Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente

Riepilogo

Nuove tecniche di sgombero dei tessuti immunostaining come l'ultima imaging 3D di organi autorizzati dai solventi consentono la visualizzazione 3D dell'infezione cerebrale da virus del virus della rabbia e del suo complesso ambiente cellulare. Le fette spesse di tessuto cerebrale etichettate con anticorpi sono rese otticamente trasparenti per aumentare la profondità di imaging e consentire l'analisi 3D mediante microscopia a scansione laser confocale.

Abstract

La visualizzazione dei processi di infezione nei tessuti e negli organi mediante immunoetichettatura è un metodo chiave nella moderna biologia delle infezioni. La capacità di osservare e studiare la distribuzione, il tropismo e l'abbondanza di agenti patogeni all'interno dei tessuti degli organi fornisce dati cardine sullo sviluppo e la progressione della malattia. Utilizzando metodi di microscopia convenzionali, l'immunoetichettatura è per lo più limitata a sezioni sottili ottenute da campioni conbloccati o congelati con paraffina. Tuttavia, il piano di immagine 2D limitato di queste sezioni sottili può portare alla perdita di informazioni cruciali sulla struttura complessa di un organo infetto e sul contesto cellulare dell'infezione. Le moderne tecniche di compensazione dei tessuti multicolore e immunostaining ora forniscono un modo relativamente veloce ed economico per studiare pile di immagini 3D ad alto volume di tessuto di organi infettati da virus. Esponendo il tessuto a solventi organici, diventa otticamente trasparente. Corrisponde agli indici di rifrazione del campione e alla fine porta a una significativa riduzione della diffusione della luce. Pertanto, in combinazione con obiettivi di lunga distanza di lavoro liberi, grandi sezioni di tessuto fino a 1 mm di dimensioni possono essere immagini dalla microscopia a scansione laser confocale convenzionale (CLSM) ad alta risoluzione. Qui, descriviamo un protocollo per applicare l'imaging dei tessuti profondi dopo la compensazione dei tessuti per visualizzare la distribuzione del virus della rabbia nei cervelli infetti al fine di studiare argomenti come la patogenesi del virus, la diffusione, il tropismo e la neuroinvasione.

Introduzione

Le tecniche istologiche convenzionali si basano principalmente su sezioni sottili di tessuti di organi, che possono fornire intrinsecamente solo approfondimenti 2D in un ambiente 3D complesso. Anche se fattibile in linea di principio, la ricostruzione 3D da sezioni sottili seriali richiede tubazioni tecniche impegnative sia per il taglio che per il successivo allineamento in silico delle immagini acquisite¹. Inoltre, la ricostruzione senza soluzione di continuità dei volumi z dopo il taglio dei microtomi è fondamentale in quanto gli artefatti meccanici e computazionali possono rimanere a causa della registrazione dell'immagine non ottimale causata da piani di immagine non sovrapposti, variazioni di colorazione e distruzione del tessuto, ad esempio, dalla lama del microtoma. Al contrario, la suddivisione ottica pura di campioni di tessuto spesso intatti consente l'acquisizione di piani di immagine sovrapposti (sovracampionamento) e, quindi, facilita la ricostruzione 3D. Questo, a sua volta, è altamente vantaggioso per l'analisi dei processi di infezione in popolazioni cellulari complesse (ad esempio, reti neuronali nel contesto delle cellule leali e immunitarie circostanti). Tuttavia, gli ostacoli intrinseci delle sezioni dei tessuti spessi includono la dispersione della luce e la limitata penetrazione degli anticorpi nel tessuto. Negli ultimi anni, una varietà di tecniche è stata sviluppata e ottimizzata per superare questi problemi^2,3,^4,5,^{6,7,8 , 9} (in vie ^{, 10} del sistema ^{, 11 Del} sistema di ^{, 12} mila ^{, 13}. In sostanza, i tessuti bersaglio vengono trasformatiotticamente trasparenti mediante trattamento con ^,8,9 o organicsolvente-based^10,11,12,13 soluzioni. L'introduzione di 3DISCO (3D imaging di organi con cancellazione del solvente)^11,12 e il suo successore uDISCO (ultima imaging 3D di organi autorizzati solventi)¹³ ha fornito uno strumento relativamente veloce, semplice e poco costoso con eccellenti capacità di compensazione. I principali costituenti del protocollo di compensazione sono i solventi organici tert-butanol (TBA), l'alcol benzyl (BA), il benzyl benzoato (BB) e l'etere difenile (DPE). Lo sviluppo e l'aggiunta di iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs)¹⁴, un protocollo di immunostaining compatibile, ha costituito un altro vantaggio rispetto ai metodi esistenti e ha permesso l'etichettatura dei tessuti profondi degli antigeni di interesse, nonché l'immagazzinamento a lungo termine di campioni immunostainsi. Pertanto, la combinazione di iDISCO¹⁴ e uDISCO¹³ consente l'imaging ad alta risoluzione di proteine con etichetta tura anticorpo in grandi sezioni di tessuto (fino a 1 mm) utilizzando CLSM convenzionale.

