Uso di un sistema video-eEG wireless per monitorare le scariche epilettifore a seguito di lesioni cerebrali traumatiche indotte da liquido-percussioni laterali

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per indurre grave TBI con il modello di lesione a percussione fluida laterale (FPI) in adulti, ratti Wistar maschi. Dimostriamo anche l'uso di un sistema di telemetria wireless per raccogliere registrazioni video-EEG continue e monitorare le scariche epilettifori coerenti con l'epileptogenesi post-traumatica.

Abstract

Il modello di lesione a percussione fluida laterale (FPI) è ben consolidato ed è stato utilizzato per studiare la TBI e l'epilessia post-traumatica (PTE). Tuttavia, è stata segnalata una notevole variabilità per i parametri specifici utilizzati nei diversi studi che hanno utilizzato questo modello, rendendo difficile l'armonizzazione e l'interpretazione dei risultati tra i laboratori. Ad esempio, è stata segnalata la variabilità per quanto riguarda le dimensioni e la posizione della craniectomia, come il mozzo di blocco Luer è posizionato rispetto alla craniectomia, la pressione atmosferica applicata alla dura e la durata dell'impulso di pressione. Ognuno di questi parametri può influire sulla gravità delle lesioni, che è direttamente correlata all'incidenza della PTE. Questo si è manifestato come un'ampia gamma di tassi di mortalità, tempi di riflesso correttivi e incidenza di convulsioni convulsive segnalate. Qui forniamo un protocollo dettagliato per il metodo che abbiamo usato per facilitare l'armonizzazione tra gli studi. Abbiamo usato l'FPI in combinazione con un sistema di telemetria EEG wireless per monitorare continuamente le modifiche elettrografiche e rilevare l'attività delle crisi epilettiche.  L'IPF viene indotta creando una craniectomia di 5 mm sull'emisfero sinistro, tra il Bregma e la Lambda e adiacente alla cresta laterale. Un mozzo di chiusura Luer è fissato sul cranio sopra la craniectomia. Questo hub è collegato al dispositivo FPI e un impulso di pressione di 20 millisecondi viene consegnato direttamente alla dura intatta attraverso tubi a pressione collegati all'hub tramite un connettore di blocco di torsione. Dopo il recupero, i ratti vengono nuovamente anestesizzati per rimuovere l'hub. Cinque viti elettrodo EEG in acciaio inossidabile da 0,5 mm sono poste a contatto con la dura attraverso il cranio e fungono da quattro elettrodi di registrazione e un elettrodo di riferimento. I fili dell'elettrodo vengono raccolti in un connettore a piedistallo che viene fissato in posizione con cemento osseo. Le registrazioni video/EEG continue vengono raccolte per un massimo di 4 settimane dopo il TBI.

Introduzione

In un rapporto del 2015 al Congresso, i Centers for Disease Control hanno riferito che circa 2,5 milioni di persone all'anno subiscono lesioni cerebrali traumatiche (TBI) negli Stati Uniti¹. Si stima che la TBI provochi il 20% delle epilessie sintomatiche e il 5% di tutte le epilessie^2,3,4. Inoltre, circa il 20% dei pazienti affetti da TBI sviluppa l'epilessia post-traumatica⁵. È importante sottolineare che le crisi epilettiche croniche e ricorrenti che si verificano a seguito della TBI sono spesso farmacoresistenti, aumentando il peso della malattia⁶. I meccanismi esatti che portano all'epilessia post-traumatica (PTE) rimangono poco chiari. Tuttavia, diversi studi epidemiologici chiave hanno esaminato l'incidenza e il rischio potenziale di sviluppare epilessia post-traumatica (PTE)^{2,4,7,8,9 ,10,11}. Questi studi di epidemiologia hanno rafforzato la correlazione della gravità delle lesioni con il rischio di epileptogenesi.

Gli attuali metodi che sono stati ampiamente utilizzati per identificare nuove terapie anti-epilessia si sono affidati molto a modelli che utilizzano chemio-convulsio o acceleratura elettrica per indurre epilessia¹². Data l'elevata incidenza di farmaci farmaco-resistenza ai farmaci sviluppati in questi modelli dai pazienti affetti da TBI, ipotizziamo che le crisi epilettiche indotte da TBI possano essere diverse dalle crisi chemioconvulsivi o indotte da accesi e possono comportare percorsi o processi diversi di epilettica. Pertanto, un modello TBI può essere più adatto per lo sviluppo di trattamenti che sono più efficaci per prevenire l'epileptogenesi post-traumatica.

Il modello di lesione a percussione fluida (FPI) di TBI è stato utilizzato per decenni ed è un metodo consolidato per indagare sia TBI che PTE^{13,14,15,16,17, 18.}Tuttavia, come abbiamo recentemente esaminato, vi è un alto grado di variabilità nei metodi dell'IPF segnalati nei laboratori^19,20. Questa mancanza di coerenza tra i laboratori impedisce la riproducibilità dei risultati preclinici e rende l'interpretazione dei risultati una sfida. Di conseguenza, sono stati applicati maggiori interessi e sforzi per stabilire una maggiore armonizzazione per questi tipi di studi^21,22,23,24.

