Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare

Riepilogo

Il protocollo descrive l'uso della Miografia dei fili per valutare la tensione isometrica transmurale delle arterie mesenteriche isolate dai topi, con particolare attenzione alla modulazione da fattori rilasciati da cellule endoteliali e tessuti adiposi perivascolare.

Abstract

Alterazione del tono vascolare reattività agli stimoli fisiopatologici contribuisce allo sviluppo di una vasta gamma di malattie cardiovascolari e metaboliche. La disfunzione endoteliale rappresenta un grave colpevole per la ridotta vasodilatazione e una maggiore vasocostrizione delle arterie. Adiposo (grasso) tessuti che circondano le arterie svolgono ruoli importanti nella regolazione del rilassamento endotelio-dipendente e/o contrazione delle cellule muscolari lisce vascolari. I colloqui incrociati tra l'endotelio e i tessuti adiposi perivascolare possono essere valutati ex vivo utilizzando vasi sanguigni montati da un sistema di Miografia a filo. Tuttavia, dovrebbero essere stabilite impostazioni ottimali per le arterie derivate da animali di diverse specie, età, background genetici e/o condizioni fisiopatologiche.

Introduzione

Le dilatazioni e le costrizioni delle arterie sono raggiunte da rilassanti e contrazioni, rispettivamente, delle loro cellule muscolari lisce vascolari. I cambiamenti nella reattività vascolare delle piccole arterie contribuiscono alla regolazione omeostatica della pressione arteriosa da parte dei nervi autonomici e degli ormoni presenti nel sangue (ad esempio, catecolamine, angiotensina II, serotonina, vasopressina). A livello locale, le risposte vascolari delle cellule muscolari lisce sono modulate dai segnali provenienti sia dalle cellule endoteliali dell'intima che dal tessuto adiposo che circonda le arterie (Figura 1).

L'endotelio non è solo una barriera passiva, ma funge anche da superficie per scambiare segnali tra il sangue e le cellule muscolari lisce vascolari sottostanti. Rilasciando varie sostanze vasoattive, l'endotelio svolge un ruolo critico nel controllo locale delle risposte di tono vascolare¹. Ad esempio, in risposta all'acetilcolina, l'ossido nitrico sintasi (eNOS) endoteliale viene attivato nell'endotelio per produrre ossido nitrico (no), che induce il rilassamento del muscolo liscio vascolare sottostante attivando guanil ciclasi solubile (SGC) ². altre sostanze vasoattive includono i prodotti di cicloossigenasi (ad esempio, prostaciclina e trombossano a₂), lipossigenasi (ad es., 12-idrossietilosatetraenoico, 12-HETE) e monoossigenasi del citocromo P450 (HETEs e acido epoxyeicosatrienoico, S.e.t.), specie reattive dell'ossigeno (ROS) e peptidi vasoattivi (ad es., endothelin-1 e angiotensina II), e fattori iperpolarizzanti derivati dall'endotelio (EDHF)³. Un delicato equilibrio tra vasodilatatori e vasocostrittori derivati dall'endotelio mantengono il tono vasomotore locale^4,5.

La disfunzione endoteliale è caratterizzata dalla compromissione dell'endothelio-dipendente vasodilatazione⁶, un segno distintivo di invecchiamento vascolare⁷. Con l'età, la capacità di endotelio per promuovere la vasodilatazione è progressivamente ridotta, dovuto in gran parte a una diminuzione della biodisponibilità NO, così come l'espressione anormale e la funzione di eNOS nell'endotelio e sGC nelle cellule muscolari lisce vascolari^{8 , 9} il ^{, 10}. riduzione della biodisponibilità non potenzia la produzione di vasocostrittori dipendenti dall'endotelio^11,12. Nelle arterie invecchiate, la disfunzione endoteliale provoca iperplasia nei media, come riflessa dai marcati aumenti dello spessore della parete, numero di nuclei mediali, che ricordano l'ispessimento arterioso nell'ipertensione e l'aterosclerosi osservata negli esseri umani pazienti^13,14. Inoltre, le condizioni fisiopatologiche come l'obesità, il diabete o l'ipertensione accelerano lo sviluppo della disfunzione endoteliale^15,16.

Tessuto adiposo perivascolare (pvat) rilascia numerosi adipochine per regolare la struttura vascolare e la funzione¹⁷. L'effetto anti-contrattile di pvat è mediato da fattori rilassanti, come adiponectina, no, perossido di idrogeno e solfuro di idrogeno^18,19,20. Tuttavia, a seconda della posizione e della condizione patofisiologica, PVAT può anche migliorare le risposte contrattili in varie arterie²¹. Le sostanze pro-contrattili prodotte da pvat includono l'angiotensina-II, la leptina, la resistina e la Ros^22,23.  Nella maggior parte degli studi sui vasi sanguigni isolati, il PVAT è stato considerato come un semplice supporto strutturale per la vascolarizzazione e quindi rimosso durante la preparazione dei segmenti di anello dei vasi sanguigni. Poiché la disfunzione adiposa rappresenta un fattore di rischio indipendente per l'ipertensione e le complicanze cardiovascolari associate²⁴, il pvat che circonda i vasi sanguigni deve essere considerato quando si studia la reattività vascolare di diverse arterie.

I sistemi di miografo multifilo sono stati ampiamente utilizzati per indagare le funzioni vasomotore di una varietà di vasi sanguigni, tra cui l'aorta, mesenterica, renale, femorale, cerebrale e arterie coronarie^25,26. I protocolli qui descritti utilizzeranno la Miografia dei fili per valutare la reattività vascolare nelle arterie mesenteriche isolate da modelli murini geneticamente modificati, con particolare attenzione alla modulazione da parte di PVAT.

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati per il seguente studio sono stati forniti dal laboratorio animale unità della facoltà di medicina, l'Università di Hong Kong. L'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato dipartimentale sull'uso degli animali da laboratorio per l'insegnamento e la ricerca (CULATR, no.: 4085-16).

1. i preparativi

1. Preparazione di farmaci
   1. Conservare i farmaci in modo appropriato come indicato nella scheda di sicurezza dei materiali (MSDS) subito dopo averli ricevuti. Sciogliere i farmaci in polvere in solventi come soluzioni di stock ad alta concentrazione e poi aliquota per lo stoccaggio a-20 ° c.
      Nota: la maggior parte dei farmaci sono disciolti in acqua distillata per preparare le soluzioni stock; riscaldamento o sonicazione può essere richiesto per alcuni farmaci. Se i farmaci non completamente sciogliere in acqua, una goccia di 1 M NaOH può essere aggiunto, mentre per i farmaci di base una goccia di 1 M HCl può essere utilizzato. I farmaci idrofobici possono essere disciolti in dimetilsolfossido (DMSO) o etanolo assoluto. In questi ultimi casi, la concentrazione finale del bagno (in M) deve essere nota e devono essere eseguiti controlli appropriati per escludere gli effetti dei solventi.
   2. Prima di sperimentare, sciogliere le aliquote del farmaco (tabella dei materiali) in Krebs-Ringer bicarbonato soluzione (Krebs) contenente 115 mm nacl, 4,6 mm kcl, 2,5 mm CAcl₂, 1,17 mm mgso₄, 1,17 mm KH₂po₄, 25 mm NaHCO_3, 11,1 mm D-glucosio e 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
   3. Per le curve di concentrazione cumulative-risposta, preparare le scorte e le soluzioni di lavoro di diversi farmaci per diluizioni seriali (tabella 1).
2. Impostazione dello strumento
   1. Calibrare il trasduttore di forza per tutti i canali prima di utilizzare il sistema myograph ogni giorno, o ogni volta che il sistema è stato spostato.
      Nota: la procedura di calibrazione dettagliata varia a seconda del modello. In generale, un peso di due grammi viene applicato alle mascelle e la forza corrispondente dovrebbe 9,81 ± 0,1 mN. Se la lettura è disattivata di oltre 0,1 mN, il trasduttore deve essere ricalibrato. Per il sistema utilizzato nel presente protocollo (vedere la tabella dei materiali) i valori di funzionamento del trasduttore di forza durante la calibrazione devono essere compresi tra 3000 e 3500. Se il valore del trasduttore è superiore o inferiore, il trasduttore di forza deve essere sostituito.
   2. Regolare e allineare i supporti di montaggio in ogni camera. L'uso continuo e ripetuto della camera del miografo può causare un certo disallineamento del supporto di montaggio, che necessita di una regolazione occasionale prima degli esperimenti per garantire che le ganasce siano correttamente allineate.
      Nota: è necessario prestare particolare attenzione quando si regolano i supporti di montaggio poiché i trasduttori di forza sono molto sensibili e fragili.
   3. Accendere riscaldatori e gas (95% O₂ e 5% Co₂) almeno 30 minuti prima dell'esperimento per consentire che le camere e i tamponi siano riscaldati fino a 37 ± 0,1 ° c e bilanciati con la miscela di gas.
      1. Controllare la temperatura del termometro per garantire la precisione del riscaldatore. La temperatura può essere modificata per eseguire esperimenti di raffreddamento o riscaldamento. Se la temperatura non è corretta come impostato, applicare la funzione di offset della macchina per aumentare o diminuire le impostazioni per raggiungere la temperatura desiderata.
   4. Alla fine dell'esperimento, pulire tutte le camere e spegnere il riscaldatore, nonché il gas che corre alla configurazione.
      1. Non spegnere il gas prima che tutto il liquido nella camera sia stato aspirato fuori dal sistema, altrimenti l'acqua acida/distillata può rigurgitare e raggiungere la camera d'organo durante il successivo utilizzo.
      2. Per pulire le camere del miografo filo, il modo più efficace è quello di eseguire il lavaggio acido utilizzando una soluzione di acido acetico diluito. Pulire il bordo e l'interno delle camere con un batuffolo di cotone.
      3. Dopo il lavaggio, sciacquare accuratamente le camere con acqua distillata. Pulire l'esterno delle camere con un panno umido per rimuovere il sale essiccato. L'etanolo può essere utilizzato anche se durante l'esperimento sono stati utilizzati farmaci idrofobici.
      4. Un esempio della procedura di lavaggio è il seguente. Riempire le camere con 8% soluzione di acido acetico e incubare per 2 min. utilizzare un applicatore a punta di cotone per pulire meccanicamente la superficie della camera d'acciaio. Evitare qualsiasi contatto con la parte in alluminio del miografo.
      5. Aspirare l'acido acetico e lavare la camera del miografo e sostare più volte con acqua distillata e asciugare le superfici utilizzando carta assorbente o applicatori in cotone.
3. Dissezione degli anelli arteriosi mesenterici
   Nota: gli animali utilizzati per lo studio corrente erano dieta ad alto contenuto di grassi alimentati maschio adipo-SIRT1 topi e tipo selvaggio cucciolata come controlli. Ogni animale pesava approssimativamente 45 g al momento degli esperimenti.
   1. Euthanize il topo mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg).
   2. Con forbici chirurgiche e pinze, eseguire una laparotomia Mid-line per rivelare il contenuto addominale.
   3. Raccogli il porticato mesenterico in una capsula di Petri rivestita di silicio.
   4. Stendere e fissare la rete mesenterica nella capsula di Petri per rivelare la ramificazione del mesentere e del tessuto connettivo.
   5. Sotto un microscopio (10x), e con forbici fini e pinze, sezionare attentamente i tessuti connettivi circostanti. Evitare di danneggiare lo strato avventitiale. In alternativa, il tessuto adiposo circostante può essere conservato intorno al vaso sanguigno per l'esperimento (se necessario).
   6. Utilizzando le forbici fini e pinze, accisa i rami secondari delle arterie mesenteriche in tampone ghiacciato Krebs.
      Nota: ogni ricercatore dovrebbe avere la propria serie di kit di dissezione, corde e staffe. Questi strumenti devono essere mantenuti correttamente e puliti-up ogni volta dopo l'esperimento come alcuni farmaci sono difficili da lavare via e residui possono attenersi a loro.
      1. Tenere i vasi sanguigni nel tampone Krebs freddo separando i tessuti connettivi circostanti, compreso il PVAT. Durante la manipolazione del vaso sanguigno, essere delicato per evitare danni inutili all'endotelio.
      2. Se l'esperimento coinvolge lo studio di PVAT, mantenere un 1,5 sfera di diametro di 2 mm di PVAT intorno al vaso sanguigno. In alternativa, le stesse quantità di tessuti adiposi possono essere aggiunte in ogni camera per l'esperimento.
   7. Opzionale Rimuovere l'endotelio dal vaso sanguigno dissezionato come un controllo per valutare la dipendenza endotelium delle risposte. Per le arterie mesenteriche, rimuovere l'endotelio da arrotolare delicatamente su una staffa di filo o un capello.
   8. Tagliare il vaso sanguigno preparato come sopra in piccoli anelli (~ 2 mm di lunghezza) e metterli in un piatto di plastica pieno di aerato (95% O₂ e 5% Co₂) tampone Krebs per montaggio successivo nelle camere di un filo myograph²⁷.
   9. Trasferire gli anelli della nave in una camera myograph posizionata al microscopio. Gli anelli devono essere posizionati uniformemente, con le staffe superiori e inferiori parallele. Il filo di fissaggio (40 μm) deve essere appena preparato poiché i farmaci possono legarsi alle corde.
   10. Infilare l'anello del vaso sanguigno su una lunghezza idonea (2 cm) del filo e fissarlo a una mascella della camera di montaggio avvitando per fissare la posizione.
   11. Passare un secondo filo attraverso l'anello e ancorare alla mascella opposta.
   12. Con anelli filettati e fissati a mascelle a camera, montare la camera sulla configurazione myograph e ruotare la vite micrometrica in senso orario per spostare i fili vicini l'uno all'altro fino a quando la forza di lettura sull'interfaccia utente corrispondente alla camera montata è zero o semplicemente sotto.
       Nota: il filo attaccato alla mascella superiore deve essere di lunghezza minima per garantire che la tensione possa essere completamente trasfilata al rivelatore.
   13. Equilibrare i preparativi a 37 ° c per almeno 30 minuti prima della prima applicazione della forza utilizzando il micrometro regolabile.
   14. Valutare la vitalità tissutale in 115 mM di potassio alto (NaCl sostituito da KCl su base molare) krebs contenenti 4,6 mm NaCl, 115 mm KCl, 2,5 mm cacl₂, 1,17 mM MGSO₄, 1,17 mm KH₂po₄, 25 mm NaHCO₃ e 11,1 mM D-glucosio a pH 7,4.
       Nota: i recipienti isolati sono considerati vitali se la forza contrattile trascorsa e registrata come deviazione al di sopra della linea di base nel software di registrazione dati del sistema myograph è superiore al 40% del loro tono di riposo, in risposta a un agente contrattile. Se l'arteria non si contrae in modo appropriato, la tensione basale/pressione della parete ottimale non è stata regolata correttamente o l'arteria potrebbe essere stata danneggiata durante l'isolamento o il montaggio della nave.
   15. Opzionale Valutare l'integrità delle cellule endoteliali applicando fenilefrina per indurre la contrazione della nave al 50% della risposta iniziale a KCl (come registrato dal trasduttore di forza nel software di registrazione dei dati), seguita dall'aggiunta di 1 μm di acetilcolina.
       Nota: una buona preparazione dei vasi sanguigni è cruciale per ottenere risultati coerenti e accurati. Un preparato non deve essere utilizzato per l'esperimento se il test di integrità endoteliale non è soddisfacente o non risponde alla KCl, indicando che la funzione endoteliale o la contrattilità muscolare liscia vascolare, rispettivamente, non sono soddisfacenti. In questo caso, il preparato deve essere sostituito con un nuovo anello dello stesso vaso sanguigno o di un nuovo vaso sanguigno.

2. normalizzazione per determinare la tensione iniziale ottimale

Nota: la procedura di normalizzazione consente la determinazione del diametro interno ottimale (IC) delle arterie in cui il vaso sanguigno sperimenta una pressione transmurale idonea a riposo (100 mmHg o 13,3 kPa per le arterie mesenteriche) e produce il massimo attivo forze in risposta agli agenti vasoattivi.

1. Accendere il computer e aprire il software di registrazione dei dati (vedere la tabella dei materiali).
2. Salvare l'esperimento come "file di dati LabChart" con un nuovo nome per evitare di sovrascrivere il file di impostazione originale.
3. Aprire la finestra delle impostazioni di normalizzazione e impostare il fattore k come 1. Accettare i valori di default per la calibrazione oculare (0,3 Se la lunghezza della nave è sconosciuta o 1 se è nota la lunghezza della nave), la pressione di destinazione (13,3), il tempo di media online (2) e il tempo di ritardo (60). Fare clic su OK per salvare le impostazioni.
4. Selezionare i canali di interesse e inserire il diametro del filo (40 μm), gli endpoint tissutali (a1:0; a2: lunghezza del tessuto misurata), la lettura iniziale dei micrometri nella finestra di normalizzazione.
5. Avviare la procedura di normalizzazione applicando il primo tratto passivo al vaso sanguigno (ruotare la vite del micrometro in senso antiorario).
6. Attendere che la nave si stabilizzi (3 min) e inserire la nuova lettura del micrometro nella finestra di normalizzazione. La tensione della parete viene calcolata automaticamente e mostrata come un punto sul grafico.
   Nota: i "passi" del micrometro utilizzati durante l'allungamento passivo non devono essere uguali. I primi tratti possono essere di 20 μm ciascuno. Mentre i tratti si avvicinano alla linea Isobar, i gradini possono essere ridotti a 10 μm, 5 μm, 2 μm o anche più piccoli. Aprire la finestra principale del grafico mentre si regolano le impostazioni del micrometro — se appare un grande picco che supera la linea di Isobar su un grafico di lunghezza/tensione (che indica i punti di pressione corrispondenti a un valore predeterminato), ridurre la tensione.
7. Dopo ogni tratto passivo, sostituire il controllo Krebs con un Krebs alto potassio ISO-osmotico contenente 115 mM KCl. Quando la contrazione raggiunge un altopiano (circa 3 min), registrare la forza attiva (F) sottraendo la forza passiva ad ogni tratto dalla forza attivata dal potassio. Calcolare la tensione della parete e i valori della circonferenza interna (IC).
   1. Misurare la tensione attiva come la deviazione sopra la linea di base. La tensione attiva (T) viene calcolata in base all'equazione F (mN) = T (mN/mm) x 2 x lunghezza del recipiente (mm). I valori della circonferenza interna (IC) sono calcolati dai dati del micrometro (IC = 205,6 μm + 2 x "gap").
8. Rimuovere l'elevata condizione di potassio sostituendo con Krebs freschi. Ripetere il lavaggio per tre volte in 5 minuti.
9. Ripetere i passaggi da 2,5 a 2,8 (inducendo i tratti passivi seguiti dalla contrazione attiva in turni alternati) fino a quando la tensione attiva non inizia a diminuire (Figura 2).
10. Dopo più turni di tratti alternativi, le curve di lunghezza/tensione passiva danno il valore di IC100, la circonferenza interna del recipiente ad una pressione transmurale di 100 mmHg, come punto di attraversamento con la linea di Isobar.
    Nota: ogni valore del micrometro durante i tratti passivi viene introdotto manualmente nel modulo di normalizzazionedel software. Il programma registra automaticamente la misura di forza corrispondente per generare la curva di lunghezza/tensione passiva, che dà il valore di IC100 come punto di incrocio con la linea Isobar (Figura 2, pannelli a destra). Più l'ultimo punto è vicino alla linea Isobar, ma appena sopra la migliore normalizzazione è senza danneggiare i vasi. Un punto troppo sopra la linea di Isobar può danneggiare fisicamente la nave montata, causando risultati inaffidabili durante l'esperimento.
11. Creare le curve di lunghezza/tensione attive per determinare i valori IC1 e calcolare il fattore k di normalizzazione come rapporto di IC1/IC100, che verrà utilizzato per questo tipo di vaso sanguigno nei successivi esperimenti di Miografia.
    Nota: le curve di lunghezza/tensione attive vengono create tracciando i valori IC calcolati dai dati del micrometro sull'asse x e dalle tensioni attive sull'asse y. Il IC1 è il valore che giace all'interno della regione di picco Plateau (tracce rosse in Figura 2, pannelli a destra). Dopo aver tracciato le curve di lunghezza/tensione attive e aver determinato IC1, il fattore k di normalizzazione viene calcolato come rapporto di IC1/IC100. Sulla base del fattore di normalizzazione k , l'IC ottimale per il basale, indicato come IC1, mostrerà sulla curva di lunghezza/tensione passiva. L'impostazione del micrometro per questo IC appare sotto la curva e deve essere utilizzata per impostare il microposizionatore per i successivi esperimenti di Miografia. La tensione iniziale (T) equivale alla pressione target (PI) x IC/2π e la forza ottimale (F) applicata al recipiente equivale a T x 2 x lunghezza del recipiente.
12. Lavare accuratamente le alte Krebs di potassio e equilibrare i preparativi per un altro 30 a 45 min. reimpostare le tensioni basali su "zero" in modo che solo le risposte contrattili attive vengano registrate durante l'esperimento successivo.

3. contrazioni indotte da phenylephrine

Nota: i farmaci che possono essere selezionati per indurre le risposte vasocostrittive includono l'adrenocettore agonista non specifico norepinefrina, il selettivo α-1 adrenocettore agonista phenylephrine, l'ormone peptidico angiotensina II, e la monoamina neurotrasmettitore 5-idrossitritptamina. Phenylephrine è usato nel presente protocollo per l'esame (tabella dei materiali).

1. Preparare e montare gli anelli arteriosi accoppiati come descritto nel paragrafo 1,3, uno con PVAT intatto e l'altro con PVAT rimosso, dalle sezioni adiacenti di ciascuna arteria per l'esperimento.
2. Dopo la normalizzazione (descritta al paragrafo 2), pre-contrarre i segmenti arteriosi con alto tampone di potassio Krebs aggiungendo 115 mM di soluzione KCl alla camera contenente Krebs.
3. Attendere la contrazione a Plateau (3 min), lavare l'alto potassio e sostituirlo con tampone di Krebs fresco aerato. Ripetere il lavaggio tre volte in 5 minuti.
4. Ripetere la stimolazione e il lavaggio del KCl tre volte e registrare la massima risposta contrattile/tensione al KCl sottraendo la tensione di base dalla tensione dovuta alla stimolazione del KCl.
5. Dopo l'ultima contrazione e lavaggio, riempire la camera con caldo, aerato tampone Krebs e consentire l'arteria di recuperare per circa 30 minuti prima di eseguire il compito successivo.
6. Per ogni camera, aggiungere quantità cumulative di fenilfrina (incrementi di Half-log da 10^-10 a 10^-4 M) per indurre gli aumenti di concentrazione-dipendenti della tensione isometrica dei preparati quiescenti.
7. Iniziare aggiungendo una bassa concentrazione dell'agonista alla camera. Dopo aver permesso abbastanza tempo per una contrazione stabile (3 – 5 min), aggiungere la concentrazione successiva. Ripetere i passaggi con concentrazioni crescenti di fenilfrina.
8. Dopo aver aggiunto l'ultima dose di agonista (phenylephrine), lavare accuratamente il farmaco e riempire la camera con tampone Krebs fresco. Tracciare le risposte dipendenti dalla concentrazione come percentuali crescenti delle contrazioni massime indotte dalla KCl (Figura 3).
9. Opzionale Per valutare il contributo di NO, incubare i preparati con l'inibitore della NO sintasi, L-nome (10^-4 M), per 30 minuti prima dell'aggiunta di fenilfrina. L-NAME migliora le contrazioni indotte da fenilfrina nelle preparazioni quiescenti delle arterie mesenteriche (Figura 4).
   Nota: gli inibitori o gli antagonisti devono avere tempo sufficiente per raggiungere l'equilibratura, di solito 30 – 45 min (essere coerenti per qualsiasi insieme di esperimenti).
10. Per eseguire una seconda curva di concentrazione-risposta in sequenza, lavare la camera completamente e ripetutamente per rimuovere tutti gli agonisti precedenti, fino a quando non si osservano ulteriori cambiamenti di tono.
    Nota: la sperimentazione parallela espone almeno due anelli ottenuti dallo stesso vaso sanguigno all'agonista, uno in condizioni di controllo e uno in presenza dell'inibitore o degli inibitori; in ogni anello la curva di concentrazione-risposta verrà eseguita una sola volta. È preferibile eseguire esperimenti paralleli, poiché questo fornisce un migliore controllo per l'azione del farmaco e la sensibilità dei vasi sanguigni. Gli esperimenti seriali ottengono una curva di concentrazione-risposta ad un agonista in un unico anello; lavarlo fuori, cambiando le condizioni sperimentali (ad esempio, aggiungendo un inibitore), e poi ripetendo la curva di risposta di concentrazione sullo stesso anello. In questo caso, sono necessari controlli temporali per dimostrare che le risposte al farmaco non sono dovute a cambiamenti del tessuto nel tempo. Non si può mai essere certi che il tessuto sia esattamente nello stesso stato dopo l'esposizione ad un esperimento di concentrazione-risposta. Deve essere somministrato un tempo sufficiente (almeno 30 – 60 min) per consentire ai segmenti della nave di ritornare alla loro tensione di riposo (basale), anche se in alcuni casi, questo potrebbe non verificarsi immediatamente dopo la dissociazione dell'agonista ad alta affinità dai recettori. Inoltre, i Krebs ad alto potassio possono essere applicati tra le curve di concentrazione-risposta cumulative per ridurre la desensibilizzazione²⁸. Ricordate che la maggior parte degli antagonisti non possono essere lavati completamente, quindi continuate ad aggiungerla per il resto dell'esperimento.

4. rilassamento/contrazioni a carico dell'endotelio

1. Pre-contrattare un segmento arterioso appena montato (come descritto nei passaggi da 3,2 a 3,5). Ancora una volta, registrare la massima risposta contrattile/tensione a KCl sottraendo la tensione di base dalla tensione dovuta alla stimolazione di KCl.
2. Opzionale Incubare i preparati con l'inibitore di NO sintasi, L-NAME (10^-4 M), per 30 minuti prima dell'aggiunta di U46619.
3. Aggiungere le concentrazioni pre-calcolate di U46619 alla camera e consentire una contrazione stabile e sostenuta dei segmenti dell'arteria.
   Nota: le risposte vasodilatatorie sono indotte nelle arterie mesenteriche pre-contrattate a circa 80% delle risposte massime a 115 mM KCl. diversi agonisti possono essere utilizzati per indurre la contrazione per attivazione dei loro recettori specifici. Qui, i segmenti dei vasi sanguigni con o senza PVAT sono pre-contrattati con U46619 (1 – 3 x 10^-8 M; Tabella dei materiali), un agonista del recettore a2 del trombossano, per indurre contrazioni muscolari lisce stabili e sostenute.
4. Aggiungere concentrazioni cumulative di acetilcolina (10^-10 a 10^-4 M) alla camera d'organo. Le risposte vasodilatatorie dipendenti dalla concentrazione dei segmenti delle arterie sono presentate in percentuale delle risposte contrattili indotte da U46619 (Figura 5).
   Nota: per la maggior parte dell'esperimento, la prossima concentrazione dell'agonista rilassante deve essere aggiunta immediatamente quando si osserva un plateau per prevenire il rimbalzo in tensione. Le risposte vasodilatatorie dipendenti dalla concentrazione dei segmenti delle arterie sono normalizzate in percentuale delle risposte contrattili indotte da U46619 per adattarsi alle lievi differenze di internervazione e di diametro tra i segmenti dell'arteria (Figura 5). Piccole variabilità nella reattività tra i singoli anelli ottenuti dallo stesso vaso sanguigno diventano minime quando un gruppo di sei o più esperimenti vengono analizzati statisticamente. Quando si esprimono le risposte come percentuale delle contrazioni massime del singolo tessuto, è opportuno utilizzare un'analisi accoppiata (ad esempio, il test t associato dello studente) per confrontare le risposte dello stesso tipo di tessuti di diversi animali da confrontare delle risposte di un singolo tessuto prima e dopo un intervento. Quando si analizzavano gli effetti di PVAT, viene utilizzata l'ANOVA bidirezionale seguita dal test di confronto multiplo.
5. Dopo aver aggiunto la dose finale dell'agonista rilassante, rimuovere il farmaco da ogni camera e riempire con tampone Krebs fresco. Lavare accuratamente la camera con tampone Krebs e lasciare che l'arteria si stabilizzi per almeno 45 minuti prima di eseguire ulteriori esperimenti.

Risultati

Esame delle relazioni di lunghezza/tensione per ottenere il fattore di normalizzazione k

La quantità di tratto applicato a un segmento di vaso influenza l'entità dell'interazione actina-miosina e quindi la forza attiva massima sviluppata. Così, per ogni tipo di vaso sanguigno, determinare la quantità di tratto necessario per la massima forza attiva è necessaria per gli studi di Miografia corretta. ...

Discussione

Oltre alle cellule endoteliali, i segnali derivati da PVAT giocano un ruolo importante nella regolazione della reattività del tono muscolare liscio³⁰. Sana pvat rilascia No e anti-infiammatori adiponectina per esercitare un effetto anti-contrattile sulle arterie, che si perde in condizioni patologiche come l'obesità e la sindrome metabolica^31,32. Negli Stati di malattia, la pvat contribuisce allo sviluppo della disfunzione endoteliale e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625	Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)	Sigma-Aldrich	N5751	Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126	Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)	Enzo	BML-PG023-0001	Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myograph	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	-
Adipo-SIRT1 wild type mice	Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong	CULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishes	Danish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wires	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
Surgical tools