La conservazione della struttura complessa di un organo in tutte e tre le dimensioni è particolarmente importante per il tessuto cerebrale. I neuroni costituiscono una sottopopolazione cellulare molto eterogenea con morfologie 3D altamente diverse in base alle loro proiezioni neurite (riviste da Masland^15). Inoltre, il cervello è costituito da un certo numero di compartimenti e sottocomparti, ciascuno composto da diverse sottopopolazioni cellulari e rapporti di essi, tra cui cellule gliali e neuroni (rivisto da von Bartheld et al.¹⁶). Come virus neurotropico, il virus della rabbia (RABV, recensito da Fooks et al.¹⁷) infetta principalmente i neuroni, utilizzando i loro macchinari di trasporto per viaggiare in retrogrado lungo gli assoni dal sito primario di infezione al sistema nervoso centrale (CNS). Il protocollo qui descritto (Figura 1A) consente il rilevamento e la visualizzazione assistita dall'immunostaining delle cellule infettate da RABV e RABV in grandi stack di immagini coerenti ottenuti da tessuto cerebrale infetto. Ciò consente una valutazione imparziale e 3D ad alta risoluzione dell'ambiente di infezione. È applicabile al tessuto cerebrale di una varietà di specie, può essere eseguito immediatamente dopo la fissazione o dopo lo stoccaggio a lungo termine di campioni in paraformaldeide (PFA), e consente lo stoccaggio e il reimaging di campioni macchiati e cancellati per mesi.

Protocollo

È stato utilizzato materiale cerebrale archiviato fissato in RABV, fissato pIS. I rispettivi studi sugli studi sugli animali sono stati valutati dal responsabile della cura degli animali, dell'uso e del comitato etico dell'Ufficio statale per l'agricoltura, la sicurezza alimentare e la pesca in Meclemburgo-Pomerania occidentale (LALFF M-V) e hanno ottenuto l'approvazione con autorizzazioni 7221.3-2.1-002/11 (topi) e 7221.3-1-068/16 (furetti). Le cure generali e i metodi utilizzati negli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo le linee guida approvate.

AVVISO: Questo protocollo utilizza varie sostanze tossiche e/o nocive, tra cui PFA, metanolo (MeOH), perossido di idrogeno (H₂O_2),azide di sodio (NaN₃), TBA, BA, BB e DPE. MeOH e TBA sono altamente infiammabili. Evita l'esposizione indossando adeguati dispositivi di protezione personale (un camice da laboratorio, guanti e protezione degli occhi) e conducendo esperimenti in un cofano di fumi. Raccogliere i rifiuti separatamente in contenitori appropriati e smaltirlo secondo le normative locali. Il virus della rabbia è classificato come patogeno a livello di biosicurezza (BSL)-2 e può, pertanto, essere generalmente gestito in condizioni di BSL-2. Alcune attività, tra cui procedure che possono generare aerosol, lavorare con alte concentrazioni di virus, o lavorare con nuovi lyssavirus, possono richiedere classificazione BSL-3. La profilassi pre-esposizione è consigliata per il personale ad alto rischio, compresi i custodi di animali e i lavoratori di laboratorio^18,19. Fare riferimento alle normative degli enti locali.

