Visualizzazione di complessi mitogeni endogeni in Situ in cellule beta pancreatiche umane utilizzando la generazione di testdi di ligazione di prossimità

Riepilogo

Questo protocollo delinea un metodo per l'analisi quantitativa della formazione complessa di proteine mitopagia specificamente nelle cellule beta da campioni di isolotto umano primario. Questa tecnica consente quindi l'analisi della mitofagia da materiale biologico limitato, che sono cruciali nei preziosi campioni di cellule beta pancreatiche umane.

Abstract

La mitofagia è un percorso di controllo della qualità mitocondriale essenziale, che è fondamentale per la bioenergetica delle cellule beta delle isoloti pancreatiche per alimentare il rilascio di insulina stimolato dal glucosio. La valutazione della mitofagia è impegnativa e spesso richiede giornalisti genetici o molteplici tecniche complementari non facilmente utilizzate in campioni di tessuto, come le isole pancreatiche primarie umane. Qui dimostriamo un approccio robusto per visualizzare e quantificare la formazione di complessi chiave di mitofagia endogena nelle isole pancreatiche primarie. Utilizzando la tecnica di analisi della legatura di prossimità sensibile per rilevare l'interazione dei regolatori di mitopagia NRDP1 e USP8, siamo in grado di quantificare specificamente la formazione di complessi mitopagia essenziali in situ. Accresciuto questo approccio per contrastare la controtendenza per il fattore di trascrizione PDX1, possiamo quantificare i complessi di mitofagia e i fattori che possono compromettere la mitofagia, in particolare all'interno delle cellule beta. La metodologia che descriviamo supera la necessità di grandi quantità di estratti cellulari necessari per altri studi di interazione proteina-proteina, come l'immunoprecipitazioni (IP) o la spettrometria di massa, ed è ideale per preziosi campioni di isole umane generalmente non disponibili in quantità sufficienti per questi approcci. Inoltre, questa metodologia evita la necessità di tecniche di selezione del flusso per purificare le cellule beta da una popolazione di isolotto eterogeneo per applicazioni di proteine a valle. Perquesto, descriviamo un protocollo prezioso per la visualizzazione della mitofagia altamente compatibile per l'uso in popolazioni cellulari eterogenee e limitate.

Introduzione

Le cellule beta pancreatiche producono l'insulina necessaria per mantenere l'omeostasi normale del glucosio e il loro fallimento si traduce nello sviluppo di tutte le forme di diabete. Le cellule beta mantengono una robusta capacità mitocondriale per generare l'energia necessaria per accoppiare il metabolismo del glucosio con rilascio di insulina. Recentemente, è diventato evidente che il mantenimento della massa mitocondriale funzionale è di fondamentale importanza per la funzione ottimale della cella beta^1,2,3. Al fine di sostenere la massa mitocondriale funzionale, le cellule beta si basano su meccanismi di controllo di qualità per rimuovere i mitocondri disfunzionali, danneggiati o i mitocondri di invecchiamento^{4 .} Noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule beta si basano su una forma specializzata di turnover mitocondriale, chiamata autofagia mitocondriale (o mitopagia), per mantenere il controllo della qualità mitocondriale sia nei roditori che nelle isole umane^{1, 2,5}. Purtroppo, tuttavia, non esisteva un metodo semplice per rilevare la mitofagia, o componenti mitoplasmasi endogenamente espressi, nelle cellule beta pancreatiche umane.

Recentemente abbiamo dimostrato che la regolazione a monte della mitofagia nelle cellule beta si basa sulla formazione di un complesso proteico che comprende i legamenti E3 CLEC16A e NRDP1 e la deubiquitinasi USP8¹. NRDP1 e USP8 hanno dimostrato indipendentemente di influenzare la mitopfagia attraverso l'azione sull'initiatore di mitopfagia chiave PARKIN^6,7. NRDP1 si rivolge a PARKIN per l'ubiquitinazione e la degradazione per spegnere la mitofagia⁶e USP8 deubiquitinates specificamente PARKIN K6-linked per promuovere la sua traslocazione a mitocondri⁷. La tecnologia di analisi della legatura di prossimità (PLA) èstata un recente progresso nel campo della biologia dell'interazione delle proteine 8, consentendo la visualizzazione di interazioni endogene di proteine in situ in singole cellule e non è limitata da scarsi materiali campione. Questa metodologia è particolarmente allettante per la biologia delle cellule umane-beta, a causa della disponibilità del campione, unita alla necessità di comprendere i complessi proteici fisiologicamente rilevanti all'interno di tipi di cellule eterogenee.

