Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Riepilogo

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Abstract

Vi presentiamo un approccio citometrico a flusso per analizzare il ROS mitocondriale in varie popolazioni di cellule staminali e progenitrici derivate da mandorone vivo (BM) da topi sani e topi con AML guidati da MLL-AF9. In particolare, descriviamo un processo di colorazione delle cellule in due fasi, in base al quale le cellule BM sane o leucemia vengono prima macchiate con un colorante fluorogenico che rileva i superossidi mitocondriali, seguito dalla colorazione con anticorpi monoclonali fluoromemici che vengono utilizzati per distinguere varie popolazioni di progenitori ematopoietici sani e maligni. Forniamo anche una strategia per l'acquisizione e l'analisi dei campioni per citometria di flusso. L'intero protocollo può essere eseguito in un lasso di tempo Mettiamo inoltre in evidenza le variabili chiave da considerare, nonché i vantaggi e i limiti del monitoraggio della produzione ROS nel compartimento mitocondriale delle sottopopolazioni di stelo e leucemia e progenie vive utilizzando coloranti fluogenici per citometria di flusso . Inoltre, presentiamo dati che l'abbondanza mitocondriale ROS varia tra distinti sottopopolazioni HSPC sani e progenitori di leucemia e discutiamo le possibili applicazioni di questa tecnica nella ricerca ematologica.

Introduzione

Le specie REattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole altamente reattive derivate dall'ossigeno molecolare. La posizione cellulare più ben definita della produzione di ROS è il mitocondria, dove gli elettroni che passano attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC) durante il fosforoostoslazione ossidativa (OXPHOS) vengono assorbiti dall'ossigeno molecolare che porta alla formazione di uno specifico tipo di ROS chiamato superoossidi¹. Attraverso le azioni di una serie di enzimi, chiamati disinmutasi di superossido o SOD, i superolisi vengono convertiti in perossidi di idrogeno, che vengono successivamente neutralizzati in acqua da enzimi come catalasi o perossioni glutathione (GPX). Le perturbazioni nei meccanismi di regolazione del ROS possono portare all'eccesso di produzione di ROS, spesso indicato come stress ossidativo, che hanno conseguenze cellulari dannose e potenzialmente letali come il danno da macromolecola (cioè DNA, proteine, lipidi). Inoltre, lo stress ossidativo è legato a diverse patologie, come il diabete, le malattie infiammatorie, l'invecchiamento e i tumori^2,3,4. Per mantenere l'omeostasi redox e prevenire lo stress ossidativo, le cellule possiedono una varietà di meccanismi di regolazione ROS⁵.

I livelli fisiologici di alcuni ROS sono necessari per una corretta ematopoiesi embrionale e adulta⁶. Tuttavia, l'eccesso di ROS è associato al danno al DNA, alla differenziazione cellulare e all'esaurimento dello stelo ematopoietico e del pool progenitore. Ci sono anche prove che le alterazioni nella biologia redox possono differire tra leucemia e cellule sane. Ad esempio, i livelli di ROS tendono ad essere più elevati nelle cellule acute di leucemia mieloide (AML) rispetto alle loro controparti sane e altri studi hanno suggerito che le cellule staminali della leucemia mantengono un basso livello costante di ROS per la sopravvivenza^7,8. È importante sottolineare che le strategie per capitalizzare terapeuticamente queste differenze redox hanno mostrato promessa in diverse impostazioni di cancro umano^9,10. Pertanto, i saggi che consentono la valutazione dei livelli di ROS nei modelli murini possono migliorare la nostra comprensione di come queste specie contribuiscono alla fisiologia cellulare e alla patogenesi della malattia, nonché potenzialmente fornire una piattaforma per valutare l'efficacia nuove terapie anti-cancro di mira redox.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali descritte in questo protocollo sono state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) del Fox Chase Cancer Center.