1. Fissazione del tessuto cerebrale e sezionamento

1. Fissare i campioni cerebrali in un volume appropriato del 4% di PFA nella salina con buffer fosfato (PBS [pH 7.4]) per almeno 48 h a 4 gradi centigradi (con un rapporto tissutale/fissatore approssimativo di 1:10 [v/v]).
2. Lavare i campioni di tessuto 3x in PBS per almeno 30 min ogni lavaggio e conservarli in 0,02% NaN₃/PBS a 4 gradi centigradi fino all'uso.
3. Sezionare il tessuto in sezioni spesse 1 mm utilizzando un vibratome (velocità di alimentazione della lama: 0,3–0,5 mm/s, ampiezza: 1 mm, spessore della fetta: 1.000 m).
4. Per mantenere la corretta sequenza di fette, conservare ogni sezione di tessuto separatamente in un pozzo di una piastra di coltura cellulare multi-bene. Aggiungere lo 0,02% NaN₃/PBS e conservare le sezioni di tessuto a 4 gradi centigradi fino all'uso.

2. Sample pretrattamento con metanolo

NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Il pretrattamento del campione serve allo scopo generale di migliorare la diffusione degli anticorpi e ridurre l'autofluorescenza dei tessuti mediante esposizione a MeOH e H₂O₂, rispettivamente¹⁴.

1. Preparare le soluzioni 20% (v/v), 40%, 60% e 80% MeOH in acqua distillata. Ad esempio, per il 20% Di MeOH, aggiungere 10 mL di 100% MeOH a 40 mL di acqua distillata in un recipiente sigillabile appropriato e mescolare invertendolo.
2. Trasferire i campioni su recipienti di dimensioni ragionevoli (ad esempio, tubi di reazione da 5 mL). Fare attenzione a utilizzare materiali chimicamente resistenti ai reagenti utilizzati in questo protocollo. Per esempio, si noti che mentre il polipropilene è adatto, il polistirolo non lo è.
   NOTA: le specifiche di volume in questo protocollo si riferiscono a tubi di reazione 5 mL. Se si utilizza un recipiente diverso, regolare i volumi di conseguenza.
3. Incubare i campioni in 4 mL di ogni concentrazione della serie preparata di soluzioni MeOH in ordine crescente per 1 h ciascuno.
4. Incubare i campioni 2x per 1 h ciascuno in puro (100%) Meoh.
5. Raffreddare i campioni a 4 gradi centigradi (ad esempio, in un frigorifero sicuro per laboratorio).
6. Preparare la soluzione di sbiancamento (5% H₂O₂ in MeOH), ad esempio, diluendo una soluzione stock 30% H₂O₂ a 1:6 in puro (100%) MeOH, e raffreddare a 4 gradi centigradi.
7. Rimuovere il 100% MeOH dai campioni refrigerati e aggiungere 4 mL di soluzione di sbiancamento preschilled (5% H₂O₂ in MeOH). Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
8. Scambiare la soluzione di sbiancamento per 4 mL di 80% MeOH e incubare per 1 h. Continuare utilizzando la serie preparata di soluzioni MeOH in ordine decrescente per 1 h ciascuno fino a quando i campioni sono stati incubati per 1 h in 4 mL di 20% MeOH.
9. Lavare i campioni 1x per 1 h con 4 mL di PBS.

3. Immunostaining

NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Per prevenire la crescita microbica, aggiungere NaN₃ a una concentrazione finale dello 0,02% alle soluzioni di questa sezione. I campioni di tessuto sono ulteriormente permeabilizzati dal trattamento con detergenti non ionici Triton X-100 e Tween 20. Il siero normale viene utilizzato per bloccare il legame dell'anticorpo non specifico. Glicina e eparina vengono aggiunte per ridurre lo sfondo di immunoetichettatura¹⁴.

1. Lavare i campioni 2x per 1 h ciascuno in 4 mL di 0,2% Triton X-100/PBS.
2. Permialita i campioni per 2 giorni a 37 mL con 4 mL di 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M glicina/PBS.
3. Bloccare il legame non specifico degli anticorpi incubando i campioni per 2 giorni a 37 mL in 4 mL dello 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% siero normale/PBS.
   NOTA: Utilizzare il siero normale della stessa specie in cui è stato allevato l'anticorpo secondario per ottenere risultati di blocco ideali.
4. Incubare i campioni in 2 mL di soluzione anticorpale primaria (3% siero normale/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 con eparina] - anticorpi primari/ anticorpi) per 5 giorni a 37 . Aggiornare la soluzione anticorpale primaria dopo 2,5 giorni.
   1. Per PTwH, ricostituire il sale di sodio di eparina in acqua distillata per realizzare una soluzione di riserva da 10 mg/mL (memorizzare questa soluzione, aliquotata, a 4 gradi centigradi). Aggiungete la soluzione di stock allo 0,2% Tween 20/PBS ad una concentrazione finale di 10 g/mL.
      NOTA: la scelta della corretta diluizione dell'anticorpo può richiedere l'ottimizzazione. In generale, le concentrazioni standard di immunoistochimica sono un buon punto di partenza.
5. Lavare i campioni per 1 giorno in 4 mL di PTwH, scambiando il tampone di lavaggio almeno 4x-5x durante il corso della giornata e lasciando il lavaggio finale durante la notte.
6. Incubare i campioni in 2 mL di soluzione anticorpale secondaria (3% siero normale/PTwH - anticorpi secondari/anticorpi) per 5 giorni a 37 . Aggiornare la soluzione anticorpale secondaria dopo 2,5 giorni.
   1. Diluire gli anticorpi secondari/anticorpi a 1:500 nella soluzione anticorpale secondaria (cioè 4 ll in 2 mL).
7. Lavare i campioni per 1 giorno come descritto al punto 3.5, lasciando il lavaggio finale acceso durante la notte.