Utilizzando l'approccio PLA, siamo in grado di osservare i principali complessi mitogeni endogeni nelle cellule beta pancreatiche umane primarie e nelle linee cellulari neuronali, e dimostrare gli effetti di un ambiente diabegenico sul percorso mitopfagia¹. In sintesi, l'obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare specifici complessi proteici mitopagia in tessuti privi di materiale abbondante, o dove non sono possibili studi convenzionali di interazione proteica.

Protocollo

L'uso di isole pancreatiche umane de-identificate del donatore avviene tramite un'esenzione dell'IRB (Institutional Review Board) e in conformità con la politica IRB dell'Università del Michigan. Le isole pancreatiche umane sono state fornite dal programma integrato di distribuzione dell'isola (IIDP) sponsorizzato da NIH/NIDDK.

1. Preparazione del campione di isleta umana

1. Dissociazione a cella singola
   1. Campioni di isolotto umano di coltura (4000-6000 equivalenti di isolotto/10 mL di supporti) per almeno 1 giorno a 37 gradi centigradi in supporti di isolotto pancreatico (PIM(S)) integrati con 1 mM di glutammina (PIM(G)), 100 unità/mL antimicotico-antibiotico, 1 mM di piratosa di sodio e 10 % bovina fetale siero (FBS) o siero UMANO AB.
   2. Utilizzare un microscopio luminoso di dissezione a un ingrandimento 3x per contare le singole isole umane dalla coltura. Prelevare 40 isolotti per trattamento/condizione di interesse (come la glucolipotossicità) in tubi da 1,5 mL nel supporto dell'isolotto.
   3. Le isole Centrifuga a 400 x g per 1 min a 10 gradi centigradi.
   4. I campioni di lavaggio, mediante breve inversione dei tubi a temperatura ambiente, due volte con 1 mL di salina tampolatata per fosfati (PBS) contenente 50 PR619 (un inibitore della deubiquitinasi; per preservare le interazioni tra proteine dipendenti dall'ubiquitina, con centrifugazione tra ogni lavaggio a 400 x g per 1 min a 10 gradi centigradi.
   5. Dissociate le isole in singole cellule con 125 gradi di ritegno dello 0,25% contenente 50 :M PR619 incubando la trypsin preriscaldata (37 gradi centigradi) per 3 min con pellet di isolotto. Disperdere delicatamente le isse durante questo periodo con una pipetta delicata periodica utilizzando una pipetta da 200 l.
   6. Quenpsin con un supporto PIM riscaldato da 1 mL (37 gradi centigradi) contenente 50 -M PR619, quindi sedimentare le cellule centrifundo a 400 x g per 1 min.
   7. Lavare le cellule per centrifugazione a 400 x g per 1 min, due volte, con PBS - 50 - M PR619.
   8. Infine, risospendere le celle in PBS 150 .
2. Aderenza e fissazione di una singola cellula
   1. Dopo la sospensione, far girare la soluzione cellulare su vetrini smerigliati, carichi, al microscopio utilizzando una citocentrifuga a 28 x g per 10 min.
   2. Dopo la citocentrifuga, delineare l'area cellulare con una penna idrofobica (vedere la Tabella dei materiali) per ridurre al minimo i volumi di soluzione anticorpo/PLA necessari. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide in PBS per 15 min a temperatura ambiente.
      AVVISO: il PFA è pericoloso e deve essere maneggiato con cura.
   3. Per ottenere i migliori risultati, eseguire la colorazione/PLA immediatamente, o entro 24 h. Se necessario, conservare i campioni in PBS a 4 gradi centigradi fino a ottenere una colorazione non superiore a 48 h.