NOT: Il flusso di lavoro del protocollo è suddiviso in 4 parti, come illustrato nella Figura 1 e i reagenti necessari sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Isolamento del midollo osseo (BM)

NOT: I topi di leucemia MLL-AF9 sono stati generati come descritto in precedenza¹¹.

1. Recuperare le cellule del midollo osseo mononucleare, come descritto in precedenza^12,13,14^,15, da topi di tipo selvaggio C57.Bl6 (che esprimono il marcatore congenico CD45.2) e da C57. Topi Bl6-SJL (che esprimono il marcatore congenico CD45.1) che sono stati trapiantati con cellule leucemiche mLL-AF9 (CD45.2⁾.
   NOT: BM può essere recuperato dai topi schiacciando^12,13 o lavando le ossa^14,15. Per gli esperimenti presentati qui, BM è stata recuperata da topi sani e leucemia attraverso il lavaggio.

2. Ros mitocondriale Colorazione colorante fluorogenico

1. Una volta che le cellule del midollo osseo mononucleari sono state recuperate da topi sani e/o leucemici, macchiare un'aliquota di cellule con Trypan Blue e contare utilizzando un emocitometro per determinare il numero iniziale di cellule BM totali.
2. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min. Aspirate il supernatante e risospendere il pellet in F-PBS (PBS integrato con 2% siero bovino fetale e un 1% Penicillin/ Streptomycin cocktail) ad una concentrazione di 2 x 10⁶ cellule / mL.
3. Aliquota 200 -L di sospensione cellulare per tubo in 9 tubi di controllo monocolore etichettati come segue:
   Nessuna macchia, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (solo per HSPC sani), CD45.2-APC (solo per le cellule leucemiche), CD34-FITC, Mitochondrial ROS dye e Live/dead cell colorin.
   NOT: (Facoltativo) Un controllo positivo per l'induzione del ROS mitocondriale può essere preparato trattando 2 x 10⁵ cellule in 200 -L con 20 M di Menadione Sodium Bisulfite (MSB) per 1 h a 37 s In un 5% di incubatore di CO_2. Un secondo controllo per invertire l'induzione mediata da MSB di ROS mitocondriale può essere preparato trattando 2 x 10⁵ cellule in 200 -L con 20 M di MSB più 100 M N-acetyl-L-cysteine (NAC) per 1 h a 37 gradi centigradi in un incubatore di CO₂ 5%.
4. Aliquota le cellule rimanenti in un tubo (tubo sperimentale) e centrifuga a 300 x g per 5 min.
5. Risospendere le celle in F-PBS con una macchia di cellule vive / morte secondo le istruzioni del produttore. Incubare sul ghiaccio per 30 min. Assicurarsi di aggiungere una macchia viva /morta al tubo di controllo monocolore.
6. Aggiungere 1,0 mL di temperatura ambiente (RT) F-PBS sia ai tubi monocolore che a quelli sperimentali macchiati con la tintura viva/morta. Centrifuga 5 min a 300 x g a RT.
7. Risospendere 50 g di tintura ROS mitocondriale in 13 - L di solforo dimetile (DMSO) per ottenere una soluzione di stock 5 mM.
8. Dilute mitocondrial ros colora ad una concentrazione finale di 5 M in RT F-PBS con o senza Verapamil (50 M).
9. Aspirate fuori il lavaggio della macchia cella morta / morta. Aggiungere 200 l di colorante mitocondriale ROS che contenga Verapamil ad ogni tubo sperimentale, nonché il tubo di controllo mitocondriale ROS colorante monocolore.
10. Vortice per mescolare e incubare per 10 min a 37 gradi centigradi al buio.
11. Aggiungere 1,0 mL di RT F-PBS al controllo mitocondriale a colore singolo e ai tubi sperimentali. Centrifuga 5 min a 300 x g a RT.
12. Aspirare il supernatante e lavare le cellule con un ulteriore 1.0 mL di RT F-PBS. Centrifuga 5 min a 300 x g a RT.

