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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il filtraggio della frammentazione diagnostica, implementato in MZmine, è un approccio elegante e post-acquisizione per lo schermo di DataSet LC-MS/MS per intere classi di prodotti naturali conosciuti e sconosciuti. Questo strumento ricerca gli spettri MS/MS per gli ioni prodotto e/o le perdite neutre che l'analista ha definito come diagnostica per l'intera classe di composti.

Abstract

I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili, piuttosto che un singolo composto. A causa delle loro caratteristiche strutturali comuni, molti composti all'interno della stessa classe subiscono una simile frammentazione MS/MS e hanno diversi ioni di prodotto identici e/o perdite neutre. Lo scopo del filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF) è quello di rilevare in modo efficiente tutti i composti di una determinata classe in un estratto complesso, vagliando DataSet LC-MS/MS non mirati per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre. Questo metodo è basato su un modulo DFF implementato all'interno della piattaforma MZmine open-source che richiede estratti campione essere analizzati da acquisizione dipendente dai dati su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione come quadrupolo Orbitrap o quadrupolo di massa di tempo di volo Analizzatori. La limitazione principale di questo approccio è l'analista deve prima definire quali ioni di prodotto e/o le perdite neutre sono specifici per la classe mirata di prodotti naturali. DFF consente la successiva scoperta di tutti i prodotti naturali correlati all'interno di un campione complesso, compresi i nuovi composti. In questo lavoro, dimostreremo l'efficacia del DFF mediante screening degli estratti di Microcystis aeruginosa, una prominente fioritura algale nociva che causa cianobatteri, per la produzione di microcistine.

Introduzione

La spettrometria di massa tandem (MS/MS) è un metodo di spettrometria di massa ampiamente utilizzato che comporta l'isolamento di uno ione precursore e l'induzione della frammentazione tramite l'applicazione di energia di attivazione come la dissociazione indotta da collisione (CID)1. Il modo in cui un frammento di ioni è intimamente legato alla sua struttura molecolare. I prodotti naturali sono spesso biosintetizzati come miscele di composti strutturalmente simili piuttosto che come un unico chimico unico2. In quanto tali, i composti strutturalmente correlati che fanno parte della stessa classe biosintetica condividono spesso caratteristiche chiave di frammentazione MS/MS, tra cui ioni di prodotti condivisi e/o perdite neutre. La capacità di schermo campioni complessi per composti che possiedono ioni di prodotti specifici per classe e/o perdite neutre è una potente strategia per rilevare intere classi di composti, potenzialmente portando alla scoperta di nuovi prodotti naturali3, 4 , 5 il , 6. per decenni, metodi di spettrometria di massa come la scansione di perdita neutra e la scansione di ioni precursori eseguite su strumenti a bassa risoluzione hanno consentito agli ioni con la stessa perdita neutra o gli ioni di prodotto da rilevare. Tuttavia, gli ioni o le transizioni specifiche dovevano essere definite prima di eseguire gli esperimenti. Poiché gli spettrometri di massa ad alta risoluzione sono diventati più popolari nei laboratori di ricerca, i campioni complessi sono ora comunemente sottoposti a screening utilizzando metodi di acquisizione dipendenti dai dati non mirati (DDA). Contrariamente alla tradizionale perdita neutra e alla scansione a ioni precursori, i composti strutturalmente correlati possono essere identificati mediante l'analisi post-acquisizione7. In questo lavoro, si dimostra una strategia che abbiamo sviluppato definito filtraggio della frammentazione diagnostica (DFF)5,6, un approccio semplice e facile da usare per rilevare intere classi di composti all'interno di matrici complesse. Questo modulo DFF è stato implementato nella piattaforma open-source MZmine 2 e disponibile scaricando MZmine 2,38 o versioni più recenti. DFF consente agli utenti di seriare in modo efficiente i DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono ioni di prodotto e/o perdite neutre (es) che sono diagnostiche per intere classi di composti. Una limitazione della DFF è la caratteristica degli ioni di prodotto e/o le perdite neutre per una classe di composti devono essere definite dall'analista.

Ad esempio, ognuna delle più di 60 diverse micotossine fumonisine identificate8,9 possiedono una catena laterale tricarballilico, che genera una m/z 157,0142 (C6H5O5-) prodotto ione su frammentazione della [M-H]- Ion4. Pertanto, tutte le fumonisine putativo in un campione possono essere rilevate utilizzando DFF mediante lo screening di tutti gli spettri MS/MS all'interno di un DataSet DDA che contengono lo ione di prodotto m/z 157,0142 prominente. Analogamente, i composti Solfatati possono essere rilevati mediante screening dei DataSet DDA per gli spettri MS/MS che contengono una perdita diagnostica neutra di 79,9574 da (SO3)3. Questo approccio è stato anche applicato con successo per la rilevazione di nuovi peptidi ciclici5 e prodotti naturali che contengono i residui di triptofano o fenilalanina6.

Per dimostrare l'efficacia del DFF e la sua facilità d'uso all'interno della piattaforma MZmine10, abbiamo applicato questo approccio all'analisi delle microcistine (MCS); una classe di oltre 240 tossine strutturalmente correlate prodotte da acqua dolce cianobatteri11,12,13.

Le cianotossine più comunemente segnalate sono MCs, con il congenitore MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) più frequentemente studiato (Figura 1). Gli MCs sono heptapeptides monociclici non ribosomiali, biosintetizzati da diversi generi di cianobatteri tra cui Microcystis, Anabaena, Nostoc e Planktothrix12,13. Gli MCs sono composti da cinque residui comuni e due posizioni variabili occupate da aminoacidi L. Quasi tutti i MCs possiedono un residuo di acido β-aminoacido 3-ammino-9-metossi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-dienoico (Adda) alla posizione 511.  I percorsi di frammentazione MS/MS di MCS sono ben descritti14,15; il residuo di Adda è responsabile della prominente ione MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+) e di altri ioni di prodotto tra cui m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (Figura 2). I DataSet DDA non mirati degli estratti cellulari Microcystis aeruginosa possono essere proiettati per tutte le microcistine presenti utilizzando questi ioni diagnostici, dato che le microcistine hanno un residuo di Adda.

Protocollo

1. preparazione di DataSet di cromatografia liquida non mirata (LC)-MS/MS

Nota: la DFF può essere eseguita utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione e un metodo analitico ottimizzato per una classe di analiti target. Le condizioni LC-MS/MS ottimizzate per MC sullo spettrometro di massa Orbitrap sono elencate nella tabella dei materiali.

  1. Scaricamento di MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
    Nota: i dati di esempio CPCC300. RAW possono essere trovati in https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.
    1. Nel menu a discesa metodi di dati RAW , selezionare l'opzione di importazione dei dati RAW .
    2. Scegliere il/i file di dati da analizzare. È possibile importare file singoli o multipli.
  2. Opzionale Se il formato dei dati del fornitore non è supportato da MZmine, utilizzare proteowizard16 per generare file di dati centroided. mzml.
    1. Scegliere il filtro di prelievo di picco per applicare l'algoritmo di centroiding fornito dal fornitore.

2. filtraggio della frammentazione diagnostica dei file DDA importati

  1. Utilizzando il cursore, selezionare ed evidenziare i file di dati nella colonna file di dati RAW della schermata principale di mzmine.
  2. Nel menu a discesa visualizzazione , selezionare l'opzione di filtraggio della frammentazione diagnostica .
  3. Nella finestra di dialogo DFF visualizzata (Figura 3), immettere le seguenti opzioni:
    1. Tempo di conservazione-utilizzare la gamma automatica o definire l'intervallo di tempi di ritenzione in minuti quando la classe mirata di analiti sarà elute.
    2. Precursore m/z -USA Auto Range o definire la gamma m/z della classe mirata di analiti, compresa la possibilità per più composti caricati quando appropriato.
    3. m/z tolleranza – introdurre l'accuratezza di massa MS/MS ottenibile del MSinstrument; 0,01 m/z o 3,0 ppm è appropriato per una piattaforma Orbitrap. Se verranno esaminati solo gli ioni del prodotto diagnostico, immettere 0,0 nell'opzione valore di perdita neutra di diagnostica (da) . Viceversa, se verranno esaminate solo le perdite neutre diagnostiche, immettere 0,0 nell'opzione ioni prodotto diagnostico (m/z) .
    4. Ioni di prodotti diagnostici (m/z) – immettere il/i prodotto/i specifico/i di classe m/z. Separare gli ioni di prodotti multipli con una virgola.
      Nota: l'immissione di più ioni di prodotti visualizzerà gli spettri che contengono tutti gli ioni di prodotti elencati.
    5. Valore di perdita neutra diagnostica (da) – immettere la perdita neutra specifica della classe (es). Separa più perdite neutre con una virgola.
      Nota: l'immissione di più perdite neutre visualizzerà gli spettri che contengono tutte le perdite neutre elencate. L'introduzione di entrambi gli ioni di prodotto diagnostico e le perdite neutrali visualizzeranno spettri che soddisfano tutti i criteri.
    6. Intensità minima di ioni diagnostiche (% picco base) – in% del picco di base degli spettri MS/MS, definire l'intensità minima per gli ioni di prodotto diagnostico e/o le perdite neutre da considerare.
    7. File di output Peaklist : selezionare un percorso e un nome per l'output dei risultati.
    8. Fare clic sul pulsante OK per avviare l'analisi DFF. Un grafico DFF apparirà dopo aver completato con successo i passaggi precedenti
      Nota: verranno generati due file di dati. csv. {File di output Peaklist}. csv contiene il precursore m/z, i numeri di scansione e i tempi di conservazione delle scansioni. Questo può essere utilizzato nei moduli MZmine esistenti, compresi i metodi di dati grezzi ≫ rilevamento picco > rilevamento di picco mirato per generare cromatogrammi ionici estratti di precursori che soddisfano i criteri di DFF definiti. {File di output Peaklist} _ data. csv contiene il precursore m/z, il prodotto Ion m/z e i tempi di ritenzione per consentire la generazione di trame DFF al di fuori di mzmine.

3. esempio di uso di DFF per l'analisi di microcistina

  1. Preparazione del campione
    1. Sterilizzare 250 mL di flaconi Erlenmeyer contenenti 30 mL di supporti sterili MA da17 o altri supporti di crescita di cianobatteri (BG-11) dotati di tappo in schiuma.
    2. Inoculare i mezzi di crescita sterilizzati con una coltura di cianobatteri a circa 5 × 105 cellule ml-1 in condizioni asettiche. Monitorare la densità delle cellule con un hemocytometer. In questo esempio, crescere M. aeruginosa ceppo CPCC300 fotoautotrophically a 27 ° c, illuminato con luce fluorescente bianca fredda (30 μe M-2 s-1) utilizzando un 12 h luce: 12 h regime scuro. Swirl le cellule una volta al giorno.
    3. Separare le cellule dal mezzo di coltura dopo 26 giorni di filtrazione sottovuoto utilizzando 47 mm di diametro in fibra di vetro GF/C carta filtro in microfibra.
    4. Aggiungere 3 mL di 80% di metanolo (AQ) alle cellule raccolte in 14 ml di provetta (e).
    5. Vortex e successivamente Sonicare la provetta (s) contenente le cellule di cianobatteri per 30 s ciascuno. Conservare la provetta (e) a-20 ° c per 1 h. riportare la provetta a temperatura ambiente e lasciar scongelare il campione (s) per 15 min.
    6. Ripetere il passo 3.1.5 due ulteriori volte per lizzare efficacemente le cellule.
    7. Filtrare l'Estratto (i) di cellule cianobatteri risultanti attraverso un filtro per siringa in PTFE da 0,22 μm.
    8. Estratto secco (s) con un evaporatore ad una temperatura di 30 ° c utilizzando un flusso delicato di azoto gassoso. Conservare l'Estratto secco a-20 ° c fino all'analisi LC-MS/MS.
    9. Ricostituire il residuo essiccato con 500 μL di 90% di metanolo (AQ) e Vortex per 30 s in un flaconcino di HPLC ambrato prima dell'analisi.
  2. Analizzare l'Estratto di cianobatteri utilizzando un metodo di acquisizione DDA su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione.
    Nota: le condizioni LC-MS ottimizzate per l'analisi MC qui utilizzate sono elencate nella tabella dei materiali.
  3. Preparare i DataFile DDA e importarli in MZmine seguendo i passaggi 1,1 e 1,2.
  4. Selezionare i dati e avviare i moduli DFF seguendo i passaggi 2.1-2.2.
  5. Per l'analisi MC, utilizzare le seguenti impostazioni all'interno del modulo DFF (Figura 3).
    1. Tempo di ritenzione – inserire l'intervallo di 2,00 a 6,00 min.
    2. Precursore m/z – ingresso m/z gamma da 430,00 a 1200,00.
    3. m/z tolleranza – applicare la tolleranza m/z di 0,01 m/z o 3,0 ppm.
    4. Ioni prodotto diagnostico (m/z) – ingresso m/z di 135,0803 a 163,1114, come gli ioni del prodotto diagnostico
    5. Valore di perdita neutra diagnostica (da) – input 0,0 per definire che non vengono utilizzate perdite diagnostiche neutre.
    6. Intensità minima di ioni diagnostiche (% picco base) – utilizzare 15,00 come soglia minima di intensità
    7. File di output Peaklist : definire il file di output come putative_MCs. csv.
  6. Fare clic sul pulsante OK per avviare l'analisi DFF. Un grafico DFF (Figura 4) apparirà dopo aver completato con successo i passaggi precedenti

Risultati

Il grafico DFF generato in seguito all'analisi di M. aeruginosa CPCC300 è mostrato in Figura 4. L'asse xdi questa trama è la m/z degli ioni precursori che SODDISFACEVANO i criteri di DFF definiti mentre l'asse yMostra la m/z di tutti gli ioni di prodotto all'interno degli spettri MCS MS/MS. Per questa analisi, i criteri per il rilevamento MC includevano ioni precursori all'interno della gamma m/z di 440-...

Discussione

DFF è una strategia diretta e rapida per la rilevazione di intere classi di composti, particolarmente rilevanti per la scoperta di composti naturali di prodotti. L'aspetto più importante della DFF è la definizione dei criteri specifici di frammentazione MS/MS per la classe mirata di composti. In questo esempio rappresentativo, DFF è stato utilizzato per rilevare tutti i residui di Adda contenenti MCs presenti in un estratto cellulare M. aeruginosa . Sebbene la stragrande maggioranza dei MCs contenga un resid...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Heather Roshon (centro di cultura Phycologica canadese, Università di Waterloo per aver fornito la coltura di cianobatteri studiata e Sawsan Abusharkh (Carleton University) per l'assistenza tecnica.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Cyanobacteria
Microcystis aeruginosaCPCC300CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRECPCC300https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/
Software
Proteowizard (software)softwarehttp://proteowizard.sourceforge.net/
Mzmine 2softwarehttp://mzmine.github.io/
LC-MS
Q-Exactive OrbitrapThermo-Equipped with HESI ionization source
1290 UHPLCAgilentEquipped with binary pump, autosampler, column compartment
C18 columnAgilent959757-902Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm)
Solvents
Optima LC-MS grade MethanolFisherA456-4
OptimaLC-MS grade AcetonitrileFisherA955-4
OptimaLC-MS grade WaterFisherW6-4
LC-MS grade Formic AcidFisherA11710X1-AMP
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236
Centrifuge Sorvall Micro 21Thermo Scientific75-772-436
Other
Amber HPLC vials 2 mL/capsAgilent5182-0716/5182-0717
0.2-μm PTFE syringe filtersPall Corp.4521
Whatman 47mm GF/A glass microfiber filtersSigma-AldrichWHA1820047
Media
MA media (pH 8.6) ( quantity / L)Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).
Ca(NO3)·4H2O, 50 mgSigma-AldrichC2786
KNO3, 100 mgSigma-AldrichP8291
NaNO3, 50 mgSigma-AldrichS5022
Na2SO4, 40 mgSigma-AldrichS5640
MgCl2·6H20, 50 mgSigma-AldrichM2393
Sodium glycerophosphate, 100 mgSigma-AldrichG9422
H3BO3, 20 mgSigma-AldrichB6768
Bicine, 500 mgSigma-AldrichRES1151B-B7
P(IV) metal solution, 5 mL
Bring the following to 1 L with ddH2O
NaEDTA·2HOSigma-AldrichE6635
FeCl3 ·6H2OSigma-Aldrich236489
MnCl2·4H2OBaker2540
ZnCl2Sigma-AldrichZ0152
CoCl2·6H2OSigma-AldrichC8661
Na2MoO4·2H2OBaker3764
Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater SolutionSigma-AldrichC3061-500mL

Riferimenti

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