2. Immunoistochimica

1. Blocco
   1. Lavare le cellule due volte con 1x PBS per 5 min a temperatura ambiente.
   2. Soluzione a celle a blocchi, per eliminare la colorazione dello sfondo, con il siero del 10% dell'asino in PBS contenente il detersivo dello 0,3% (si veda la tabella deimateriali) per 1 h a temperatura ambiente.
2. Colorazione
   1. Cellule incubate con anticorpi di topo primario o coniglio contro USP8 (1:250) e NRDP1 (1:250) rispettivamente (vedi Tabella dei materiali) diluite nel fosfato tampinato con detersivo (PBT, vedi Table of Materials),a 4 rilevare la segnalazione complessa di mitofagia tramite PLA.
   2. Co-incubare le cellule con un marcatore specifico per l'identificazione delle cellule beta che non è stato sollevato nel mouse o nel coniglio in modo da non interferire con il segnale PLA. In questo caso incubare cellule con PDX1 anti-capra (1:500) in PBT. Incubare tutti gli anticorpi primari durante la notte a 4 gradi centigradi, utilizzando pellicola di plastica sopra la soluzione per prevenire l'evaporazione.

3. Saggio di legatura di prossimità

1. Sonda e contromacchia PLA
   1. Preparare la soluzione di sonda PLA secondo le istruzioni del produttore, vale a dire, fare 20 l di soluzione sonda per campione, preparando una concentrazione finale di soluzione 1:5 sia anti-topo che anti-coniglio in PBT, e incubazione per 20 min a room temperatura.
   2. Dopo l'incubazione notturna, lavare le cellule due volte con 1x PBS per 5 min ciascuno, su un rocker.
   3. Poco prima dell'incubazione con la soluzione di sonda, aggiungere Cy5 anti-gola secondario ad una concentrazione finale di 1:600 alla soluzione sonda (per il rilevamento di PDX1 endogeno). Aggiungere la soluzione a sonda 20 per ogni condizione della cella, coprire delicatamente con pellicola di plastica e incubare a 37 gradi centigradi per 1 h.
2. Legatura
   1. Lavare le cellule due volte, a temperatura ambiente, con buffer A (vedere la Tabella dei Materiali per la ricetta) per 5 min ciascuno, su un rocker.
   2. Preparare la soluzione di legatura (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Per questo, diluire lo stock di legatura (5x) 1:5 in acqua trattata decontemporanea (DEPC) dietile. Immediatamente prima dell'incubazione aggiungere 0,025 U/mL ligase. Aggiungere una soluzione di legatura da 20 l alle cellule. Coprire con pellicola di plastica e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
3. Amplificazione
   1. Lavare le cellule due volte a temperatura ambiente con buffer A per 2 min ciascuno.
   2. Fare la soluzione di amplificazione (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Diluire il buffer di amplificazione (5x) 1:5 in acqua trattata con DEPC e tenere al buio fino all'uso. Aggiungere una diluizione 1:80 di polimerasi (parte dei reagenti di rilevamento, vedere Tabella dei materiali) alla soluzione immediatamente prima di aggiungere la soluzione alle cellule.
   3. Aggiungere 20 - soluzione di amplificazione alle cellule. Coprire con pellicola di plastica e mettere al buio a 37 gradi centigradi per un valore compreso tra 1 h 40 min e 2 h per il segnale massimo.
4. Preparazione per l'imaging
   1. Lavare le cellule due volte con buffer B (vedere la Tabella dei Materiali per ricetta) per 10 min a temperatura ambiente, su un rocker.
   2. Infine, lavare le cellule una volta in 0.01x Buffer B, per 2 min a temperatura ambiente su un rocker.
   3. Montare i campioni aggiungendo una goccia di supporti di montaggio contenenti 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e posizionando con attenzione una coverslip sopra i campioni utilizzando una lama del bisturi per premere eventuali bolle formate. Sigillare le labbra con smalto chiaro intorno ai bordi.
   4. Esempi di immagini su un microscopio in grado di catturare più piani focali, come un microscopio confocale a scansione laser o un microscopio a fluorescenza invertita con capacità di deconvoluzione, prendendo almeno 9 diverse immagini del piano focale.
      1. Acquisire immagini con un ingrandimento di 100 volte, con un'altezza dello z-stack di circa 0,45 mm. Catturare Il PLA a 550 nm eccitazione, 570 nm emissioni; contro la macchia a 650 nm eccitazione, 670 nm emissione; e DAPI a 405 nm eccitazione, 450 nm emissioni.
   5. Per garantire che i segnali di sfondo dell'immagine a fluorescenza e la luce vagante siano ridotti al minimo per l'analisi a valle degli eventi PLA (in particolare sui microscopi widefield), le immagini di processo utilizzando un algoritmo di deconvoluzione bidimensionale (vicino più vicino) software di elaborazione delle immagini standard prescelto.
      NOTA: Per l'uso di Olympus CellSens, Nikon utilizza NIS-Elements, Leica utilizzare LAS X, zeiss – .eiss – EN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, così come diversi plugin disponibili attraverso Image-J. Per l'analisi, il numero totale di interazioni su tutti gli z-stack deve essere analizzato utilizzando il software Image-J, assicurando che vengano analizzate solo le celle positive Pdx-1 (sezione 3.5).
5. Quantificazione delle interazioni con PLA
   1. Aprire l'applicazione software gratuita Image-J e aprire l'immagine PLA. Iniziare dalla prima immagine PLA nitidamente messa a fuoco.
   2. Fare clic sulla scheda immagine e selezionare Regola, quindi soglia (Figura 1A). Regolare la soglia per rimuovere tutti i segnali PLA non specifici, prendere nota della regolazione della soglia e cercare di mantenerla coerente durante l'analisi.
   3. Fare clic sulla scheda processo e selezionare binary, quindi rendere binario (Figura 1B). Utilizzare l'immagine binaria per misurare le particelle, facendo clic sulla scheda "Analizza" e premendo Analizza particelle (Figura 1C).
   4. Per l'analisi, assicurarsi che le impostazioni siano le seguenti: Dimensione : 0-Infinito, Circolarità 0–1,0, Mostra , Contorni, caselle di controllo per Visualizza risultatie Cancella risultati (Figura 1D). Fare clic su OK. Prendere nota del numero di particelle analizzate in un foglio di calcolo che denota il campione e della posizione della pila z.
   5. Ripetere i passaggi da 3.5.2–3.5.4 fino a quando non sono stati analizzati tutti gli stack z a fuoco per il campione. Sommare il numero totale di particelle per il campione nel foglio di calcolo per quantificare il numero totale di interazioni.

Risultati

Abbiamo condotto esperimenti iniziali nella linea di cellule beta pancreatiche MIN6 e nella linea di cellule del neuroblastoma SH-YY5Y SH-YY5Y, per ottimizzare e confermare sia la specificità degli anticorpi che le interazioni proteiche visualizzate. Le cellule MIN6 sono state placcate su coverlips a 30.000 celle / mL e lasciate aderire per 48 h, le cellule SH-SY5Y sono state placcate su coverlips a 15.000 celle / mL e lasciate aderire per 24 h. Il protocollo PLA è stato poi seguito com...

Discussione

Qui descriviamo un approccio semplice ed efficiente per utilizzare NRDP1:USP8 PLA in tessuti/cellule di interesse per quantificare la formazione di complessi mitopagia a monte. In precedenza abbiamo confermato la formazione del complesso mitopagy CLEC16A-NRDP1-USP8 nelle cellule beta pancreatiche da diverse metodologie, tra cui esperimenti di co-immunoprecipitazioni, studi di interazione senza cellule e in vitro e analisi dell'ubiquitinazione, e ha dimostrato come questo complesso aziona regolato flusso mitofagico

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA 1X	Life Technologies	25200-056
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Block solution	Homemade		Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.
Buffer A	Homemade		To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use
Buffer B	Homemade		To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat	Jackson Labs	705-175-147
Detection Reagents Red	Sigma- Aldrich	DU092008-100RXN	Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS	Sigma- Aldrich	DU092004-100RXN
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS	Sigma- Aldrich	DU092002-100RXN
Fetal bovine serum
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)	Santa Cruz	SC-14664	RRID: AB_2162373
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MIN6 pancreatic cell line	Gift from D. Stoffers		Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)	Sigma- Aldrich	SAB200527
Pap-pen	Research Products International	195505
Parafilm			Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.
PBT (phosphate buffered saline with triton)	Homemade		To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)
Penicillin-Streptomycin (100X)	Life Technologies	15140-122
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher Scientific	BP399-20
PIM(ABS) Human AB serum	Prodo Labs	PIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)	Prodo Labs	PIM-G001GMP
PIM(S) media	Prodo Labs	PIM-S001GMP
PR619	Apex Bio	A812
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Life Technologies (Molecular Probes)	P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)	Bethyl Laboratories	A300-049A	RRID: AB_2181251
SH-SY5Y cells	Gift from L. Satin		Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.
Sodium Pyruvate (100X)	Life Technologies	11360-070
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Water for RNA work (DEPC water)	Fisher Scientific	BP361-1L