Generazione di una piattaforma di Melanoma Uvenoma Uvenoft umano del fegato in topi immunodeficienti

Riepilogo

I modelli murini xenoma uvea-hettale del fegato umano ortotopico sono stati creati utilizzando tecniche di impianto ortotopico chirurgico con pezzi tumorali derivati dal paziente e tecniche di iniezione di aghi con linee cellulari di melanoma uveale umano coltivate.

Abstract

Negli ultimi decenni, i tumori xenotrapianto derivati dal paziente sottocutanei o le linee cellulari umane coltivate sono stati sempre più riconosciuti come modelli più rappresentativi per studiare i tumori umani in topi immunodeficienti rispetto alle cellule umane tradizionali stabilite linee in vitro. Recentemente, i modelli di xenotrapianto tumorale derivato (PDX) di tipo paziente impiantato ortotopicamente nei topi sono stati sviluppati per replicare meglio le caratteristiche dei tumori dei pazienti. Si prevede che un modello murino xenotrapianto ortotopico del fegato sia un'utile piattaforma di ricerca sul cancro, fornendo informazioni sulla biologia del tumore e sulla terapia farmacologica. Tuttavia, l'impianto del tumore ortotopico del fegato è generalmente complicato. Qui descriviamo i nostri protocolli per l'impianto ortotopico di tumori del melanoma uveoma-metastatico del epatico derivati dal paziente. Abbiamo coltivato linee cellulari del melanoma uveoma metastatico del fegato umano in topi immunodeficienti. I protocolli possono portare a tassi di successo tecnico costantemente elevati utilizzando una tecnica di impianto ortotema chirurgico con pezzi di tumore del melanoma uveale derivato dal paziente o una tecnica di iniezione di ago con linea cellulare umana coltivata. Descriviamo anche protocolli per la scansione TC per rilevare i tumori interni del fegato e per le tecniche di reimpianto utilizzando tumori crioconservati per ottenere una ri-innesto. Insieme, questi protocolli forniscono una migliore piattaforma per i modelli di topo tumorale ortotopico del tumore epatico del melanoma uveale metastatico del fegato nella ricerca traslazionale.

Introduzione

Il melanoma uveale è il tumore maligno intraoculare più comune tra gli adulti del mondo occidentale. Negli ultimi 50 anni, l'incidenza del melanoma uveale (5,1 casi per milione) è rimasta stabile negli Stati Uniti^1,2. Il melanoma uveale deriva dai melanociti nell'iride, nel corpo ciliario o nella contuita, ed è una malattia estremamente letale quando sviluppa metastasi. Il tasso di mortalità dei pazienti con metastasi del melanoma uveale era dell'80% a 1 anno e del 92% a 2 anni dopo la diagnosi iniziale delle metastasi. Il tempo tra la diagnosi delle metastasi e la morte è in genere breve, meno di 6 mesi, senza riguardo alla terapia^3,4. Il cancro si diffonde attraverso il sangue e tende a metastasi dominante al fegato (89-93%)^4,5. Un modello murino efficace è urgentemente necessario per ulteriori indagini sul melanoma uveale metastatico al fegato. Per la ricerca traslazionale, c'è una chiara richiesta di generare un modello di topo melanoma uveaallo metastatico localizzato in fegato.

Si prevede che i modelli murini xenograft tumorale derivato dal paziente (PDX) forniscano strategie di medicina individualizzata. Questi modelli potrebbero essere predittivi degli esiti clinici, essere utili per la valutazione preclinica dei farmaci ed essere utilizzati per studi biologici sui tumori⁶. I modelli PDX rappresentativi sono i topi xenografti impiantati dal tumore, che hanno il tumore nei siti sottocutanei. La maggior parte dei ricercatori può fare un intervento chirurgico per l'impianto sottocutaneo senza pratica speciale^7,8. Possono anche monitorare facilmente i tumori sottocutanei. Anche se i modelli sottocutanei PDX sono diventati popolari nella fase di ricerca, hanno alcuni ostacoli nel passaggio all'uso pratico. L'impianto sottocutaneo costringe i tumori derivati dal paziente ad innestare in un microambiente diverso da quello del tumore, in modo che porti all'insufficienza di innesto e alla lenta crescita del tumore ^{9,10,11, 12,13,14}. L'innesto ortotopico può essere un approccio più ideale e razionale per un modello PDX perché utilizza lo stesso organo del tumore originale^15,16.