Nel tentativo di aumentare ulteriormente la consistenza e l'armonizzazione tra laboratori focalizzati sullo studio dell'epileptogenesi post-traumatica, forniamo qui una metodologia dettagliata del nostro approccio. Abbiamo già segnalato un 60% di incidenza di convulsioni convulsive entro sei settimane dopo grave TBI²⁰. Ora usiamo questo approccio per monitorare i ratti che iniziano il giorno della lesione e li seguiamo continuamente 24 ore al giorno per un massimo di 4 settimane. Abbiamo scelto di utilizzare un sistema di telemetria wireless che offre diversi vantaggi. In primo luogo, i ratti sono in grado di muoversi liberamente sulla loro gabbia, e quindi riduce lo stress. In secondo luogo una riduzione del rumore del segnale come il ratto serve come il terreno. Inoltre, il nostro sistema attuale utilizza un accelerometro che rileva un rapido movimento in tutti e tre i piani (X, Y e z) e può essere utile per identificare eventi di convulsione convulsiva. Infine, il sistema di telemetria wireless consente una gestione più semplice dei ratti come iniezioni saline supplementari, pesatura e condurre punteggi di gravità neurologica, che è complicato quando i ratti sono attaccati a un tether. Tuttavia, questo approccio presenta anche diverse limitazioni. In primo luogo, il costo iniziale di un sistema per registrare da un massimo di otto ratti contemporaneamente può essere nell'intervallo di 60.000 dollari. In secondo luogo, l'alimentazione è limitata da una fonte di batteria. Ciò richiede il monitoraggio e la sostituzione giornaliera delle batterie. Il tempo necessario tra i cambi della batteria può essere influenzato dalla frequenza di campionamento. Tuttavia, per una frequenza di campionamento di 1000 Hz, le batterie vengono in genere modificate una volta alla settimana. L'alimentatore limitato limita inoltre il sistema alla registrazione di soli quattro segnali EEG. Infine, l'uscita del segnale è limitata, ma occasionalmente si verifica. Tuttavia, questo approccio fornisce un metodo coerente e affidabile per monitorare l'epileptogenesi post-traumatica e può aiutare nell'identificazione di nuovi trattamenti terapeutici.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate e hanno seguito le linee guida del comitato dell'Università di Buffalo Institutional Animal Care and Use.

1. Lesione fluida delle percussioni

1. Indossare un camice da laboratorio o un abito chirurgico, una maschera chirurgica, guanti chirurgici e copricapo e sterilizzare tutti gli strumenti e i materiali che contattano il sito chirurgico.
2. Anestesizzare un ratto Wistar di 10-12 settimane con 350-400 g con 3% di isoflurane e 1 L/min di ossigeno in una camera di induzione di dimensioni appropriate per i ratti. Rimuovere il ratto dalla camera di induzione e spostarlo nell'area di preparazione una volta che è incosciente. Mettere l'unguento oftalmico sterile in entrambi gli occhi.
3. Rasare i capelli sulla testa del ratto con clipper elettrici con una lama #40 da appena sopra gli occhi alla base caudale delle orecchie per produrre abbastanza campo chirurgico. Rimuovere eventuali capelli sciolti e tagliati dal sito.
4. Pulire il sito chirurgico applicando 2% scrub clorohexidina al cuoio capelluto rasato seguito da 70% etanolo. Iniziare dal centro e spostarsi verso l'esterno in cerchi concentrici lontano dal sito di incisione. Ripetere questo processo 3 volte. Applicare la soluzione Betadine al sito nello stesso modo e lasciato asciugare.
5. Posizionare il ratto anestesizzato nel telaio stereotassico e mantenere l'anestesia al 2-3% isoflurane-1 L/min ossigeno tramite nosecone. Controllare la perdita di reflex di ritiro dell'arto posteriore e la perdita di riflesso palpebrale per assicurarsi che il ratto sia in un piano chirurgico di anestesia.
6. Monitorare la frequenza respiratoria, la frequenza cardiaca, la temperatura corporea e la saturazione di ossigeno durante l'intervento chirurgico. Mantenere la frequenza cardiaca tra 300-400 bpm e SpO₂ superiore al 90%.
   NOTA: Un ossimetro a impulsi attaccato a un piede posteriore può essere utilizzato per fornire la lettura costante della frequenza cardiaca e SpO₂. Una frequenza cardiaca superiore a 400 bpm indica che il ratto non è sufficientemente anetizzato. Una piastra di riscaldamento autoregolante, accoppiata a un termometro rettale, fissata a 37 gradi centigradi, può essere posizionata sotto il ratto durante l'intervento chirurgico per mantenere la temperatura corporea. Uno stereomicroscopio con una fonte di luce in combinazione con una lampada in fibra ottica sono utili per visualizzare la procedura.
7. Utilizzare un ago da 23 g per iniettare 0,5% di cloruro bupivacaine intradermente nel cuoio capelluto nel sito di incisione per analgesia locale 10 - 15 minuti prima di fare un'incisione.
8. Fare un 1,5-2,5 cm incisione media attraverso la pelle e il muscolo del cuoio capelluto utilizzando un #10 lama del bisturi. Ritrarre la pelle e il muscolo per esporre il cranio e fornire un campo chirurgico chiaro. Riflettere la fascia sottostante e il tessuto adiposo lontano dall'osso con tamponi di cotone sterile.
   NOTA: Un'unità di cautery elettrica è utile per ottenere un'emostasi rapida.
9. Rasare lungo la cresta laterale dell'osso parietale sinistro utilizzando una curette chirurgica per produrre una superficie piana liscia in modo che la base del mozzo di chiusura Luer femmina-femmina possa riposare a filo con il cranio.
10. Irrigare la superficie del cranio e i tessuti circostanti con soluzione da 2,0 mg/mL gentamicin in salina sterile. Soluzione in eccesso di blot con tamponi sterili.
11. Applicare il 3% di perossido di idrogeno al cranio per asciugare l'osso.
    NOTA: Se l'osso non è sufficientemente asciutto il cemento dentale non aderisce correttamente e forma una guarizione solida.
12. Creare un sito cranicodia di 5 mm di diametro attraverso l'osso parietale sinistro.
    NOTA: Un bit di trephine inserito in un trapano di potenza collegato al telaio stereotassico può essere utile per avviare la craniectomia. Utilizzare un trapano a mano con una trefra di 5 mm di diametro per completare lentamente la craniectomia attraverso l'osso rimanente. Quando si è vicini a completare la craniectomia, ruotare la trefina in senso inverso per evitare la rottura della dura mater sottostante. Ci sarà un assottigliamento del cranio intorno al perimetro del disco e il lembo del cranio si sentirà sciolto quando viene premuto leggermente.
13. Rimuovere il lembo osseo con la curette chirurgica e le pinze dei tessuti lisci.
    NOTA: Possono verificarsi alcune emorragie, ma l'emostasi può essere raggiunta rapidamente applicando una leggera pressione con tamponi di cotone sterile.
14. Utilizzare uno stereoscopio e l'illuminazione per ispezionare visivamente la dura per eventuali segni di rottura.  Un sottile bordo di osso rimarrà intorno alla circonferenza del sito craniectomia.  Rimuovere delicatamente questo bordo con pinze di tessuto liscio facendo attenzione a non rompere la dura.
15. Sfare il cranio con il 70% di etanolo per rimuovere la polvere ossea e asciugare il cranio.
16. Applicare un sottile strato di colla di gel cianoacrilato intorno al bordo inferiore del mozzo di blocco Luer e fissarlo al cranio sopra la craniectomia senza ostacolare l'apertura. Prestare attenzione a non portare la colla a contatto con la dura. Inoltre, sigillare il blocco Luer in posizione con un ulteriore sottile strato di colla intorno alla base esterna del mozzo.
17. Preparare un liquame di cemento dentale. Applicare il cemento sulla superficie del cranio intorno e sopra la base del mozzo di blocco Luer per fissarlo in posizione.
18. Riempire il mozzo di chiusura Luer con una soluzione di liquido cereberale spinale artificiale (CSF) sterile privo di conservante (CSF) (pH 7.4) utilizzando una siringa e un ago in modo che un bolo convesso di salina possa essere visto sopra la parte superiore del bordo.
    NOTA: La soluzione manterrà la dura umida mentre il cemento dentale si asciuga e serve come indicazione dell'integrità della guarniva. Se il livello della soluzione cade a tutti, che è un'indicazione di una perdita nel sistema e il blocco Luer deve essere rimosso e sostituito.
19. Una volta che il cemento dentale è completamente guarito, interrompere l'anestesia del gas e rimuovere il ratto dal telaio stereotassico.
20. Posizionare il ratto su una piattaforma accanto al dispositivo FPI.
21. Il dispositivo FPI ha una punta di metallo curva che si estende dal trasduttore di pressione alla fine del serbatoio del fluido. Fissare una lunghezza di 12 cm di tubo di pressione all'estremità della punta curva con l'estremità opposta che termina in un connettore di torsione di blocco Luer maschile di 2 cm. Fissare il ratto al dispositivo FPI collegando l'estremità femminile del mozzo sul cranio del ratto al connettore maschile.
    NOTA: Assicurarsi che la connessione sia ben fissata e che tutte le bolle d'aria siano state rimosse dal sistema.
22. Mettere l'animale in recumbency sternale e controllare ripetutamente per il ritorno del riflesso di ritiro. Non appena il ratto riacquista il riflesso di ritiro ma è ancora sedato, rilasciare il pendolo del dispositivo FPI per causare un singolo impulso di pressione di 20 ms e indurre lesioni.
    NOTA: È importante non indurre la lesione mentre l'animale è profondamente anetizzato in quanto questo tende a causare un aumento della mortalità a causa di edema polmonare indotto da neurogenici. Tutti i dispositivi mostrano variabilità. Tuttavia, sul dispositivo utilizzato per questo esperimento, un posizionamento angolare di 17 gradi del martello produce un impulso di pressione atmosferica da 2,2 a 2,3. Gli animali finti e non feriti subiscono tutte le stesse procedure, ad eccezione dell'impulso fluido effettivo per l'induzione della lesione.
23. Scollegare immediatamente il ratto dal dispositivo FPI dopo un infortunio, metterlo in recumbency sternale e fornire ossigeno supplementare (1 L/min) tramite un cono naso fino a quando non ritorna spontanea la respirazione. L'apnea è una conseguenza anticipata della lesione. Se necessario, fornire respiri manuali periodici tramite una maschera valvolare sacchetto fino a quando il ratto inizia a respirare spontaneamente da solo.
    NOTA: In genere, l'apnea dura meno di 2 min. Un rapido aumento transitorio della frequenza cardiaca (>500 bpm) viene osservato immediatamente dopo la somministrazione dell'impulso di pressione a causa della raffica di aecholamina. Questo può essere monitorato con un ossimetro a impulsi attaccato al piede del ratto e può servire come possibile indicatore che si è verificato una grave lesione.
24. Monitorare il topo in modo continuo e registrare il tempo di ritorno del riflesso di raddorqui (amblazione stabile su tutti e quattro gli arti).
25. La grandezza dell'impulso di pressione atmosferica per ogni ratto dovrebbe essere all'interno di 0,05 atmosfere l'una dall'altra. Verificare che ogni impulso di pressione produca un segnale uniforme sull'oscilloscopio con ampiezza e durata coerenti.
    NOTA: Un segnale rumoroso può indicare bolle d'aria nel sistema che devono essere rimosse prima di fornire l'impulso di lesioni. Gli impulsi di pressione atmosferica che producono una lesione grave, in questo esperimento, sono quelli che in genere si traducono in tempi di rinfarazione degli animali di 30-60 min. Questa gamma di tempi di rinconia sono associati a un tasso di mortalità di circa il 40-50%).
26. Amministrare 10 mL di preriscaldato saline sottocutaneo come una cura di supporto.
27. Riportare il ratto nella sua gabbia di casa e lasciarlo recuperare per almeno 4 ore.
    NOTA: L'aumento della mortalità è stato osservato quando i ratti vengono immediatamente rimessi immediatamente sotto anestesia.

2. Impianto di elettrodi EEG corticali e registrazione video-EEG

1. A 4 h dopo la lesione, anestesizzare il ratto come descritto in precedenza e rimetterlo nel telaio stereotassico per rimuovere il mozzo di blocco Luer e cemento dentale.
   NOTA: Il mozzo e il cemento si spezzano facilmente con una pressione moderata. Quando si rimuove il mozzo, controllare attentamente per eventuali rotture o danni alla dura. Eutanasia istantanea di qualsiasi animale con danni alla dura.
2. Applicare una piccola goccia di cloruro bupivacaine dello 0,5% al cranio in ciascuna delle posizioni in cui devono essere praticati 5 fori pilota (vedi Figura 1).
3. Forai perfora il cranio nel cranio con una punta di perforazione portatile da 0,1 mm.
4. Fissare una vite di elettrodo in acciaio inossidabile in ogni foro pilota nelle seguenti posizioni: una vite di riferimento è posto caudale al cervelletto. Gli elettrodi di registrazione sono posizionati: 1) sopra l'ipsilaterale dell'emisfero e rostral alla craniectomia; 2) sopra l'emisfero ipsilaterale e caudale alla craniectomia; 3) sopra l'emisfero contralaterale e rostrale alla craniectomia; 4) sopra l'emisfero contralaterale e caudale alla craniectomia.
5. Scarro il cranio con il 70% di etanolo per rimuovere qualsiasi polvere ossea.
6. Coprire il sito di craniectomia con un sottile strato di cera ossea sterile per coprire la dura esposta.
7. Collegare un array di elettrodi ai 5 elettrodi EEG avvolgendo l'estremità esposta di un filo di elettrodo codificato a colori attorno saldamente alla sua vite di elettrodo in acciaio inossidabile designata.
   NOTA: le estremità opposte di ciascun filo di elettrodo sono posizionate in una posizione specifica e designata all'interno del connettore del piedistallo.
8. Preparare un liquame di cemento osseo.
9. Raccogliere i fili dell'elettrodo in una bobina sotto il piedistallo e fissare i fili e piedistallo in posizione con cemento osseo. Tenere il piedistallo in posizione fino a quando il cemento osseo non è guarito.
   NOTA: L'osso deve essere particolarmente secco e privo di sangue residuo al fine di ottenere una corretta adesione e prevenire la rimozione prematura del trasmettitore.
10. Collegare il trasmettitore wireless con batterie fresche al piedistallo prima di rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.
11. Posizionare l'animale nella sua gabbia di casa e posizionare la gabbia in prossimità del ricevitore e in vista di una videocamera designata. Avviare la registrazione video/EEG.

3. Raccolta di registrazioni video-EEG

1. Prima di raccogliere i segnali EEG, fare una scansione di frequenza della stanza in cui i ratti saranno alloggiati per la raccolta EEG per identificare eventuali frequenze interferenti potenziali per impedire la raccolta di registrazione EEG con qualsiasi frequenza che ha rumore di fondo.
2. Impostare tutti i trasmettitori su frequenze specifiche prive di interferenze.
3. Impostare la frequenza di campionamento e l'intervallo di input di ogni trasmettitore programmabile.
   NOTA: Questo può essere fatto utilizzando uno strumento intelligente fornito dal produttore del sistema. I trasmettitori possono campionare ad una velocità massima di 1000 Hz e un intervallo di ingresso massimo di 10 mV. In questo esperimento sono state analizzate le registrazioni EEG da 0,5 A 30 Hz a 30 Hz. Pertanto, la frequenza di campionamento è stata impostata a 250 Hz. In genere osserviamo ampiezza inferiori a 1 mV. Pertanto, l'intervallo di input impostato era di 2 mV.
4. Utilizzare il software di raccolta EEG fornito dal produttore per registrare continuamente video-EEG a partire dal giorno della lesione collegando ogni trasmettitore wireless tramite una frequenza unica a un ricevitore specifico.
   NOTA: Ogni coppia di ricevitori trasmettitori è in grado di monitorare 4 canali EEG monopolari e l'accelerazione negli aerei X, Y e z. I dati EEG possono essere scritti in un server di archiviazione. I dati video devono essere salvati su un dispositivo NAS collegato al server di archiviazione. Il software di analisi EEG sincronizza la registrazione video ed EEG in base all'ora gestita dal server di archiviazione.
5. Utilizzare il software di raccolta video per registrare video di ogni ratto con la propria fotocamera a risoluzione 2 MP (1920 x 1080) configurata per registrare a 30 fotogrammi/s.
   NOTA: Ogni telecamera ha la propria illuminazione a infrarossi per la raccolta video di notte.
6. Configurare il sistema in modo che salvi automaticamente tutte le registrazioni video ed EEG su un server di archiviazione ogni 24 ore. I video producono file piuttosto grandi.