4. Colorazione nucleare

NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. Se non è necessaria alcuna colorazione nucleare o se per l'eccitazione o la rilevazione di un altro fluoroforo è necessaria alcuna colorazione nucleare o lo spettro di lunghezza d'onda/emissione di eccitazione di TO-PRO-3, saltare questo passaggio.

1. Diluire la macchia acida nucleica TO-PRO-3 a 1:1,000 in PTwH e incubare i campioni in 4 mL di soluzione di colorazione nucleare per 5 h.
2. Lavare i campioni per 1 giorno come descritto al punto 3.5, lasciando il lavaggio finale acceso durante la notte.
   NOTA: Dopo aver lavato i suoi oligogliani, i campioni possono essere conservati in PBS a 4 gradi centigradi fino alla compensazione ottica.

5. Sgombera dei tessuti

NOTA: Eseguire tutti i passaggi di incubazione con oscillazione delicata e, se non indicato altrimenti, a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce. I campioni di tessuto sono disidratati in una serie graduata di soluzioni TBA. Poiché l'immunostaining richiede soluzioni acquose, tutte le procedure di colorazione devono essere completate prima della compensazione dei tessuti. La distanza ottica e l'abbinamento dell'indice refrattivo si ottengono mediante trattamento con una miscela di BA, BB e DPE. La soluzione di compensazione è integrata con DL-z-tocopherol come antiossidante¹³.

1. Preparare le soluzioni TBA 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% e 96% e 96% in acqua distillata. Ad esempio, per il 30% di TBA, aggiungere 15 mL di 100% TBA a 35 mL di acqua distillata in un recipiente sigillabile appropriato e mescolare invertendo.
   NOTA: TBA ha un punto di fusione di 25-26 gradi centigradi; quindi, tende ad essere solido a temperatura ambiente. Al fine di preparare le soluzioni TBA, scaldare la bottiglia ben sigillata a 37 gradi centigradi in un'incubatrice o in un bagno d'acqua.
2. Disidratare i campioni con 4 mL di ogni concentrazione della serie preparata di soluzioni TBA in ordine crescente per 2 h ciascuno. Lasciare il 96% TBA acceso durante la notte.
3. Disidratare ulteriormente i campioni in puro (100%) TBA per 2 h.
4. Preparare la soluzione di compensazione BABB-D15.
   NOTA: BABB-D15 è una combinazione di BA e BB (BABB) che viene mescolata con DPE ad un rapporto di x:1, dove x è specificato nel nome della soluzione, in questo caso 15.
   1. Per BABB, mescolare una parte BA con due parti BB.
   2. Mescolare BABB e DPE ad un rapporto di 15:1.
   3. Aggiungere 0,4 vol% DL-tocopherol (vitamina E).
      NOTA: Ad esempio, per 20 mL di BABB-D15, mescolare 6,25 mL di BA con 12,5 mL di BB. Aggiungere 1,25 mL di DPE e integrarlo con 0,08 mL di DL-z-tocopherol.
5. Cancellare i campioni nella soluzione di compensazione fino a quando non sono otticamente trasparenti (2-6 h).
6. I campioni possono essere conservati a 4 gradi centigradi in BABB-D15, protetti dalla luce, fino al montaggio e all'imaging.

6. Montaggio del campione

1. Utilizzando una stampante 3D, stampare la camera di imaging e il coperchio (materiale: copolyester [CPE], ugello: 0,25 mm, altezza strato: 0,06 mm, spessore della parete: 0,88 mm, conteggio parete: 4, riempimento: 100%, nessuna struttura di supporto; la corrispondente . STL si trova nei Materiali supplementari di questo protocollo).
2. Assemblare la camera di imaging (Figura 2).
   1. Montare una vetritta rotonda (diametro: 30 mm) sulla camera di imaging con RTV-1 (un componente della temperatura-temperatura) gomma in silicone. Rimuovere la gomma in silicone in eccesso con un tampone di cotone bagnato dall'acqua e curare durante la notte.
   2. Montare una vestra rotonda (diametro: 22 mm) sul coperchio con gomma siliconica RTV-1. Rimuovere la gomma in silicone in eccesso con un tampone di cotone bagnato dall'acqua e curare durante la notte.
3. Mettere il campione in una camera di imaging, aggiungere un piccolo volume di BABB-D15 e inserire il coperchio. Riempire la camera con BABB-D15 attraverso l'inseridio, utilizzando un ago ipodermico (27 G x 3/4 di pollice [0,40 mm x 20 mm]).
4. Collegare l'inseridie e sigillare la camera di imaging con gomma in silicone RTV-1. Cura durante la notte al buio.

7. Imaging ed elaborazione delle immagini

1. Impostare l'acquisizione dell'immagine selezionando le rispettive linee laser in modo che corrispondano ai fluorofori utilizzati. Regolare gli intervalli di rilevamento di ciascun rivelatore per evitare la sovrapposizione del segnale tra i canali.
   NOTA: gli intervalli di rilevamento esemplari per Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 e TO-PRO-3 sono rispettivamente 500-550 nm, 590-620 nm e 645-700 nm.
2. Scegliere i parametri di acquisizione, definire il bordo superiore e inferiore dello z-stack e acquisire la pila di immagini.
   NOTA: I parametri di acquisizione esemplari sono una scansione sequenziale con una dimensione in pixel di 60-90 nm, una dimensione z-step di 0,5 m, una media di linea di 1, una velocità di scansione di 400 Hz e una dimensione di foro stenopeico di 1 unità Airy.
3. Elaborare la pila di immagini utilizzando un software di analisi delle immagini appropriato (ad esempio, Fiji) per generare proiezioni 3D o eseguire analisi approfondite.
   NOTA: a causa delle grandi dimensioni dei file di immagine acquisiti, l'uso di una workstation è di solito necessario.
   1. Aprire i file di acquisizione o di immagine in Fiji (File Proprietà Open . Selezionare i file).
      1. Se si utilizza, ad esempio, . LIF, selezionare o deselezionare le opzioni desiderate nella finestra di dialogo Bioformati. Visualizza stack con Hyperstack. A parte questo, non sono necessarie selezioni o zecche specifiche. Premere OK.
      2. Se il file contiene più pile di immagini, selezionare quelle da analizzare e confermare premendo OK.
   2. Eseguire la correzione della candeggina suddividendo l'immagine unita in singoli canali (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Dividi canali). Per ogni canale, selezionare la correzione della candeggina (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Correzione sbiancamento) e scegliere Rapporto semplice (intensità di sfondo: 0.0).
      NOTA: In alcuni casi, ad esempio, quando non c'è decadimento lineare del segnale o il segnale è troppo debole nel complesso, Simple Ratio potrebbe fallire. In alternativa, prova Exponential Fit o salta la correzione della candeggina.
   3. Regolare la luminosità e il contrasto per ciascun canale utilizzando i cursori (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Proprietà Brightness . Contrasto).
   4. Unire i canali (Immagine Proprietà Color (Colore) Unisci canali), crea un composito (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Crea composito) e convertirlo in formato RGB (Immagine Proprietà Color (Colore) Strumento Canali, quindi selezionare Altro Converti in RGB).
   5. Se necessario, ridimensionare la pila di immagini per ridurre il tempo di calcolo e le dimensioni del file (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Dimensione, entrambe le opzioni selezionate più interpolazione bilineare).
   6. Generazione di una proiezione 3D (Immagine Proprietà Stacks . Progetto 3D). Scegliete Punto più luminoso come metodo di proiezione e impostate la spaziatura della sezione in modo che corrisponda alla dimensione del passo z della pila di immagini acquisita. Per la massima qualità, impostate l'incremento dell'angolo di rotazione su 1 e attivate l'interpolazione. Modificare la rotazione totale, le soglie di trasparenza e l'opacità in base alle esigenze.
   7. Se necessario, regolare il contrasto e la luminosità convertendo di nuovo la proiezione 3D in formato a 8 bit (Immagine Proprietà Type (Tipo) 8 bit). Utilizzare i rispettivi cursori (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Proprietà Brightness . Contrasto) e riconvertire la pila di immagini in formato RGB come descritto nel passaggio 7.3.4.
   8. Salvare la proiezione 3D come . TIF (formato file immagine) e . File AVI (formato file video).

Risultati

La combinazione di iDISCO¹⁴ e uDISCO¹³ accoppiato con CLSM ad alta risoluzione fornisce una profonda conoscenza della risoluzione spatiotemporale e della plasticità dell'infezione rabV del tessuto cerebrale e del contesto cellulare circostante.

Utilizzando l'immunostainizzazione della fosfora RABV (P), gli strati complessi di cellule neuronali infette possono essere visualizzati in spesse sezioni di cervelli murini (Figura 3...

Discussione

La rinascita e l'ulteriore sviluppo delle tecniche di sgombero dei tessuti negli ultimi anni^{2,3,4,5,6,7,8, 9} (in vie ^{, 10} del sistema ^{, 11 Del} sistema di ^{, 12...}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Benzyl alcohol	Alfa Aesar	41218	Clearing reagent
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	BB6630-500ML	Clearing reagent
Dimethyl sulfoxide	Carl Roth	4720.2	Various buffers
Diphenyl ether	Sigma-Aldrich	240834-100G	Clearing reagent
DL-α-Tocopherol	Alfa Aesar	A17039	Antioxidant
Donkey serum	Bio-Rad	C06SBZ	Blocking reagent
Glycine	Carl Roth	3908.2	Background reduction
Goat serum	Merck	S26-100ML	Blocking reagent
Heparin sodium salt	Carl Roth	7692.1	Background reduction
Hydrogen peroxide solution (30 %)	Carl Roth	8070.2	Sample bleaching
Methanol	Carl Roth	4627.4	Sample pretreatment
Paraformaldehyde	Carl Roth	0335.3	Crystalline powder to make fixative solution
Sodium azide	Carl Roth	K305.1	Prevention of microbial growth in stock solutions
tert-Butanol	Alfa Aesar	33278	Sample dehydration for tissue clearing
TO-PRO-3	Thermo Fisher	T3605	Nucleic acid stain
Triton X-100	Carl Roth	3051.2	Detergent
Tween 20	AppliChem	A4974,0500	Detergent
Miscellaneous
5 mL reaction tubes	Eppendorf	0030119401	Sample tubes
Coverslip, circular (diameter: 22 mm)	Marienfeld	0111620	Part of imaging chamber
Coverslip, circular (diameter: 30 mm)	Marienfeld	0111700	Part of imaging chamber
Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm])	B. Braun	4657705	Filling of the imaging chamber with clearing solution
RTV-1 silicone rubber	Wacker	Elastosil E43	Adhesive for the assembly of the imaging chamber
Ultimaker CPE 2.85 mm transparent	Ultimaker	8718836374869	Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber
Technical equipment and software
3D printer	Ultimaker	Ultimaker 2+	Printing of imaging chamber
Automated water immersion system	Leica	15640019	Software-controlled water pump
Benchtop orbital shaker	Elmi	DOS-20M	Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm)
Benchtop orbital shaker, heated	New Brunswick Scientific	G24 Environmental Shaker	Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm)
Confocal laser scanning microscope	Leica	DMI 6000 TCS SP5	Inverted confocal microscope for sample imaging
Fiji	NIH (ImageJ)	open source software (v1.52h)	Image processing package based on ImageJ
Long working distance water immersion objective	Leica	15506360	HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2
Vibratome	Leica	VT1200S	Sample slicing
Workstation	Dell	Precision 7920	CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB
Primary antibodies
Goat anti-RABV N	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400
Rabbit anti-GFAP	Dako	Z0334	Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100
Rabbit anti-MAP2	Abcam	ab32454	Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250
Rabbit anti-RABV P 160-5	Friedrich-Loeffler-Institut		Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000
Secondary antibodies
Donkey anti-goat IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Donkey anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	depending on conjugated fluorophore	Highly cross-absorbed Dilution: 1:500