Recentemente, abbiamo sviluppato protocolli per tecniche di impianto ortotopico chirurgico di tumori del melanoma uveoma metastatico del paziente e tecniche di iniezione dell'ago con una linea di cellule del melanoma uveostatico epatico-metastatico umano in NOD. Cg-Prkdc^{ha scritto}il il2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) topi^17,18. I protocolli si traducono in tassi di successo tecnico costantemente elevati. Abbiamo anche stabilito tecniche di tac che sono utili per rilevare i tumori interni del fegato, e abbiamo sviluppato il reimpianto di tumori crioconservati nella piattaforma PDX. Abbiamo scoperto che i modelli di xenotrapianto del melanoma uveale mantengono le caratteristiche del tumore epatico originale del paziente, comprese le loro caratteristiche istopatologiche e molecolari. Insieme, queste tecniche forniscono una migliore piattaforma per i modelli di tumore ortotopico del fegato per il melanoma uveale nella ricerca traslazionale.

Protocollo

I pazienti arruolati nello studio dovrebbero fornire il consenso scritto che consente l'uso di campioni chirurgici scartati a fini di ricerca e studi genetici, secondo un protocollo approvato dal Consiglio di revisione istituzionale. Questo protocollo è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio degli Istituti nazionali di salute e approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).

1. Raccolta di tessuti tumorali di origine del paziente fresco

1. Ottenere il tessuto tumorale derivato dal paziente dalla chirurgia o una biopsia dell'ago in una sala operatoria ospedaliera.
2. Mettere il tessuto tumorale in un contenitore da 100 mL contenente su ghiaccio la soluzione di sale bilanciato di Hanks (HBSS).
3. Trasferire il tessuto in una cappa sterile (livello di biosicurezza 2) in laboratorio.
4. Procedere al passaggio 2 il più presto possibile.
   NOT: Per motivi di sicurezza, escludere i pazienti con infezioni da HIV o epatite B o C note.

2. Elaborazione del tessuto tumorale fresco derivato dal paziente

1. Mettere il tessuto in un tubo da 50 mL contenente su ghiaccio la salina con buffer fosfato (PBS). Per lavare il tessuto, aggiungere PBS nel tubo e scartare la PBS dal tubo due volte.
2. Trasferire il tessuto in un piatto Petri contenente PBS sul ghiaccio.
3. Utilizzando pinze sterili e forbici, rimuovere le parti necrotiche del tessuto. Mantenere il tessuto umido e freddo durante i passaggi da 2.3 a 2.5. Per i campioni di biopsia dell'ago, saltare i passaggi 2.3 e 2.5 e non tagliare i campioni.
   NOT: Il tessuto necrotico spesso si rompe facilmente quando viene toccato.
4. Tagliare il tessuto in 1 mm³ cubetti per l'impianto chirurgico del fegato.
5. Tagliare il resto del tessuto a cubetti da 2 mm nel piatto Petri.
6. Trasferirli in un microtubo da 1,7 mm con 4% di formalina per l'analisi istologica e a un altro tubo per l'analisi genomica e proteomica.
7. Mettere i microtubi in un barattolo di azoto liquido con azoto liquido. Trasferire i tubi in un congelatore a -80 gradi centigradi per un deposito permanente.
   NOT: Il tempo che intersea il trattamento del campione viene rimosso dal paziente e quello dei tessuti non deve superare i 30 min.

3. Impianto chirurgico del fegato con tessuto tumorale derivato dal paziente

1. Spruzzare tutti gli oggetti che entrano nel cofano per un intervento chirurgico con 70 % alcol etilico.
   NOT: Questo include strumenti chirurgici, pastiglie di riscaldamento e macchine per anestesia.
2. Misurare il peso di un tampone di cotone e foglio di tessuto.
3. Anestesizzare un topo con un vaporizzatore isoflurano del 3-5% posizionandolo nella camera di induzione.
4. Una volta che il mouse è completamente anetizzato, posizionarlo in posizione supina su un pad di riscaldamento. Posizionare il cono isoflurane sul muso del topo per inalare 1,5-3% isoflurane per la manutenzione dell'anestesia.
   NOT: Il mouse deve essere sul pad di riscaldamento durante l'intera procedura. La mancanza di riscaldamento può causare ipotermia.
5. Confermare l'anestesia corretta senza reazioni quando il piede del topo è pungente con pinze ultrafini.
6. Iniettare la buprenorfine (0,6 mg/kg) sottocutaneamente sul fianco utilizzando un ago da 27 G su una micro siringa prima dell'intervento chirurgico.
7. Applicare il 70% di alcool etilico all'addome e diffondere la pelliccia verso l'alto e verso il basso. Dopo aver diffuso la pelliccia, confermare una visualizzazione più facile della pelle sotto l'area subcostale sinistra per un taglio più facile. Non radere la pelliccia dall'addome.
   NOT: La pelliccia nasconderà il sito di incisione dopo l'intervento chirurgico e impedirà al mouse di graffiare l'operazione post incisione. Tuttavia, è possibile radere la pelliccia per prevenire l'infezione del sito di incisione secondo gli standard istituzionali.
8. Applicare lo iodio e lasciarlo assorbire nella pelle.
9. Posizionare un drappo chirurgico sterile con un foro di 2 cm sul mouse.
10. Sollevare la pelle addominale con pinze ultrafini curve e fare un'incisione subcostale sinistra di 1 cm con forbici curve.
11. Inserire la punta delle forbici curve sotto la pelle dell'incisione e aprirle leggermente per separare il peritoneo dalla pelle. Ritirare le forbici dall'incisione con lame chiuse.
    NOT: L'apertura e la chiusura delle forbici all'interno del mouse può causare danni e sanguinamento.
12. Individuare il fegato sotto il peritoneo. Confermare un colore rossastro scuro attraverso il peritoneo.
13. Con le forbici curve, fai un'incisione trasversale di 1 cm nel peritoneo. Se un'arteria peritoneale sanguina dal tagliente, fermare immediatamente l'emorragia con cavolo.
14. Afferrare il tessuto adiposo utilizzando pinze ultrafini curve con una mano, inserire il bordo di un tampone di cotone sotto il lobo del fegato sinistro e rotolare il tampone verso il basso con l'altra mano per far emergere il fegato.
    NOT: Afferrare il tessuto adiposo è importante per mantenere il tessuto adiposo di attaccarsi al tampone di cotone.
15. Esternare il fegato sul tampone di cotone e posizionare il fegato su un foglio di tessuto assorbente non tessuto.
    NOT: Il foglio di tessuto svolge due ruoli essenziali nella stabilizzazione del fegato e nell'assorbimento dell'emorragia.
16. Fare un'incisione 5 mm di larghezza e profondità utilizzando una lama di bisturi no.
    1. Inserire la lama in parallelo con la superficie del fegato e tagliare orizzontalmente.
    2. Premere il sito di incisione con il tampone di cotone per fermare qualsiasi emorragia.
       NOT: Non mantenere la lama verticale, altrimenti si romperà attraverso il fegato e ferire grandi vasi nel mezzo del fegato.
17. Arrotolare il tampone di cotone verso l'alto per aprire il sito di incisione e impiantare un 1 mm³ cubo di tessuto tumorale nella tasca con pinze ultrafini curve. Ritrarre le pinze mentre si rotola il tampone di cotone in rotazione inversa e premere verso il basso.
    NOT: Premendo verso il basso sul sito di incisione con il tampone di cotone durante la ritrazione delle pinze aiuta a prevenire lo spostamento del tumore all'interno della tasca.
18. Togliere delicatamente il tampone di cotone dal sito di incisione dopo l'impianto. Procedere al passaggio 3.19 il prima possibile.
19. Mettere un hemostat assorbebile sul sito di incisione.
20. Confermate l'emostasi. Se il sanguinamento continua, aggiungere più emotostato sul sito di incisione.
21. Sbucciare il fegato dal foglio di tessuto con le pinze (preferibilmente contundenti) e riporre il fegato nella cavità addominale.
22. Peritoneo di sutura con doppia legatura utilizzando una sutura assorbibile 5-0.
23. Pelle di sutura con tripla legatura utilizzando una sutura assorbibile 5-0.
    NOT: La tripla legatura aiuta a prevenire la dehiscence dell'incisione chirurgica.
24. Osservare il mouse fino a quando completamente sveglio e rimetterlo nella gabbia.
25. Misurare il peso del tampone di cotone e il foglio di tessuto con sangue per il volume di sanguinamento durante l'intervento chirurgico. Confrontali con i loro pesi originali prima dell'intervento chirurgico. Ridurre il sanguinamento durante l'intervento chirurgico a meno del 10% del volume sanguigno circolante nel topo.

