Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di genottare l'anemone di mare Nematostella vectensis durante la gastrulation senza sacrificare l'embrione.

Abstract

Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare l'embrione dello stadio gastrula del cnidariano anthozoano Nematostella vectensis senza sacrificare la vita dell'animale. Dopo la fecondazione in vitro e la de-jellying, gli zigoti sono autorizzati a svilupparsi per 24 h a temperatura ambiente per raggiungere la fase iniziale-medio gastrula. Gli embrioni di gastrula vengono poi posti su un letto di gel di agarose in un piatto Petri contenente acqua di mare. Al microscopio dissezioso, un ago di tungsteno viene utilizzato per separare chirurgicamente un frammento di tessuto aborale da ogni embrione. Gli embrioni post-chirurgia sono poi autorizzati a guarire e continuare lo sviluppo. Il DNA genomico viene estratto dal frammento di tessuto isolato e utilizzato come modello per la PCR specifica per il locus. Il genotipo può essere determinato in base alle dimensioni dei prodotti PCR o alla presenza/assenza di prodotti PCR specifici per alleli. Gli embrioni post-chirurgia vengono poi ordinati in base al genotipo. La durata dell'intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h. Questo metodo può essere utilizzato per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni e consente l'analisi dei fenotipi durante lo sviluppo.

Introduzione

I cnidariani rappresentano un gruppo eterogeneo di animali che includono meduse, coralli e anemoni di mare. Sono diploblasti, composti da ectodermi ed endodermi separati da una matrice extracellulare (mesoglea). Cnidaria è un gruppo gemello per speciosiare Bilateria, a cui i modelli animali tradizionali come Drosophila e Mus appartengono¹. Inoltre, si pensa che la divergenza di Cnidaria-Bilateria si sia verificata nel periodo pre-Cambriano². Come tale, gli studi comparativi di cnidariani e bilateriani sono essenziali per ottenere informazioni sulla biologia del loro antenato comune più recente. Recentemente, la genomica comparativa ha rivelato che i cnidariani e i bilateriani condividono molti geni del toolkit di sviluppo come tacca e bHLH, il che implica che il loro antenato comune aveva già questi geni³. Tuttavia, il ruolo di questi geni del toolkit di sviluppo nell'ultimo antenato comune di Cnidaria e Bilateria è comparabilmente meno ben compreso. Per affrontare questo problema, è fondamentale studiare come funzionano questi geni profondamente conservati nei cnidariani.

Uno dei modelli genetici cnidariani emergenti è l'antozoo Nematostella vectensis. Il suo genoma è stato sequenziato³, e una varietà di strumenti genetici, tra cui il knockdown genico mediato da morfolino, la transgenesi mediata da meganucle e le knockine e knockout genici mediati da CRISPR-Cas9, sono ora disponibili per l'uso in questo animale. Inoltre, lo sviluppo di Nematostella è relativamente ben compreso. Durante l'embriogenesi, la gastrazione si verifica per invaginazione⁴e l'embrione si sviluppa in una larva di planula che nuota liberamente. La planula successivamente si trasforma in un polipo sessile con bocca e tentacoli circumorali. Il polipo poi cresce e raggiunge la maturità sessuale.

La mutagenesi mirata mediata da CRISPR-Cas9 è ora abitualmente utilizzata per studiare la funzione genica nella vectensis 5 di Nematostella^5,6,7,8,9. Per generare mutanti knockout a Nematostella, un cocktail contenente RNA a guida singola specifici di locus e la proteina Cas9 endonuclease viene iniettato per la prima volta in uova non fecondate o fecondate per produrre animali fondatori F0 che in genere mostrano Mosaicism. Gli animali F0 vengono successivamente allevati alla maturità sessuale e incrociati tra loro per produrre una popolazione di F1, un sottoinsieme dei quali può essere mutanti ad eliminazione diretta⁶. In alternativa, gli animali F0 sessualmente maturi possono essere incrociati con animali di tipo selvatico per generare animali eterozigoti F1, e gli eterozigoti F1 che portano un allele da urlo nel locus di interesse possono quindi essere incrociati tra loro per produrre F2 prole, un quarto di cui dovrebbero essere mutanti ad eliminazione diretta⁵. Entrambi gli approcci richiedono un metodo per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea. I tentacoli polipici possono essere utilizzati per estrarre il DNA genomico per la genotipizzazione^6,7. Tuttavia, nei casi in cui si sta studiando la funzione dello sviluppo del gene di interesse e gli embrioni mutanti non raggiungono lo stadio polipo (cioè a causa della letalità larvale associata alla mutazione), i mutanti knockout devono essere identificati precocemente nell'ontogenesi. Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare singoli animali allo stadio gastrula senza sacrificare l'animale, che consente l'identificazione di mutanti knockout da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni. La durata dell'intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h.

Protocollo

1. Induzione della deposizione delle uova, fecondazione in vitro e deduzione

1. Mantenere la veturi di Nematostella nell'acqua di mare con una salinità di 12 parti per mille (ppt) al buio a 16 gradi centigradi, alimentando Artemia ogni giorno.
2. Il giorno prima dell'induzione della deposizione delle uova, posizionare gli animali in un'incubatrice a temperatura e a luce. Programmare l'incubatrice in modo che gli animali siano esposti a 8 h di luce a 25 gradi centigradi. Facoltativo: alimentare un piccolo pezzo (<1 mm³) di ostrica ai singoli animali prima di inserirli nell'incubatrice per migliorare la deposizione delle uova.
3. Lasciare gli animali nell'incubatrice per 1 h a 16 gradi centigradi.
4. Togliere gli animali dall'incubatrice e lasciarli su una panchina con luce a temperatura ambiente (RT) per consentire la deposizione delle uova. La riproduzione di solito si verifica entro il prossimo 1,5–2 h.
5. Se i maschi e le femmine si trovano in contenitori separati, inserire i pacchetti di uova dal contenitore femminile in un contenitore maschio contenente spermatozoi utilizzando una pipetta di trasferimento la cui punta viene tagliata per ingrandire l'apertura in modo che le uova non siano danneggiate da stress meccanico durante trasferire. Lasciare che le uova siano fecondate lasciandole nel contenitore maschile per almeno 15 min.
6. De-jelly i pacchetti di uova in acqua di mare contenenti 3% cisteina (pH 7.4) su un piatto Petri o in un tubo da 15 mL. Agitare delicatamente su uno shaker per 12 min.
7. Utilizzare una pipetta di plastica per rompere i grumi e continuare ad agitare per altri 2-3 minuti fino a quando completamente de-jellied.
8. Rimuovere la cisteina sostituendo il supporto con acqua di mare fresca per almeno 5x.
9. Conservare le uova fecondate su un piatto di Petri di vetro a 16 gradi centigradi o RT.

2. Rimozione chirurgica di un tessuto aborale da un embrione di gastrula

1. Preparare un buffer di estrazione del DNA composto da 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 e 1 mg/mL di proteina K. Utilizzare 20 mL del buffer di estrazione per embrione. Mescolare bene vorticee e il tampone in tubi PCR.
2. Sciogliere l'1% di agarose nell'acqua di mare e versarla in un piatto Petri per coprire il fondo. Raffreddare su un banco per fare un letto gel. Versare acqua di mare fresca per coprire il letto di gel nel piatto Petri.
3. Trasferire nella piastra Petri embrioni da 24 h post-fecondazione (hpf) (stadio da inizio gastrula) contenente un letto di gel di agarose.
4. Inserire un ago di tungsteno in un portaa ago e sterilizzare immergendo la punta dell'ago nell'alcool (70% o superiore) e mettendolo in fiamme per bruciare l'alcol.
5. Sotto un microscopio dissezioso (a magnifiche da 20x a 40x), utilizzare l'ago di tungsteno per fare una depressione sul letto di agarose rimuovendo un pezzo di superficie agarose circa le dimensioni di un embrione da manipolare, e posizionare l'embrione sulla depressione con la sua laterale verso il basso per limitare il movimento dell'embrione per la microchirurgia.
6. Utilizzare l'ago del tungsteno per eccitare chirurgicamente un pezzo di tessuto aborale situato di fronte all'apertura blastoporale orale. Di solito è sufficiente un aboral aboral a un quarto del tessuto embrionale lungo l'asse orale-aborale.
7. Utilizzare una pipetta P20 per trasferire il tessuto aborare isolato (in <2 mL) in un tubo PCR contenente 20 mL di buffer di estrazione del DNA.
8. Trasferire l'embrione post-chirurgia in un pozzo contenente almeno 500 mL di acqua dolce in una piastra di 24 o 96 pozze.
9. Ripetere i passaggi da 2,4 a 2,8 per il numero di embrioni in base alle esigenze.
10. Posizionare la piastra del pozzo contenente gli embrioni post-chirurgia in un'incubatrice a 16 gradi centigradi o RT fino al completamento della genotipizzazione.

3. Estrazione del DNA genomico e genotipizzazione PCR

1. Far girare brevemente i tubi PCR contenenti il buffer di estrazione del DNA e i tessuti embrionali isolati utilizzando una mini centrifuga (ad esempio a 2.680 x g per 10 s).
2. Per estrarre il DNA genomico da singoli embrioni, incubare i tubi PCR a 55 gradi centigradi per 3 h. Vortex per 30 s ogni 30 min per garantire la rottura dei grumi cellulari e migliorare la lisi cellulare.
3. Incubare i tubi PCR a 95 gradi centigradi per 5 minuti per inattivare la proteinasi K.
4. Conservare gli estratti di gDNA a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio e procedere immediatamente alla PCR.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui inserendo estratti gDNA in un congelatore -20 .
5. Impostare una reazione PCR utilizzando gDNA estratto come modello per amplificare il locus genomico di interesse.
   1. Se diversi alleli al luogo di interesse differiscono in termini di dimensioni in modo che la differenza di dimensioni possa essere rilevata dall'elettroforesi gel agarose, progettare un unico set di primer per amplificare l'intero locus.
   2. In alternativa, utilizzare primer specifici per alleli che generano prodotti PCR solo in presenza dell'allele specifico; ad esempio, progettando l'incarico che si lega a una regione contenente mutazioni di inserimento/eliminazione.
   3. Utilizzare un tipico mix di reazione PCR da 20 mL come segue: 5 mL di estratti di gDNA, 8 mL di acqua senza nucleato, 4 mL di buffer PCR, 0,2 mL di 10mM dNTP, 0,6 mL di DMSO, 1 mL di 10 mM di primer in avanti di 10 mM, 1 mL di 10 mM in avanti , e 0,2 mL di polimerasi del DNA (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: in una reazione PCR è possibile utilizzare più primer. Ad esempio, è possibile combinare un primer in avanti universale e due primer invertiti specifici per gli alleli, a condizione che i due primer invertiti siano progettati per generare prodotti PCR di dimensioni distinte in modo che la presenza/assenza dei due alleli possa essere inequivocabilmente determinata dall'elettroforesi gel (vedi sezione dei risultati rappresentativi).
6. Eseguire l'elettroforesi gel di agarose per determinare le dimensioni e la presenza/assenza di prodotti PCR. Regolare la condizione dell'elettroforesi del gel di agarose (ad esempio, percentuale di gel di agarose, V/cm e durata) a seconda delle dimensioni previste dei prodotti PCR.
7. Utilizzare i risultati della PCR per quanto riguarda le dimensioni e la presenza/assenza di prodotti PCR per assegnare un genotipo a ogni embrione post-chirurgico. Ad esempio, se si prevede che diversi alleli generino prodotti PCR di dimensioni diverse, utilizzare le informazioni sulle dimensioni per assegnare il genotipo per ogni embrione. Se si utilizzano primer specifici dell'allele, i dati sulla presenza/assenza di prodotti PCR devono essere utilizzati per assegnare un genotipo a ciascun embrione.
8. Ordinare gli embrioni in base al genotipo.

Risultati

Il genoma di Nematostella ha un singolo locus che codifica una proteina precursore per il neuropeptide GLWamide. Tre alleli mutanti knockout in questo locus (glw^-a, glw^-be glw^-c) sono stati precedentemente segnalati⁵. Quattro maschi eterozigoli che trasportavano un allele di tipo selvaggio ( ) e l'allele da urlo glw^-cal locus GLWamide (genotipo: / glw^-c) sono stati i...

Discussione

Descritto qui un protocollo basato su PCR per genotipare un singolo embrione di anemone di mare senza sacrificare l'animale. Dopo la deposizione delle uova e la de-jellying, le uova fecondate sono autorizzate a svilupparsi in gastrulae. La regione aborale di ogni embrione di gastrula viene rimossa chirurgicamente e il tessuto aborale isolato viene utilizzato per la successiva estrazione genomica del DNA, mentre i restanti embrioni post-chirurgia guariscono e continuano lo sviluppo. Gli estratti di gDNA vengono quindi uti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’