminare il flusso attraverso.
   4. Dopo il lavaggio con 500 luna del 5% di metanolo, utilizzare 300 luna di 80% di metanolo per eluire il nitropeptide, che viene poi completamente essiccato da velocità-vac nell'impostazione di default a temperatura ambiente.
      NOTA: Il dealanding è molto importante per le reazioni, poiché il solvente lasciato nel passaggio precedente può avere un effetto negativo sui passi successivi.

2. Alchilazione delle ammine primarie per etichettatura dimetila

1. Ricostituire la soluzione in polvere di nitro-angiotensini II in una soluzione di bicarbonato di trietilenio (TEAB) in polvere.
   NOTA: il valore di pH della soluzione deve essere compreso tra 7 e 9 e assicurarsi che non venga aggiunta alcuna ammina primaria nella soluzione.
2. Aggiungere alla soluzione 4 -L del 4% di formaldeide, mescolare brevemente.
   AVVISO: i vapori di formaldeide sono tossici; eseguire gli esperimenti in una cappa di fumi.
3. Aggiungere alla soluzione 4 ,ll di 0,6 M NaBH₃CN, scuotere il tubo a 400 giri/m per 1 h a temperatura ambiente.
4. Spegnire la reazione di etichettatura aggiungendo 16 -L di 1% soluzione di ammoniaca, incubare a temperatura ambiente per 5 min.
5. Aggiungere 8 OL di acido formico per acidificare la soluzione ed eseguire il dissalamento utilizzando la colonna SPE in fase inversa, come descritto al punto 1.4.

3. Riduzione della nitrotyrosina alla aminotirosina

1. Ricostituire il dimetilo etichettato nitro-Angiotensin II in 500 -L di PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4).
2. Aggiungere alla soluzione 10 -L L di 1 M di dithionate e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo la reazione di riduzione, il colore giallo della soluzione diventa chiaro.
   NOTA: Pesare 174,1 mg di dithionate e scioglierlo in acqua per rendere il volume finale è 1 mL. Questa soluzione può essere conservata a -20 gradi centigradi non più di una settimana.
3. Utilizzare la colonna SPE in fase inversa per il dealanding come descritto nel passaggio 1.4.

4. Biotinylazione, arricchimento e rilevamento

1. Ricostituire l'ammiteniglia dimetila imbalsamata II in 500 -L di PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4).
2. Aggiungere alla soluzione 5 - LL di 40 nM NHS-S-S-biotin, disciolto nel DMSO, alla soluzione, dopo 2 h di incubazione a temperatura ambiente, utilizzare 1 L del 5% di idrossilamina per placare la reazione.
3. Nel frattempo, equilibrate streptavidin agarose beleaggiungendo aggiungendo 500 lll di PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4), centrifugando a 580 x g per 5 min a temperatura ambiente e scartando il supernatante. Eseguire l'equilibrato 3 volte.
4. Aggiungere 100 streptavidin agarose al sistema di reazione, incubare 1 h su uno shaker rotativo a temperatura ambiente. Lavare 4 volte con PBS (10 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7.4). Per ogni passo di lavaggio, aggiungere 500 lofdi di PBS alle perline, mescolare bene, quindi centrifugare a 580 x g per 5 min a temperatura ambiente e scartare il supernatante.
5. Utilizzare 400 luna di 10 mM dithiothreitol (DTT) per incubare con perline di agarose a 50 s per 45 min, girare verso il basso a 580 x g per 5 min a temperatura ambiente e le perline, aggiungere 20 scartate di 0,5 M idoacetamide (IAM) al supernatante per 20 min.
   NOTA: DTT viene utilizzato per rompere il legame disulfide tra il legame tra biotina e peptide, quest'ultimo viene rilasciato da perline e ulteriormente alchilato da IAM.
6. Utilizzare la colonna SPE in fase inversa per il dissalamento mostrato nel passaggio 1.4.
7. Dopo aver risolto i peptidi secchi in un'ondata di acido formica dello 0,1% dello 0,1% (FA), sottoporre il prodotto di ciascuna sezione alla cromatografia liquida con analisi di spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).
   1. Separare i peptidi Ang II modificati con un'eluizione di gradiente di 60 min (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) ad una velocità di flusso 0,300 è direttamente interfacciato con lo spettrometro di massa ad alta risoluzione.
      NOTA: La colonna analitica è in 75 ID, 150 mm di lunghezza, imballata con resina C-18. La fase mobile A consisteva dello 0,1% dell'acido formica e la fase mobile B era costituita da acetonitrile 100% e 0,1% di acido formica.
   2. Azionare lo spettrometro di massa in modalità di acquisizione dipendente dai dati, impostare un singolo spettro di massa full-scan (300-1800 m/z, 60 000 risoluzione) seguito da 20 scansioni MS/MS dipendenti dai dati al 28% di energia di collisione normalizzata.
   3. Aprire i dati degli spettri di massa e identificare i picchi del prodotto in ogni fase per confermare che la reazione chimica è stata eseguita con successo.

5. Quantificazione del nitropeptide

1. Preparare 3 serie di soluzioni nitro-Angiotensin II dal passaggio 1.4, ciascuna delle quali contiene 2 concentrazioni di nitro-angiotensina II: impostare #1, 20 nmol nel tubo A e 20 nmol nel tubo B, ognuna in soluzione TEAB da 100 gradi; Impostare #2, 10 nmol nel tubo C e 20 nmol nel tubo D, ciascuno in 100 soluzione TEAB; Impostare #3, 40 nmol nel tubo E e 10 nmol nel tubo F, ciascuno in una soluzione TEAB da 100.
   Nota: Le due concentrazioni di nitro-angiotensina II in ogni set sono utilizzate per l'etichettatura dimetila, per reagire rispettivamente con formaldeide (luce) e formaldeide-D2 (pesante).
2. Per ogni set, aggiungere 4 - L del 4% formaldeide e formaldeide-D2 al campione da etichettare rispettivamente come leggero e pesante. Seguire i passaggi da 2.3 a 2.5 per completare l'etichettatura dimetil.
3. Mescolare i campioni etichettati leggeri e pesanti.
4. Seguire i passaggi da 3.1 a 4.6 per la riduzione, la biotinylazione, l'arricchimento e il rilevamento.

Risultati

Il diagramma di flusso per la profilazione nitropeptide in questo manoscritto è illustrato nella Figura 1. Le figure 2, 3, 4 e 5 mostrano gli spettri di massa di Angiotensin II, nitro-Angiotensin II, rispettivamente di dimetilo con etichetta nitro-angiotensin II e amino angiotensin II con l'etichetta digiosina dimetila II. Il peso molecolare del composto può essere riflesso dai valori m/z del picco mono-isotop...

Discussione

Il protocollo qui descrive l'arricchimento e la profilazione del nitropeptide. Utilizzando Angiotensin II come peptide modello, abbiamo illustrato la procedura illustrata nella Figura 1. Dopo aver ottenuto il nitro-angiotensina II, l'ammina primaria sul peptide dovrebbe essere bloccata per evitare l'ulteriore coniugazione dell'ammina, che è uno dei passi più critici all'interno del protocollo. Nell'attuale protocollo, l'etichettatura dimetila viene utilizzata per bloccare le aree primarie ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB solution	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroxylamine	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
formic acid	Sigma-Aldrich	695076	ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
isoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB column (10 mg)	Waters	186000383
peroxynitrite	Merck-Millipore	516620
sodium cyanoborohydrite	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
sodium dithionate	Sigma-Aldrich	157953	Technical Grade
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo