Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate

Riepilogo

Qui presentiamo protocolli per la preparazione di fette cerebrali acute contenenti il nucleo genetico laterale e l'indagine elettrofisiologica della funzione sinapsi retinogenica e corticogena. Questo protocollo fornisce un modo efficiente per studiare le sinapsi con la probabilità ad alto rilascio e basso rilascio nelle stesse fette cerebrali acute.

Abstract

Il nucleo genetico laterale è la prima stazione di relè per le informazioni visive. I neuroni relè di questo nucleo talamico integrano l'input dalle cellule gangliari della retina e lo proiettano nella corteccia visiva. Inoltre, i neuroni relè ricevono eccitazione dall'alto verso il basso dalla corteccia. I due principali input eccitatori per i neuroni relè differiscono in diversi aspetti. Ogni neurone relè riceve input solo da poche sinapsi retinogeniche, che sono grandi terminali con molti siti di rilascio. Ciò si riflette nell'eccitazione relativamente forte, i neuroni relè ricevono, dalle cellule gangliari della retina. Le sinapsi corticogenie, al contrario, sono più semplici con pochi siti di rilascio e una forza sinaptica più debole. Le due sinapsi differiscono anche nella loro plasticità sinaptica a breve termine. Le sinapsi reticolatiche esologiano hanno un'alta probabilità di rilascio e di conseguenza mostrano una depressione a breve termine. Al contrario, le sinapsi corticogenie hanno una bassa probabilità di rilascio. Le fibre corticogeniche attraversano i nuclei talamici reticolari prima di entrare nel nucleo genetico laterale. Le diverse posizioni del nucleo talamico talamico reticolare (rostrally dal nucleo genetico laterale) e del tratto ottico (ventro-lateralmente dal nucleo genetico laterale) consentono di stimolare sinaple corticogenio o retinogenica separatamente con elettrodi di stimolazione extracellulare. Questo rende il nucleo genetico laterale un'area cerebrale ideale in cui due sinapsi eccitatorie con proprietà molto diverse che incidono sullo stesso tipo di cellula, possono essere studiate contemporaneamente. Qui, descriviamo un metodo per studiare la registrazione dai neuroni relè ed eseguire un'analisi dettagliata della funzione di sinapsi retinogenica e corticogenica nelle fette cerebrali acute. L'articolo contiene un protocollo passo-passo per la generazione di fette cerebrali acute del nucleo genetico laterale e passaggi per la registrazione dell'attività dai neuroni relè stimolando separatamente il tratto ottico e le fibre corticogenice.

Introduzione

I neuroni relè del nucleo genetico laterale integrano e trasmettono informazioni visive alla corteccia visiva. Questi neuroni ricevono l'input eccitatorio dalle cellule gangliari tramite sinapsi retinogeniche, che forniscono la principale unità eccitatoria per i neuroni relè. Inoltre, i neuroni relè ricevono input eccitatori dai neuroni corticali tramite sinapsi corticogeni. Inoltre, i neuroni relè ricevono input inibitori da interneuroni locali e neuroni GABAergici del nucleo reticularis thalami¹. Il nucleo reticularis thalami è presente come uno scudo tra talamo e corteccia tale che le fibre che proiettano dalla corteccia al talamo e nella direzione opposta devono passare attraverso il nucleo reticularis thalami².

Gli input retinogenici e gli ingressi corticogenici visualizzano proprietà sinaptiche distinte^3,4,5,6,7,8. Ingressi retinogenici formano terminali di grandi dimensioni con più siti di rilascio^9,10. Al contrario, gli ingressi corticogenici visualizzano piccoli terminali con siti a rilascio singolo⁷. Inoltre, le sinapsi retinogeniche guidano in modo efficiente i potenziali di azione dei neuroni relè, nonostante che imredditivi solo il 5-10% di tutte le sinapsi sui neuroni del relè^3,8,11. Le sinapsi corticogenice, d'altra parte, fungono da modulatore delle trasmissioni retinogeniculate controllando il potenziale della membrana dei neuroni relè^12,13.

Questi due principali input eccitatori per i neuroni relè sono anche funzionalmente diversi. Una differenza importante è la depressione a breve termine delle sinapsi retinogeniche e la facilitazione a breve termine delle sinapsi corticogenice^3,5,8. La plasticità a breve termine si riferisce a un fenomeno in cui la forza sinaptica cambia quando la sinapsi è ripetutamente attiva entro un periodo di tempo di pochi millisecondi a diversi secondi. La probabilità di rilascio sinaptico è un fattore importante alla base della plasticità a breve termine. Le synapsi, con una bassa probabilità di rilascio iniziale, mostrano facilitazione a breve termine a causa dell'accumulo di Ca² e nella presynapse e di conseguenza un aumento della probabilità di rilascio viene osservato su attività ripetute. Al contrario, le sinapsi con alta probabilità di rilascio di solito mostrano depressione a breve termine a causa dell'esaurimento delle vesciche pronte e riutilizzabili¹⁴. Inoltre, la desensibilizzazione dei recettori post-sinaptici contribuisce alla plasticità a breve termine in alcune sinapsi di probabilità ad alto rilascio^8,15. Alta probabilità di rilascio e desensibilizzazione dei recettori dell'acido isossiale-5-metil-4-isoxalepropionici (AMPA) che contribuiscono alla depressione a breve termine prominente delle sinapsi retinogeniche. Al contrario, la probabilità a basso rilascio è alla base della facilitazione a breve termine delle sinapsi corticogeni.

Nei topi, il tratto ottico entra nel nucleo genulato laterale dorsale (dLGN) dal sito caudolaterale, mentre le fibre corticogeniulate entrano nel dLGN rostroventrallyamente. La distanza tra i due ingressi consente di sforare le singole proprietà di due input eccitatori molto diversi che incidono sulla stessa cella. Qui, costruiamo e miglioriamo un metodo di dissezione descritto in precedenza in cui le fibre retinogeniculate e corticogeniule sono conservate nelle fette acute del cervello³. Descriviamo quindi lo studio elettrofisiologico dei neuroni relè e la stimolazione delle fibre retinogenulate e corticogeniulate con elettrodi di stimolazione extracellulare. Infine, forniamo un protocollo per il riempimento dei neuroni relè con biocitina e successiva analisi anatomica.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal gruppo governativo di vigilanza sugli esperimenti sugli animali della Renania-Palatinato.

1. Soluzioni

1. Soluzione di dissezione
   1. Per ridurre l'eccitotossicità, preparare una soluzione a base di colina da utilizzare durante la dissezione come qui presentato (in mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 cloruro di colina, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl_2, e ₂₅ glucosio. Preparare la soluzione di dissezione meno di 1 settimana prima dell'esperimento.
2. Soluzione di registrazione
   1. Preparare una soluzione di fluido spinale ceretale artificiale (ACSF) contenente (in mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂e 25 glucosio. Aggiungere 50 : D-APV e 10 sR 95531 idrobromide per bloccare rispettivamente i recettori N-methyl-D-aspartate (NMDA) e GABA_A.
3. Soluzione intracellulare
   1. Preparare una soluzione intracellulare contenente (in mM): 35 Cs-gluconato, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA e 0.1 D-600 (idrocloruro methoxyverapamil). Regolare il pH a 7.3 con CsOH. Filtrare, aliquota e conservare la soluzione di riserva a -20 gradi centigradi fino all'uso.

2. Dissezione

1. Preparare due camere a fette, di cui una è riempita con 100 mL della soluzione di dissezione e l'altra con 100 mL di soluzione di registrazione. Mettere i due becher in un bagno d'acqua (37 gradi centigradi) e far bollire le soluzioni con carbogen per almeno 15 min prima della dissezione.
2. Riempire un becher di plastica con 250 mL di soluzione di dissezione quasi ghiacciata (ma non congelata). Bolla con carbogen almeno 15 min prima dell'uso.
3. Riempire un piatto di Petri di plastica (100 mm x 20 mm), in cui verrà eseguita la dissezione cerebrale, con la soluzione di dissezione a freddo. Inserire un pezzo di carta da filtro nel coperchio del piatto Petri.
4. Raffreddare la camera di dissezione del vibratoma.
5. Anestesizzare un topo con 2,5% isoflurane, ad esempio nella gabbia del topo. Non appena il mouse non risponde a un pizzico di coda, decapitare il topo vicino alla medulla cervicale e immergere la testa nella soluzione di dissezione ghiacciata nella base della parabola Petri.
6. Tagliare la pelle della testa da caudale a nasale e tenerlo lateralmente con le dita per esporre il cranio. Per estrarre il prosencefalo, prima tagliare il cranio insieme alla linea mediana anteriore posteriore, quindi tagliare altre due volte attraverso la sutura coronale e la sutura lambdoid (Figura 1A).
7. Rimuovere il cranio tra la sutura coronale e la sutura lambdoid in modo che il cervello sia esposto. Tagliare il bulbo olfattivo e separare il prosencefalo dal midbrain con una lama fine (Figura 1B). Togliere il cervello dal cranio con una spatola sottile e posizionarlo sulla carta da filtro nel coperchio del piatto Petri.
   NOTA: I passi 2.6 e 2.7 devono essere eseguiti il più velocemente possibile per ridurre la morte delle cellule.
8. Per preservare l'integrità degli ingressi sensoriali e corticali al dLGN nella fetta cerebrale, separare i due emisferi con un taglio parasagittale con un angolo di 3,5 gradi (Figura 1C,D). Asciugare i piani mediolaterali dei due emisferi posizionandoli sulla carta da filtro e quindi incollarli sulla fase di taglio con un angolo di 10-25 gradi dal piano orizzontale (Figura 1E).
9. Posizionare lo stage al centro del vassoio tampone metallico e versare delicatamente il resto della soluzione di dissezione ghiacciata nel vassoio tampone. Eseguire questo passaggio con attenzione poiché un forte versamento potrebbe rimuovere il cervello incollato (Figura 1F).
10. Posizionare il vassoio tampone nel vassoio pieno di ghiaccio, che aiuta a mantenere la bassa temperatura durante la dissezione. Tagliare 250 fette con una lama di rasoio ad una velocità di 0,1 mm/s e un'ampiezza di 1 mm.
11. Conservare le fette nella camera di tenuta riempita con soluzione di dissezione ossigenata a 34 gradi centigradi per circa 30 min e quindi lasciare che le fette si ricumulinino nella soluzione di registrazione a 34 gradi centigradi per altri 30 min.
12. Dopo il recupero, rimuovere la fetta che tiene la camera dal bagno d'acqua e conservare le fette a temperatura ambiente (RT) fino a quando non viene utilizzata negli esperimenti.

3. Elettrofisiologia

1. Tirare pipette utilizzando capillari di vetro borosilicato e un tiro filamento. Mantenere la resistenza di registrazione pipette a 3'4 M' . Tirare pipette stimolanti utilizzando lo stesso protocollo, ma rompere leggermente la punta dopo aver tirato per aumentare il diametro. Riempi le pipette di registrazione con la soluzione intracellulare e la biocitina, mentre riempi e scappa con la soluzione di registrazione.
2. Posizionare le fette nella camera di registrazione e perfondere continuamente le fette con soluzione di registrazione ossigenata a RT. Controllare tutte le fette e selezionare quelle che visualizzano un tratto ottico intatto.
3. Visualizza la sezione e le celle con un microscopio verticale dotato di microscopia video a contrasto differenziale di interferenza infrarossa (IR-DIC).
   NOTA: I neuroni relè sono differenziati dagli interneuroni per la loro dimensione soma più grande e più dendriti primari (fili che emergono dal soma). Gli interneuroni mostrano la morfologia bipolare con un soma più piccolo.
4. Posizionare la pipetta stimolante sulla fetta prima di ricucire la cella con la pipetta di registrazione. Per studiare le sinapsi retinogeniche, posizionare la pipetta stimolante direttamente sul tratto ottico, dove le fibre assone delle cellule gangliari della retina sono raggruppate (Figura 2A). Per analizzare le sinapsi corticogeniulate, posizionare l'elettrodo stimolante sul nucleo reticularis thalami, che è rostroventolazionalrally adiacente al dLGN (Figura 2B).
5. Una volta immersa la pipetta di registrazione nella soluzione di registrazione, applicare un passaggio di tensione di 5 mV per monitorare la resistenza della pipetta. Impostare il potenziale di mantenimento su 0 mV e annullare il potenziale di offset in modo che la corrente di mantenimento sia 0 pA.
6. Avvicinarsi alla cella con la pipetta di registrazione applicando una pressione positiva. Quando la pipetta è in contatto diretto con la membrana cellulare, rilasciare la pressione positiva e impostare il potenziale di tenuta a -70 mV. Applicare una leggera pressione negativa per consentire alla membrana cellulare di attaccarsi alla pipetta di vetro in modo che si formi una guarna gigaohm (resistenza >1 G. Compensare la capacità della pipetta e aprire la cella mediante l'applicazione di impulsi di pressione negativi.
7. Per studiare la funzione sinaptica, applicare impulsi di corrente di 0,1 ms (ca. 30 ) tramite la pipetta di stimolazione. Se non si osservano risposte sinaptiche, potrebbe essere necessario sostituire le pipette stimolanti. Fare attenzione durante il posizionamento delle pipette stimolanti in una posizione diversa in modo che la cella registrata non venga persa.
   NOTA: nelle registrazioni di esempio mostrate nella Figura2, la plasticità sinaptica a breve termine è stata studiata stimolando due volte il tratto ottico o le fibre corticogenice con intervalli interstimolati di 30 ms. Il rapporto coppie -impulso (PPR) è stato calcolato dividendo l'ampiezza della seconda corrente post-sinaptica eccitatoria (EPSC) per quella del primo EPSC (EPSC₂/EPSC₁). Ogni protocollo di stimolazione è stato ripetuto 20 volte. L'ampiezza EPSC è stata misurata dalle correnti medie dei 20 sweep. L'intervallo di tempo tra ogni ripetizione era di almeno 5 s per evitare la plasticità a breve termine indotta dalle ripetizioni.
8. Monitorare continuamente la resistenza della serie applicando una fase di tensione di 5 mV. Utilizzare solo le celle con la resistenza della serie inferiore a 20 M per l'analisi.

4. Etichettatura biocitina

1. Mantenere l'intera configurazione cellulare per almeno 5 min per consentire la diffusione della biocitina nei dendriti distale.
2. Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dalla cella in modo che il soma non venga distrutto.
   NOTA: Se più di una cellula viene registrata su una fetta, i loro soma dovrebbero essere sufficientemente lontani dalle cellule vicine. Assicurarsi che i dendriti di cellule diverse non interferiscano tra loro durante l'imaging.
3. Preparare una piastra di coltura cellulare di 24 pozze. Riempire ogni pozzo con 300 gradi l una l un'ora del 4% di paraformaldeide (PFA). Fare attenzione a non contaminare nulla con PFA che sarà in contatto con le fette da registrare.
4. Trasferire le fette dalla camera di registrazione alla piastra contenente PFA con una pipetta di gomma e fissarle durante la notte. Assicurarsi che la pipetta sia sempre impedita dalla contaminazione da PFA.
   AVVISO: Indossare sempre i guanti e utilizzare un cappuccio chimico durante la manipolazione PFA.
5. Dopo aver fissato le fette durante la notte in PFA, sostituire PFA con salina (PBS) con buffer fosfato. Conservare le fette in PBS a 4 gradi centigradi per l'elaborazione futura (meno di 2 settimane).
6. Lavare le fette con PBS fresco 3 volte (10 min ogni lavaggio).
7. Bloccare i siti di rilegatura non specifici incubando le fette nella soluzione di blocco (0,2% di surfactant non ionico e 5% di albumina di siero bovino in PBS) per 2 h a RT su uno shaker orbitale.
8. Eliminare la soluzione di blocco. Incubare le fette con streptavidin-Alexa 568 diluite nella soluzione di blocco (1:1,000) a 4 gradi durante la notte su uno shaker orbitale.
9. Scartare la soluzione anticorpale e lavare le fette 3 volte con PBS per 10 min a RT su uno shaker orbitale. Lavare le fette con acqua di rubinetto prima del montaggio.
10. Mettere le fette da un mouse su una diapositiva di vetro. Assicurarsi che le celle colorate siano presenti sulla superficie superiore delle sezioni. Assorbire l'acqua intorno alle fette con i tessuti e poi lasciare asciugare le fette per circa 15 min.
11. Applicare due gocce di supporto di montaggio su ogni fetta. Montare un coperchio sul vetrino senza produrre bolle d'aria.
12. Conservare le fette etichettate a 4 gradi centigradi dopo la visualizzazione con un microscopio confocale.

5. Imaging cellulare e ricostruzione

1. Scansiona le fette con un microscopio confocale e utilizza il software associato per l'analisi.
2. Emozionare la fluorescenza a 561 nm.
3. Immagini delle fette con 0,7 apertura numerica (NA), obiettivo di immersione ad olio.
4. Regolare la cella di destinazione al centro della vista e applicare un ingrandimento 2,5 volte.
5. Eseguire il rendering dei set di dati dello stack z per eseguire la scansione dell'intero neurone con i seguenti parametri: format : 2.550 x 2.550 pixel, frequenza di scansione - 400 Hz, z numero 40.Voxel dimensioni erano circa 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 .
6. Tracciano semi-automaticamente i neuroni utilizzando un software di ricostruzione neuronale (ad esempio, NeuronStudio). Un esempio di un neurone relè tracciato 3D è illustrato nella Figura 3B.

Risultati

La preparazione della fetta di dLGN contenente le vie retinogenica e corticogenica è mostrata in base a un obiettivo 4x (Figura 2). Gli assoni delle cellule gangliari retiniche si uniscono nel tratto ottico (Figura 2). La pipetta stimolante è stata posizionata sul tratto ottico per indurre la corrente mediata dalla sinapsi retinogenica (Figura 2A) e sul nucleo reticolari thalami per indurre la corr...

Discussione

Descriviamo un protocollo migliorato basato su un metodo pubblicato in precedenza³, che consente di sforare l'alta probabilità di rilascio di sinapsi retinogeniche e bassa probabilità di rilascio di sinapsi corticogeneulate dalla stessa fetta. Questo è di grande importanza poiché questi due ingressi interagiscono tra loro per modulare la trasmissione del segnale visivo: gli ingressi retinogeniculati sono la principale unità eccitatoria dei neuroni relè, mentre gli input corticothalamici funz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261-250MG
CaCl2	EMSURE	1.02382.1000
choline chloride	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-gluconate	Self-prepared		Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG	methoxyverapamil hydrochloride
D-APV	Biotrend	BN0085-100	NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope	Olympus	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
Forene	Abbvie	2594.00.00	isoflurane
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	ROTH	9105.2
High Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE	1.05833.0250
Micromanipulators	Luigs & Neumann	SM7
Miroscope	Olympus	BX51
mounting medium	ThermoFisher Scientific	P36930	Prolong Gold Invitrogen
NaCl	ROTH	3957.1
NaH2PO4	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE	1.06329.1000
Pipette	Hilgenberg	1807502
Puller	Sutter	P-1000
razor blade	Personna	60-0138
Semiautomatic Vibratome	Leica  Biosystems	VT1200S
SR 95531 hydrobromide	Biotrend	AOB5680-10	GABAA-receptor antagonist