4. Analisi video/EEG

1. Sincronizzare il video con ogni registrazione EEG con una risoluzione di 1/10. Fare questo utilizzando il software di analisi video/EEG dei produttori di sistema che crea un metafile con il timbro dell'ora esatta sia dell'EEG che del video.
2. Esaminare manualmente le registrazioni EEG per identificare gli eventi dell'indice che definiscono l'attività di convulsione.
3. Utilizzando il software di analisi video/EEG e gli eventi EEG dell'indice, creare un file di configurazione che utilizza parametri chiave (ad esempio, potenza in bande di frequenza specifiche, il rapporto tra le bande di frequenza e la potenza totale, la soglia di accelerazione, ecc.) per definire le caratteristiche potenziali eventi di sequestro.
4. Eseguire il software di analisi EEG per identificare le potenziali aree di registrazione EEG qualificate in base ai parametri selezionati nel file di configurazione.
   NOTA: Il software di analisi EEG consente il rilevamento automatico delle crisi epilettiche e mette in evidenza le regioni di interesse per i segnali EEG e fornisce l'analisi dello spettro di potenza FFT attraverso il segnale.
5. Confermare potenziali convulsioni convulsive utilizzando le registrazioni video raccolte durante l'acquisizione, che vengono sincronizzate con le rispettive registrazioni EEG di ciascun ratto.

Risultati

Con questo modello, abbiamo indotto gravi TBI in ratti Adulti, maschi, Wistar. Nelle condizioni che descriviamo qui, in genere osserviamo tassi di mortalità del 40-50%, e tempi di riflessione correttivi di 30 - 60 min come descritto in precedenza²⁰. Siamo stati in grado di raccogliere registrazioni video / EEG 24 ore al giorno a partire dal giorno dell'infortunio. Un diagramma che mostra la posizione di quattro elettrodi EEG monopolari e un singolo elettrodo di riferimento è mostrato nella Figura 1A. Le immagini che illustrano la posizione e l'aspetto delle lesioni TBI previste con le condizioni descritte di seguito sono illustrate nella Figura 1B-D. Nelle condizioni qui descritte, osserviamo costantemente il rallentamento del delta entro i primi tre giorni successivi alla TBI. I ratti meno gravemente feriti mostrano un rallentamento unilaterale del delta intermittente (figura2C-D). Al contrario, si osserva un continuo rallentamento del delta bilaterale dopo lesioni più gravi (Figura3C-D). Un certo grado di rallentamento del delta è stato costantemente osservato in tutti i ratti TBI, ma non è stato rilevato in alcun ratto di controllo finto operato (solo craniectomia) (Figura2A-B; 3A-B). L'ampio rallentamento del delta è stato costantemente osservato durante i primi tre giorni dopo l'infortunio nella maggior parte dei ratti TBI. È interessante notare che, ratti in genere mostrano pronunciata perdita di peso durante i primi tre giorni dopo l'infortunio. Le crisi non convulsive sono occasionalmente osservate entro la prima settimana successivo alla TBI (Figura 4 C-D). Le convulsioni cliniche, che presentano come gruppi di picco associati all'allevamento e alla caduta, nonché l'avambraccio clonus possono essere osservati dopo 1 settimana dopo il TBI (Figura5C-D). Infine, Figura 6 presenta immagini rappresentative di occasionale interruzione del segnale intermittente e perdita di segnale a causa di un guasto della batteria.

Figura 1 . Posizione della craniectomia, posizionamento degli elettrodi e lesione. (A) mostra un diagramma schematico del cranio del ratto con le posizioni della craniectomia (cerchio grigio nell'emisfero sinistro), quattro elettrodi monopolari (punti neri; 1,2,3,4) situati tra il Bregma e lambda e un elettrodo di riferimento (punto nero, R) posta in linea mediana, posteriore alla lambda; (B) mostra scansioni coronali post-mortem T2 MRI con la posizione della lesione identificata da un cerchio rosso; (C) mostra una mappa 2D della corteccia in cui sono identificate la posizione e le dimensioni della lesione (regione blu). (D) mostra una sezione coronale macchiata Nissl con la scatola di lesione, la lesione è 100x ingrandita in immagine a destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 . Rallentamento unilaterale del delta intermittente raccolto il giorno di un TBI moderato. (A) mostra una traccia eEG di 90 s da un topo di controllo non ferito e conto inverso il giorno dell'intervento. Vengono presentati tutti e quattro i canali. Una traccia lunga 10 s (presa dalla regione boxed) è stata estratta dal terzo canale per visualizzare meglio il modello EEG di base. Una sezione EPOC 2048 ms di questo è stato quindi selezionato per essere analizzato nel FFT corrispondente. (B) Analisi FFT di 2048 ms selezionato EPOC dall'animale maldestro finto operato il giorno dell'intervento chirurgico. (C) mostra una traccia EEG di 90 s, che dimostra il modello intermittente e unilaterale di rallentamento del delta di un animale moderatamente ferito il giorno della lesione. Una traccia lunga 10 s (presa dalla regione boxed) è stata estratta dal terzo canale per visualizzare meglio il modello EEG che rallenta il delta. Una sezione EPOC 2048 ms di questo è stato quindi selezionato per essere analizzato nel FFT corrispondente. (D) L'analisi FFT di 2048 ms ha selezionato l'EPOC dall'animale Moderato TBI il giorno della lesione. 90 s tracce EEG, dall'alto verso il basso sono biopotenziali 1, 2, 3, 3, 4, corrispondenti alle loro posizioni intorno al sito craniectomia come si vede in Figura 1. I segni verticali grigi definiscono intervalli di 1 s sulle tracce EEG. Tutte le tracce EEG sono mostrate su una scala di (500 V).  All'interno dei grafici DI analisi FFT, l'intervallo di frequenza analisi complessivo era di 0,5-30 Hz. Questo è stato ulteriormente suddiviso in 4 bande di frequenza separate di Delta (giallo, 0,5-4 Hz), Theta (Purple, 4-8 Hz), Alpha (rosso, 8-12 Hz) e Beta (verde, 12-30 Hz).  Il grafico % (Power) mostrato nell'analisi FFT indica quale percentuale della potenza totale nell'EPOC analizzata proviene da ogni banda di frequenza specificata in precedenza, consentendo un'ulteriore caratterizzazione matematica dei modelli di forma d'onda EEG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 . Rallentatore delta bilaterale e continuo raccolto il giorno di un grave TBI. (A) mostra una traccia eEG di 90 s da un topo di controllo non ferito e conto inverso il giorno dell'intervento. Vengono presentati tutti e quattro i canali.  Una traccia lunga 10 s (presa dalla regione boxed) è stata estratta dal terzo canale per visualizzare meglio il modello EEG di base. Una sezione EPOC 2048 ms di questo è stato quindi selezionato per essere analizzato nel FFT corrispondente. (B) Analisi FFT di 2048 ms selezionato EPOC dall'animale maldestro finto operato il giorno dell'intervento chirurgico. (C) mostra una traccia EEG di 90 s, che dimostra il modello continuo di rallentamento del delta bilaterale di un animale gravemente ferito il giorno della lesione.  Una traccia lunga 10 s (presa dalla regione boxed) è stata estratta dal terzo canale per visualizzare meglio il modello EEG che rallenta il delta. Una sezione EPOC 2048 ms di questo è stato quindi selezionato per essere analizzato nel FFT corrispondente. (D) L'analisi FFT di 2048 ms ha selezionato l'EPOC dal grave animale TBI il giorno della lesione. 90 s tracce EEG, dall'alto verso il basso sono biopotenziali 1, 2, 3, 3, 4, corrispondenti alle loro posizioni intorno al sito craniectomia come si vede in Figura 1. I segni verticali grigi definiscono intervalli di 1 s sulle tracce EEG. Tutte le tracce EEG sono mostrate su una scala di (500 V).  All'interno dei grafici DI analisi FFT, l'intervallo di frequenza analisi complessivo era di 0,5-30 Hz.  Questo è stato ulteriormente suddiviso in 4 bande di frequenza separate di Delta (giallo, 0,5-4 Hz), Theta (Purple, 4-8 Hz), Alpha (rosso, 8-12 Hz) e Beta (verde, 12-30 Hz). Il grafico % (Power) mostrato nell'analisi FFT indica quale percentuale della potenza totale nell'EPOC analizzata proviene da ogni banda di frequenza specificata in precedenza, consentendo un'ulteriore caratterizzazione matematica dei modelli di forma d'onda EEG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 . Crisi elettrografica non convulsiva raccolta 3 giorni dopo una grave TBI. (A) mostra una traccia eEG di 90 s da un topo di controllo non ferito, operato in finto, 3 giorni^{e 25} dopo l'intervento chirurgico. Vengono presentati tutti e quattro i canali. Una traccia lunga 10 s (presa dalla regione boxed) è stata estratta dal terzo canale per visualizzare meglio il modello EEG di base. Una sezione EPOC 2048 ms di questo è stato quindi selezionato per essere analizzato nel FFT corrispondente. (B) Analisi FFT di 2048 ms selezionato EPOC dall'animale mallavorato finto il giorno tre²⁵ dopo di un intervento chirurgico. (C) mostra una traccia EEG di 90 s tre ²⁵ giorni dopo lesioni gravi.  Questo show building, modello di chiame veloce presente bilateralmente e attraverso tutti e 4 i canali di raccolta.  Una traccia lunga 10 s (presa dalla regione boxed) è stata estratta dal terzo canale per visualizzare meglio il modello EEG appuntito. Una sezione EPOC 2048 ms di questo è stato quindi selezionato per essere analizzato nel FFT corrispondente. (D) L'analisi FFT di 2048 ms ha selezionato l'EPOC dal grave animale TBI il giorno della lesione.  90 s tracce EEG, dall'alto verso il basso sono biopotenziali 1, 2, 3, 3, 4, corrispondenti alle loro posizioni intorno al sito craniectomia come si vede in Figura 1. I segni verticali grigi definiscono intervalli di 1 s sulle tracce EEG. Tutte le tracce EEG sono mostrate su una scala di (500 V).  All'interno dei grafici DI analisi FFT, l'intervallo di frequenza analisi complessivo era di 0,5-30 Hz.  Questo è stato ulteriormente suddiviso in 4 bande di frequenza separate di Delta (giallo, 0,5-4 Hz), Theta (Purple, 4-8 Hz), Alpha (rosso, 8-12 Hz) e Beta (verde, 12-30 Hz).  Il grafico % (Power) mostrato nell'analisi FFT indica quale percentuale della potenza totale nell'EPOC analizzata proviene da ogni banda di frequenza specificata in precedenza, consentendo un'ulteriore caratterizzazione matematica dei modelli di forma d'onda EEG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 . Crisi elettrografica convulsa raccolta 9 giorni dopo la TBI. (A) mostra una traccia di 90 s EEG da un topo di controllo tosato di controllo tosato, operato in modo non ferito, nove (9) giorni dopo l'intervento chirurgico. Vengono presentati tutti e quattro i canali. Una traccia lunga 10 s (presa dalla regione boxed) è stata estratta dal terzo canale per visualizzare meglio il modello EEG di base. Una sezione EPOC 2048 ms di questo è stato quindi selezionato per essere analizzato nel FFT corrispondente. (B) Analisi FFT di 2048 ms selezionato EPOC dall'animale mallavorato finto il giorno nove (9) dopo l'intervento chirurgico. (C) mostra una traccia EEG di 90 s nove (9) giorni dopo lesioni gravi. Questo show building, modello di chiame veloce presente bilateralmente e attraverso tutti e 4 i canali di raccolta. Una traccia lunga 10 s (presa dalla regione boxed) è stata estratta dal terzo canale per visualizzare meglio il modello EEG appuntito.  Una sezione EPOC 2048 ms di questo è stato quindi selezionato per essere analizzato nel FFT corrispondente. (D) L'analisi FFT di 2048 ms ha selezionato l'EPOC dal grave animale TBI nove (9) giorni dopo l'infortunio. 90 s tracce EEG, dall'alto verso il basso sono biopotenziali 1, 2, 3, 3, 4, corrispondenti alle loro posizioni intorno al sito craniectomia come si vede in Figura 1. I segni verticali grigi definiscono intervalli di 1 s sulle tracce EEG. Tutte le tracce EEG sono mostrate su una scala di (500 V). All'interno dei grafici DI analisi FFT, l'intervallo di frequenza analisi complessivo era di 0,5-30 Hz. Questo è stato ulteriormente suddiviso in 4 bande di frequenza separate di Delta (giallo, 0,5-4 Hz), Theta (Purple, 4-8 Hz), Alpha (rosso, 8-12 Hz) e Beta (verde, 12-30 Hz).  Il grafico %(Power) mostrato nell'analisi FFT indica quale percentuale della potenza totale nell'EPOC analizzata proviene da ogni banda di frequenza specificata in precedenza, consentendo un'ulteriore caratterizzazione matematica dei modelli di forma d'onda EEG. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 . Il segnale si sta tedendo. Questi sono 3 esempi separati di ciò che il segnale esce a causa di problemi del trasmettitore o del ricevitore appare come nella registrazione EEG. (A) Questo è un esempio di abbandono intermittente del segnale EEG su una registrazione.  (B) Questo è un esempio di abbandono dovuto a guasto della batteria durante la telemetria wireless continua appare come su una traccia EEG.  (C) All'interno della regione cerchiata, si può vedere che quando la qualità del segnale (QoS) scende da 100 a 0, il tracciamento EEG diventa appiattito e stagnante a 0 V.  I segni verticali grigi definiscono intervalli di 1 s sulle tracce EEG. Tutte le tracce EEG sono mostrate su una scala di (500 V). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Tra laboratori per quanto riguarda i parametri e i metodi specifici utilizzati per il modello FPI TBI ^{14,26,27,28 .} Queste incoerenze hanno portato a risultati contrastanti e rendono difficile armonizzare gli sforzi e i risultati tra i laboratori. Qui, abbiamo presentato una metodologia dettagliata che descrive il nostro approccio alla registrazione continua a lungo termine di video /EEG per monitorare l'attività epileptiforme post-traumatica. Un certo numero di passaggi sono fondamentali per generare risultati riproducibili con il metodo descritto.

In primo luogo, dato che l'incidenza dell'epilessia post-traumatica è correlata alla gravità delle lesioni, applicare condizioni che si traducono nel TBI più grave. In particolare, utilizzare una craniectomia di 5 mm per garantire che venga esposta un'area di dura sufficientemente ampia. Inoltre, fissare un dispositivo di blocco Luer femmina-femmina sulla superficie del cranio, con l'apertura posta direttamente sopra la craniectomia. Questo differisce da altri laboratori che hanno utilizzato una craniectomia più piccola (3 mm) e/o posizionato un mozzo ago modificato all'interno della craniectomia, che riduce efficacemente la dimensione di apertura. Posizionando la serratura Luer all'esterno della craniectomia, viene mantenuta l'apertura di 5 mm. Questi parametri specifici influenzano la forza complessiva applicata alla dura. La pressione atmosferica applicata alla dura ha anche un impatto importante sulla gravità delle lesioni osservate. Sfortunatamente, la pressione atmosferica è molto variabile e sembra dipendere dal dispositivo. Alcuni laboratori hanno segnalato l'applicazione di un impulso di pressione di 8 - 10 ms¹⁸. Al contrario, il metodo qui descritto genera un impulso di pressione di 20 ms. Questo è coerente con altri laboratori che sembrano generare lesioni più gravi ^14,28. È chiaro che l'impulso di pressione che induce lesioni è un parametro che mostra una notevole variabilità tra i laboratori e deve essere definito empiricamente. Tuttavia, la gravità delle lesioni può essere determinata sulla base di una combinazione di tassi di mortalità (40-50%), tempi di riflesso corretti (>30 min)²⁶. È inoltre fondamentale che nello studio vengano inclusi solo gli animali con una dura intatta. Inoltre, se la craniectomia è occlusa da qualsiasi colla o cemento in modo tale che parte della dura sotto la cranictomia non sia esposta alla piena forza dell'impulso di pressione fluida, allora l'animale dovrebbe essere eliminato dallo studio.  Inoltre, la colla in eccesso sotto la serratura Luer può aderire alla dura e rimuoverla con il tappo di cemento anche dopo un infortunio di successo.  Infine, la forma liscia della curva di impulso di pressione sulla traccia oscilloscopio dà l'indicazione che non ci sono bolle d'aria nella camera fluida e indica che lo stantuffo si muove senza impedimento.

L'anestesia è un altro fattore critico che deve essere controllato. L'esposizione all'Isoflurane deve essere mantenuta ai livelli più bassi possibili per mantenere un piano chirurgico di anestesia. I ratti esposti a livelli più elevati di isoflurane o per lunghe durate hanno maggiori probabilità di sviluppare edema polmonare indotto da neurogenici. La preparazione del cranio rappresenta un altro aspetto critico del metodo. In particolare, asciugare il cranio e rimuovere qualsiasi polvere ossea aiuta a prevenire la rimozione prematura del trasmettitore da parte dei ratti.

Il posizionamento delle viti e il collegamento dei fili EEG sono ovviamente fondamentali per produrre registrazioni costantemente riproducibili. È importante che le viti non siano posizionate troppo profondamente da indurre una lesione sul cervello. Il lembo osseo recuperato dalla craniectomia dei ratti Wistar maschi adulti (12 settimane) è costantemente di 2 mm di spessore. Utilizzare viti elettrodo EEG con un albero di 2,5 mm. È utile utilizzare le punte di zanzara curva pinza emostatiche come distanziale per garantire che le viti si estendano solo alla base dell'osso e non sporchino nel cervello.

L'approccio qui presentato presenta alcune limitazioni. Le batterie devono essere cambiate regolarmente. La frequenza delle variazioni della batteria dipende dalla frequenza di campionamento. Le batterie vengono in genere modificate una volta alla settimana per una frequenza di campionamento di 1000 Hz. Questo intervallo di tempo può essere esteso riducendo la frequenza di campionamento. Il sistema è anche limitato alla registrazione di quattro elettrodi EEG monopolari. Tuttavia, questo fornisce due canali per emisfero e può distinguere tra eventi focali e generalizzati e può distinguere tra cambiamenti anteriori e posteriori. Nonostante queste limitazioni, questo approccio fornisce un metodo ragionevole per condurre il monitoraggio continuo video/EEG e il rilevamento delle modifiche epilettiche a seguito di gravi TBI.

Il metodo qui descritto si traduce in crisi elettrografiche e convulsive entro un mese dalla TBI. Pertanto, questo approccio fornisce un ragionevole lasso di tempo in cui studiare potenziali terapie per prevenire l'epileptogenesi a seguito di grave TBI. Questo approccio fornisce anche un metodo per studiare i meccanismi molecolari associati alla PTE e può portare all'identificazione di potenziali biomarcatori che possono essere utilizzati per identificare i pazienti che sono più a rischio di sviluppare la PTE.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00 mm Drill Bits	Drill Bit City: New Carbide Tools	05M200
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement	3M , Neuss Germany	38019	Dental Cement
4-0 Suture	Ethicon, Sommerville, NJ	K831H	4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture
5 mm outer diameter trephine	Fine Science Tools	18004-50
Bonewax	Medline Industries, Mendelcin, IL	REF DYNJBW25
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial	Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY	3003706	NDC 42023-179-01
Dumont #6 Forceps	Fine Science Tools	11260-20
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	11270-20
ecgAUTO	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare	Cole-Palmer instrument	SKO#45501-22	Order lot #214271
Foot Power Drill	Grobet USA, Carlstadt, NJ	Model C-300
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution)	Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO		NDC 57319-520-05
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline	Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS
IOX2 Software	EMKA Technologies, Falls Church, VA
Isoflorane, USP	Piramal Enterprise Limited, Andhra, India		NDC 66794-013-25
IsoTech Anesthesia machine	SurgiVet	WWV9000
Lateral FPI device	AmScien	302	curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22)
Leica A60 Stereomicroscope	Leica Biosystems, Richmond, VA	PN: 10 450 488
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL	Hospira, Lake Forest, IL	CA-3627	50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50
Micro-Adson Forceps	Fine Science Tools	11018-12
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters	Fine Science Tools	12002-14
PALACOS R+G bone cement with gentamicin	Heraeus,	REF: 5036964	Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin
Physio Suite	Kent Scientific, Terrington, CT
Povidone-iodine solution			Betadine
Puralube Vet Ointment	Dechra Veterinary Products, Overland Park KS		NDC 17033-211-38
Scalpel blade (#10) and holder	Integra Miltex, York, PA	REF: 4-110
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13
Sickle Knife	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1705 HM	5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches.
Silverstein Micro Mirror	Bausch + Lomb Storz Instruments	N1706 S8	3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches
Storage NAS	Synology Inc.	DS3615xs
Synology Assistant	Synology Inc.
Thermal Cautery Unit	Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA	Model NO: 150
Vetivex	Dechra Veterinary Products, Overland Park KS		Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP)
Video Cameras	TRENDnet, Torrance, CA	TV-IP314PI	Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral
Video NAS	Synology Inc.	DS916
Wistar IGS rats	Charles River	strain code 003	12 wk old at the time of injury
Wullstein Retractor	Fine Science Tools	17018-11