3. Colorazione anticorpo di lignaggio

1. Preparare i cocktail anticorpali elencati nella tabella 1.
   NOT: Questi cocktail anticorpi sono stati ottimizzati in precedenza^14,15,16.
2. Aspirare il supervolontario dal lavaggio del ROS mitocondriale finale dei tubi sperimentali contenenti BM sani e aggiungere 200 l di cocktail anticorpale #1 ad ogni tubo. Vortice da mescolare. Preparare anche i tubi di controllo monocolore. Incubare per 60 min sul ghiaccio al buio.
3. Aspirare il supernatante dal lavaggio del ROS mitocondriale finale dei tubi sperimentali contenenti leucemia BM e aggiungere 200 -L del cocktail anticorpo #2 ad ogni tubo. Vortice da mescolare. Incubare per 60 min sul ghiaccio al buio.
4. Lavare con 1,0 mL di F-PBS freddo e centrifugare 5 min a 300 x g a RT.
5. Risospendere le cellule in 500 - L di F-PBS freddo e filtrare le cellule in un tubo citometro di flusso utilizzando un filtro di 40 m per escludere gli aggregati.

4. Acquisizione e analisi della citometria di flusso

NOT: Diversi sottoinsiemi di gambo ematopoietico e progenitore sono rari, come le cellule staminali ematopoietiche a lungo termine. Pertanto, idealmente dovrebbero essere raccolti 3-5 milioni di eventi per ogni tubo sperimentale durante l'acquisizione della citometria di flusso per un'analisi sufficiente del ROS mitocondriale nei vari sottoinsiemi HSPC.

1. Utilizzare il tubo di controllo no-colorin per impostare i grafici a dispersione in avanti (FSC-A) e laterali (SSC-A) in base alle dimensioni e alla complessità della popolazione cellulare analizzata.
2. Utilizzare i tubi di controllo senza macchie e a colore singolo per compensare il citometro di flusso.
3. Cancello i detriti estranei dal grafico a dispersione in avanti e laterale(Figura 2A, B, primo pannello da sinistra).
4. Cancello doppietti utilizzando un doppio discriminatore come il discriminatore forward(Figura 2A,B, secondo pannello da sinistra).
5. Seguire la strategia di gating proposta nella Figura 2A,B per selezionare le cellule vive, le cellule basse di lignaggio e i vari sottoinsiemi HSPC e leucemia.
6. Per ogni popolazione di interesse, analizzare l'intensità mediana di fluorescenza (MFI) del canale TRPE (asse x) in un grafico istogramma per valutare le differenze nel segnale ROS mitocondriale (Figura 3A-C, pannelli a sinistra). I livelli di ROS mitocondriale possono essere valutati a livello di singola cellula confrontando la colorazione ROS mitocondriale con marcatori di lignaggio specifici in un grafico a dispersione.

Risultati

Presentato è un metodo per analizzare ROS nei mitocondri di più popolazioni progenie leucemia sane e MLL-AF9-esprimente. Figura 1 viene visualizzata una visualizzazione schematica del flusso di lavoro protocollo, che consiste di 4 passaggi principali: 1) isolamento BM dai mouse; 2) colorare le cellule BM con un colorante fluorogenico che riconosce ROS mitocondriale, in particolare superossidi; 3) Colorazione anticorpo marcatore di superficie per delineare varie popolazioni sane e leucemia ...

Discussione

I coloranti fluorogenici che sono stati sviluppati per la rilevazione di ROS sono spesso valutati in cellule fisse mediante microscopia o in cellule vive per citometria di flusso²². La valutazione citometrica del flusso del ROS mitocondriale nelle cellule BM che utilizza nodi fluorogeniche MItocondriali ROS ha due vantaggi principali: 1) Si tratta di una tecnica semplice e veloce adatta per l'analisi delle cellule vive e 2) consente di distinguere e analizzare raro a livello di singola cellula nel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye