Analisi delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana utilizzando sistemi di fermentazione bagno in vitro

Riepilogo

Descritto qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro.

Abstract

I microrganismi intestinali umani sono recentemente diventati un importante obiettivo di ricerca nella promozione della salute umana e nella prevenzione delle malattie. Di conseguenza, le indagini sulle interazioni tra endobiotici (ad esempio, farmaci e prebiotici) e microbiota intestinali sono diventate un importante argomento di ricerca. Tuttavia, gli esperimenti in vivo con volontari umani non sono ideali per tali studi a causa della bioetica e dei vincoli economici. Di conseguenza, sono stati utilizzati modelli animali per valutare queste interazioni in vivo. Tuttavia, gli studi sui modelli animali sono ancora limitati da considerazioni bioetica, oltre a diverse composizioni e diversità di microbiota negli animali rispetto all'uomo. Una strategia di ricerca alternativa è l'uso di esperimenti di fermentazione in batch che consentono di valutare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale in vitro. Per valutare questa strategia, gli esocriteri bifidobatterici (Bif) sono stati utilizzati come xenobiotici rappresentativi. Poi, le interazioni tra Bif EPS e microbiota intestinale umano sono state studiate utilizzando diversi metodi come la cromatografia a strato sottile (TLC), l'analisi compositiva della comunità batterica con il sequenziamento ad alto valore del gene rRNA 16S e la cromatografia a gas di acidi grassi a catena corta (SCFA). Presentato qui è un protocollo per studiare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano utilizzando sistemi di fermentazione in vitro. È importante sottolineare che questo protocollo può anche essere modificato per studiare le interazioni generali tra altri endobiotici e microbiota intestinali.

Introduzione

Il microbiota intestinale svolge un ruolo importante nel funzionamento dell'intestino umano e nella salute dell'ospite. Di conseguenza, il microbiota intestinale è recentemente diventato un importante obiettivo per la prevenzione delle malattie e la terapia¹. Inoltre, i batteri intestinali interagiscono con le cellule intestinali dell'ospite e regolano i processi fondamentali dell'ospite, comprese le attività metaboliche, le disponibilità dei nutrienti, la modulazione del sistema immunitario e persino la funzione cerebrale e il processo decisionale^2,3 . Gli endobiotici hanno un notevole potenziale per influenzare la composizione batterica e la diversità del microbiota intestinale. Così, le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano hanno attirato l'attenzione crescente della ricerca^4,5,6,7,8,9.

È difficile valutare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinali umani in vivo a causa della bioetica e dei vincoli economici. Ad esempio, gli esperimenti che studiano le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinali umani non possono essere eseguiti senza il permesso della Food and Drug Administration, e il reclutamento di volontari è costoso. Di conseguenza, i modelli animali sono spesso utilizzati per tali indagini. Tuttavia, l'uso di modelli animali è limitato a causa di diverse composizioni di microbiota e diversità nelle comunità animali contro umane. Un metodo alternativo in vitro per esplorare le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano è attraverso l'uso di esperimenti di coltura batch.

Gli esopolioaccaridi (EPS) sono prebiotici che contribuiscono in modo significativo al mantenimento della salute umana¹⁰. EPS distinti che consistono in diverse composizioni monosaccoridi e strutture possono presentare funzioni distinte. Le analisi precedenti hanno determinato la composizione degli EPS Bif, che sono la xenobiotica rappresentativa mirata nell'attuale studio¹¹. Tuttavia, gli effetti metabolici associati all'ospite non sono stati considerati per quanto riguarda la composizione e la diversità dell'EPS.

Il protocollo qui descritto utilizza il microbiota fecale di 12 volontari per fermentare gli EPS Bif. La cromatografia a strato sottile (TLC), il sequenziamento ad alta velocità a livello rRNA 16S e la cromatografia a gas (GC) vengono quindi utilizzati in combinazione per studiare le interazioni tra EPS e microbiota intestinale umano. I vantaggi distinti di questo protocollo rispetto agli esperimenti in vivo sono il suo basso costo ed evitare gli effetti interferenti dal metabolismo dell'ospite. Inoltre, il protocollo descritto può essere utilizzato in altri studi che studiano le interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umano.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico dell'Università di Scienza e Ingegneria dell'Università Hunan (Hunan, Cina), e dell'Università di Gongshang dello zhejiang.

1. Preparazione di batteri

1. Preparazione del brodo medio bifidobacterium
   1. Unire i seguenti componenti in 950 mL di acqua distillata: estratto di carne, 5 g/L; estratto di lievito, 5 g/L; peptone di caseina, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glucosio, 10 g/L; K₂HPO₄, 2,04 g/L; MgSO₄x 7H₂O, 0,22 g/L; MnSO₄. H₂0, 0,05 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; soluzione sale, 40 mL (CaCl₂.2H₂O, 0,25 g/L; KH₂PO₄, 1 g/L; NaHCO₃, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); e resazurina, 0,4 mL (2,5 mg/L). Regolare il pH a 6,8 con 2 M NaOH.
   2. Autoclave a 121 gradi centigradi per 15 min e lasciare raffreddare il brodo a temperatura ambiente (RT) in condizioni anaerobiche (10% H₂, 10% CO₂, 80% N₂). Aggiungere cisteina-HCl sterilizzata dal filtro (0,5 g/L) e mupirocina (5 mg/L) al mezzo.
2. Aggiungere un strato di Bifidobacterium longum congelato in un tubo di coltura con 5 mL di brodo medio bifidobacterium in condizioni anaerobiche, quindi coltura in un'incubatrice anaerobica per 24 h a 37 .

2. Preparazione di EPPS bifidobatterici

1. Preparazione del PYG agar medium
   1. Combinare quanto segue: peptone, 20 g/L; estratto di lievito, 10 g/L; glucosio, 5 g/L; NaCl, 0,08 g/L; CaCl₂, 0,008 g/L; MgSO₄x 7H₂O, 0,008 g/L; K₂HPO₄, 0,04 g/L; KH₂PO₄, 0,04 g/L; NaHCO₃, 0,4 g/L; agar, 12 g/L. Regolare il pH a 7,2 utilizzando 10 M NaOH.
   2. Autoclave il supporto a 121 gradi centigradi per 15 min e raffreddare a 50 gradi centigradi. Quindi, per 1 L di media, aggiungere 0,5 mL di vitamina K₁ soluzione sterilizzata a filtro (1 g di vitamina K₁ disciolta in 99 mL del 99% di etanolo), 5 mL di soluzione di ememina (0,5 g di ememina sciolta in 1 mL di 1 mol/L NaOH , poi portato fino a 100 mL con acqua distillata), e 0,5 g di cisteina-HCl.
   3. Prima di versare le piastre PYG, aggiungere 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-3-d-galactopyranoside (X-Gal, 0,06 g/L), LiCl-3H₂O (5,7 g/L) e mupirocina (5 mg/L) al mezzo.
      NOTA: X-Gal e LiCl.3H₂O consentono l'identificazione di colonie B. longum su piastre tramite cambi di colorazione.
2. Inoculare 20 l di ceppi B. longum (fase 1,2) a piastre di PAPAG e collocate in un'incubatrice anaerobica a 37 gradi centigradi per 72 h.
3. Raccogli colonie batteriche mucoidi dalle placche PYG usando un misurino di pesatura, quindi risospendi completamente in 10 mL di salina tampone di fosfato (PBS) utilizzando un oscillatore di vortice.
   NOTA: Le miscele batteriche ed EPS devono essere risospese completamente vortice o pipettando su e giù ripetutamente fino a quando le fibre non saranno completamente dissolte in PBS.
4. Centrifugare la sospensione a 6.000 x g per 5 min.
5. Trasferire con attenzione i supernatanti in un nuovo tubo di centrifuga e mescolare completamente con tre volumi di etanolo freddo 99% per inversione ripetuta e miscelazione.
6. Centrifugare la miscela a 6.000 x g per 5 min e rimuovere completamente i supernatanti.
7. Rimuovere i precipitati dai tubi di centrifuga raschiando e asciugando gli estratti EPS durante la notte utilizzando un vuoto di velocità.

3. Preparazione del mezzo di fermentazione

1. Preparazione della cultura di base medio VI
   1. Combinare quanto segue: peptone, 3 g/L; tryptone, 3 g/L; estratto di lievito, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; sali biliari n. 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl₂s6H₂O, 4,5 g/L; 1 mL Tween 80; CaCl₂.6H₂O, 0,2 g/L; KH₂PO₄, 0,4 g/L; MgSO₄x 7H₂O, 3,0 g/L; MnCl₂x 4H₂O, 0,32 g/L; FeSO₄7H2O, 0,1 g/L; CoSO₄x 7H₂O, 0,18 g/L; CaCl₂x 2H₂O, 0,1 g/L; NSO₄X7H₂O, 0,18 g/L; CuSO₄X5H₂O, 0,01 g/L; e NiCl₂x 6H₂O, 0,092 g/L. Regolare il pH a 6,5 con 1 M HCl.
   2. Preparare l'ememin e la cisteina come fatto nella sezione 2.1 e aggiungere dopo l'autoclaving e il raffreddamento.
2. Preparare i mezzi di coltura che contengono diverse fonti di carbonio con un supporto di base VI. Prima di autoclaving, aggiungere 8 g/L di fibre EPS Bif al VI medio, comprendente il gruppo VI_Bif. Inoltre, aggiungete 8 g/L di amido al vi medio per rappresentare il gruppo VI_Starch. Infine, il VI medio senza aggiunta di una fonte di carbonio viene utilizzato come controllo (gruppo VI).
   NOTA: Bif EPS e amido vengono prima sciolti in acqua calda utilizzando un agitatore magnetico, quindi mescolati con un mezzo VI preparato.
3. Autoclave tutti i supporti a 121 gradi centigradi per 15 min e lasciare raffreddare a RT.
4. Trasferire un sottocampione (5 mL) di ciascun mezzo ai tubi di coltura in un'incubatrice anaerobica, e conservare i supporti rimanenti a 4 gradi centigradi.

4. Preparazione del campione fecale umano

1. Raccogliere campioni fecali freschi immediatamente dopo la defecazione fresca da volontari umani adulti sani utilizzando contenitori feci, e successivamente utilizzare per la preparazione di liquami.
   NOTA: Prima della raccolta dei campioni, tutti i volontari devono essere sottoposti a screening per garantire che non si rilevi la ricezione di antibiotici, probiotici o trattamenti prebiotici per almeno 3 mesi prima della donazione di campioni. Inoltre, tutti i donatori devono fornire un consenso scritto informato.
2. Trasferire un campione fecale fresco (1 g) a 10 mL di 0,1 M anaerobic a PBS (pH 7.0) in becher di vetro, quindi utilizzare aste di vetro per preparare un liquame 10% (w/v).
3. Utilizzare un setaccio di 0,4 mM per filtrare i liquami fecali. Quindi, utilizzare un sottocampione del liquame filtrato per inoculare gli esperimenti di fermentazione della coltura batch e conservare il resto a -80 gradi centigradi per ulteriori analisi.
   NOTA: i passaggi da 4.2 a 4.3 sono condotti in una camera anaerobica.

5. Fermentazione in vitro

1. Aggiungere i liquami fecali filtrati (500) al mezzo di fermentazione preparato al punto 3.2 all'interno di una camera anaerobica, quindi incubare a 37 gradi centigradi.
2. Raccogliere 2 mL di campioni fermentati a 24 h e 48 h nella camera anaerobica e quindi centrificare all'esterno della camera a 6.000 x g per 3 min.
3. Trasferire con attenzione i supernatanti in un nuovo tubo di centrifuga che verrà utilizzato per l'analisi della degradazione del polisaccaride e le misurazioni degli acidi grassi a catena corta (SCFA).
4. Conservare i pellet di centrifugazione a -80 gradi centigradi e successivamente utilizzare per l'estrazione del DNA genomico batterico.

6. Degradazione dell'EPS da microbiota fecale umano

1. Caricare 0,2 l di supernatanti fermentati su piastre di alluminio in alluminio di silice gel-60 TLC pre-rivestite, quindi asciugare con un essiccatore di capelli.
2. Sviluppare le piastre in 20 mL di una soluzione formica acid/n-butanol/water (6:4:1, v:v:v) e asciugare con un essiccatore di capelli.
3. Immergere le piastre nel reagente orcinolo a colorare, quindi asciugare con un essiccatore di capelli.
   1. Preparare i reagenti orcinoli sciogliendo 900 mg di Lichenol in 25 mL di acqua distillata e aggiungendo quindi 375 mL di etanolo. Successivamente, l'acido solforico concentrato deve essere aggiunto lentamente e la soluzione deve essere accuratamente mescolata.
4. Riscaldare le piastre a 120 gradi centigradi per 3 minuti in un forno da forno e valutare la degradazione dell'EPS misurando le bande TLC.

7. Effetti dell'EPS sul microbiota intestinale umano

1. Congelare i campioni fecali originali preparati al punto 4.3 e i campioni fermentati preparati al punto 5.4.
2. Estrarre il DNA genomico batterico (gDNA) da tutti i campioni utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico batterico delle feci seguendo le istruzioni del produttore.
3. Determinare le concentrazioni, le integrazioni e le distribuzioni delle dimensioni del DNA utilizzando un micro-spettrofotometro e un'elettroforesi gel di agar.
4. Condurre LA PCR dei geni di rRNA batterici 16S dal gDNA estratto utilizzando i seguenti primer forward e reverse precedentemente descritti¹²:
   Primer -forward (primer con codice a barre 338F): ACTCCTACGGGCAGCA
   -primer inverso (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
   Utilizzare le seguenti condizioni del ciclore termico:
   1. 94 gradi centigradi per 5 min.
   2. 94 gradi centigradi per 30 s.
   3. 55 gradi centigradi per 30 s.
   4. 72 gradi centigradi per 1 min.
   5. Ripetere 2–4 per 35 cicli
   6. 72 gradi centigradi per 5 min.
   7. 4 C tenere fino alla rimozione dal ciclore termico.
5. Condurre il sequenziamento ad alta velocità di produzione dei prodotti PCR presso un'azienda di sequenziamento del DNA utilizzando l'analisi della comunità microbica ad altissima produttività.
6. Ottenere sequenze pulite e di alta qualità utilizzando il Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) sequence analysis pipeline¹³.
7. Definire unità tassonomiche operative (OTU) per sequenze geniche di rRNA 16S con una somiglianza nucleotide superiore al 97% utilizzando strumenti bioinformatici come la suite software Mothur¹⁴.
8. Scegliere una sequenza rappresentativa da ogni OTU e utilizzare il classificatore RDP insieme al database tassonomico SILVA per classificare le sequenze rappresentative¹⁵.
9. Calcolare la copertura di Good, le metriche sulla diversità alfa (tra cui l'indice Simpson e Shannon) e la ricchezza (numero osservato di OCU) utilizzando gli strumenti bioinformatici¹⁶.

8. Effetti dell'EPS sulla produzione di SCFA da microbiota intestinale umano

1. Aggiungere i supernatanti fermentati (1 mL) preparati al punto da 5,3 a 2 mL dei tubi di centrifuga.
2. Aggiungere 0,2 mL di 25% (w/v) acido metafosoreo a ciascuno dei campioni e mescolare accuratamente le soluzioni vortice.
3. Centrifugare le miscele a 13.000 x g per 20 min e trasferire i supernatanti a tubi freschi.
4. Concomitante, preparare soluzioni di 120 mM acetici, propionici, butirici, isobutirici, valerico e acidi isovalerici. Quindi, aggiungere 1 mL di ogni acido preparato a 1,2 mL di 25% (w/v) acido metafosorica e utilizzare come cocktail standard.
5. Filtrare i campioni utilizzando una membrana di 0,22 M.
6. Rilevare le concentrazioni di SCFA utilizzando la cromatografia a gas ad alte prestazioni secondo i protocolli descritti in precedenza^11,17.
   NOTA: una colonna InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 M) viene utilizzata per la cromatografia a gas (GC). Le concentrazioni di SCFA vengono quindi quantificate in base alle aree di picco utilizzando il metodo standard interno a punto singolo nel pacchetto software GC Solution.

Risultati

La produzione di Mucoid EPS potrebbe essere osservata nelle colture B. longum su piastre PYG dopo l'incubazione anaerobica per 72 h (Figura 1A). La centrifugazione dei graffi di coltura, seguita da precipitazioni enole e essiccazione, ha portato alla raccolta di EPS simili alla cellulosa (Figura 1B). L'EPS essiccato e l'amido solubile sono stati poi utilizzati come fonti di carbonio per le colture di fermentazione. TLC è stato utilizzato per l'analisi ...

Discussione

Sono stati compiuti progressi significativi verso la comprensione della composizione e delle attività del microbiota intestinale umano nell'ultimo decennio. Come conseguenza di questi studi, è emerso il concetto olobionte, che rappresenta le interazioni tra gli ospiti e le comunità microbiche associate, come tra gli esseri umani e il loro microbiota intestinale^19,20. Inoltre, gli esseri umani sono ancora ora considerati come superorganismi^21<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm membrane filters	Millipore	SLGP033RB	Use to filter samples
0.4-mm Sieve	Thermo Fischer	308080-99-1	Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Solarbio	X1010	Use to prepare color plate
Acetic	Sigma-Aldrich	71251	Standard sample for SCFA
Agar	Solarbio	YZ-1012214	The component of medium
Anaerobic chamber	Electrotek	AW 400SG	Bacteria culture and fermentation
Autoclave	SANYO	MLS-3750	Use to autoclave
Bacto soytone	Sigma-Aldrich	70178	The component of medium
Baking oven	Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd	DHG-9240A	Use to heat and bake
Beef Extract	Solarbio	G8270	The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter	ATCC	ATCC® 51870™	Bacteria
Bile Salts	Solarbio	YZ-1071304	The component of medium
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Standard sample for SCFA
CaCl2	Solarbio	C7250	Salt solution of medium
Capillary column	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm)	Used to SCFA detection
Casein Peptone	Sigma-Aldrich	39396	The component of medium
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall ST 8	Use for centrifugation
CoSO4.7H2O	Solarbio	C7490	The component of medium
CuSO4.5H2O	Solarbio	203165	The component of medium
Cysteine-HCl	Solarbio	L1550	The component of medium
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023	Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O	Solarbio	YZ-111614	The component of medium
Formic Acid	Sigma-Aldrich	399388	Used to TLC
Gas chromatography	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Used to SCFA detection
Glass beaker	Fisher Scientific	FB10050	Used for slurry preparation
Glucose	Solarbio	G8760	The component of medium
Haemin	Solarbio	H8130	The component of medium
HCl	Sigma-Aldrich	30721	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric	Sigma-Aldrich	46935-U	Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids	Sigma-Aldrich	129542	Standard sample for SCFA
K2HPO4	Solarbio	D9880	Salt solution of medium
KCl	Solarbio	P9921	The component of medium
KH2PO4	Solarbio	P7392	Salt solution of medium
LiCl.3H2O	Solarbio	C8380	Use to prepare color plate
Meat Extract	Sigma-Aldrich-Aldrich	70164	The component of medium
Metaphosphoric Acid	Sigma-Aldrich	B7350	Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O	Solarbio	M8160	The component of medium
MgSO4.7H2O	Solarbio	M8300	Salt solution of medium
MISEQ	Illumina	MiSeq 300PE system	DNA sequencing
MnSO4.H20	Sigma-Aldrich	M8179	Salt solution of medium
Mupirocin	Solarbio	YZ-1448901	Antibiotic
NaCl	Solarbio	YZ-100376	Salt solution of medium
NaHCO3	Sigma-Aldrich	792519	Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000	NanoDrop Technologies	ND-2000	Determine DNA concentrations
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol	ChemSpider	71-36-3	Used to TLC
NiCl2	Solarbio	746460	The component of medium
Orcinol	Sigma-Aldrich	447420	Used to prepare orcinol reagents
Propionic	Sigma-Aldrich	94425	Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A610100-0001	Used to prepare the lipid suspension
Resazurin	Solarbio	R8150	Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator	LABCONCO	CentriVap	Use to prepare EPSs
Starch	Solarbio	YZ-140602	Use to the carbon source
Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	150692	Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR	BIO-RAD	1861096	PCR amplification
TLC aluminium sheets	MerckMillipore	116835	Used to TLC
Trypticase Peptone	Sigma-Aldrich	Z699209	The component of medium
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293	The component of medium
Tween 80	Solarbio	T8360	Salt solution of medium
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Standard sample for SCFA
Vitamin K1	Sigma-Aldrich	V3501	The component of medium
Vortex oscillator	Scientific Industries	Vortex.Genie2	Use to vortexing
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625	The component of medium
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251	The component of medium