4. Raccolta ed elaborazione di fegato umano colto metastatico uveale Melanoma linea cellulare

1. Preparare le cellule coltivate.
2. Raccogliere le celle e calcolare il numero di cella utilizzando un contatore di celle.
3. Preparare una quantità appropriata di sospensione cellulare per 10,0 x 10⁶ celle in un tubo da 15 mL.
4. Girare il tubo a 300 x g per 5 min in una centrifuga a temperatura ambiente.
5. Rimuovere il supernatante nel tubo da 15 mL. Lasciare il pellet cellulare nella parte inferiore del tubo.
6. Aggiungere 50 -L di RPMI 1640 medio in un tubo da 1,7 mL.
7. Tagliare la punta di una punta da 200 litri con le forbici per ingrandire l'apertura della punta.
8. Aggiungete 60 l di matrice di membrana interrata utilizzando una pipetta con la punta tagliata nel tubo da 1,7 mL con RPMI.
9. Mescolare RPMI e matrice nel tubo da 1,7 mL. Vortice esso.
10. Aggiungere 110 l' della miscela nel pellet cellulare nel tubo da 15 mL. Trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 1,7 mL.
11. Tenere il tubo sul ghiaccio prima dell'iniezione dell'ago.

5. Impianto chirurgico dell'ago dell'uomo colto Metastatico Uveal Melanoma Cell Line nel fegato

1. Seguire il protocollo precedente dai passaggi da 3.1 a 3.15.
2. Raccogliere la sospensione cellulare con un microsiringe con un ago 27 G.
3. Inserire l'ago lungo la superficie del fegato e far avanzare la punta dell'ago 5 mm più in profondità.
4. Iniettare 20 - L di sospensione cellulare nel fegato.
5. Cauterizzare il punto di inserimento del fegato per evitare che le cellule iniettate fuoriescano. Confermate l'emostasi.
6. Seguire il protocollo precedente dai passaggi da 3.21 a 3.24.

6. TAC

1. Posizionare il mouse in un restrainer nello stato di veglia.
2. Pulire la coda con un tampone alcolico sterile per la disinfezione e la vasodialazione.
3. Iniettare 100 l di agente di contrasto TC attraverso la vena posteriore con un ago da 27 G su una siringa da 1 mL.
4. Attendere 4 h dopo l'iniezione prima di eseguire la TAC.
   NOT: Ci vogliono 4 h fino a quando l'agente è preso da fegato Kupffer cellule.
5. Quattro ore dopo l'iniezione, anestesizzare il topo portatore di tumore con 3-5% isoflurane vaporizzato mettendolo nella camera di induzione.
6. Una volta che il topo è completamente anetizzato, posizionarlo nella posizione prona su un CT. Posizionare il cono di isoflurane sul muso del mouse per inalare 1.5-3% isoflurane per il mantenimento dell'anestesia.
7. Confermare l'anestesia corretta senza reazioni quando il piede del topo è pungente con pinze ultrafini.
8. Fai una TAC per 15 min.
9. Assicurarsi che il mouse fino a quando non è completamente svegliato dopo la TAC e rimetterlo nella gabbia.
10. Valutare per l'esistenza del tumore e misurare la dimensione del tumore sulle immagini TC.
    NOT: L'agente di contrasto migliora il parenchyma epatico normale in modo che sia facile riconoscere il tumore non migliorato. Non fraintendere la cistifellea e lo stomaco come tumore.

7. Raccolta e lavorazione dei tessuti

1. Topi eutanasi che utilizzano CO₂ seguito da lussazione cervicale posizionando l'indice e il pollice dietro il cranio e tirando il corpo dalla base della coda. Procedere al passaggio 7.2 il prima possibile.
2. Posizionare il topo in posizione supina e spruzzare l'addome con il 70% di alcool etilico.
3. Utilizzare pinze sterili e forbici sterili per fare un'incisione trasversale di 3 cm sotto il processo xifoide per esporre gli organi addominali.
4. Acciso il tessuto tumorale ed eseguire i passi da 2.1 a 2.2.
5. Tagliare il resto del tumore a cubetti da 2 mm nel piatto Petri.
6. Trasferirli in un tubo criogenico con criomedio per il reimpianto dopo la crioconservazione.
7. Mettere i tubi in un contenitore di congelamento criogenico riempito con isopropanolo.
8. Trasferire il contenitore in un congelatore a -80 gradi centigradi per l'immagazzinamento temporaneo. Non mettere i criotubi con criomeme direttamente in un serbatoio di azoto liquido. Congelarli lentamente ad un tasso di raffreddamento di -1 oC/min per preservare il tessuto tumorale.
9. Il giorno successivo, trasferire i tubi in un serbatoio di azoto liquido per lo stoccaggio permanente.

8. Reimpianto

1. Conservare i tubi congelati in un barattolo di azoto liquido con azoto liquido fino a quando non sono pronti per l'impianto del tessuto. Ridurre al minimo l'esposizione del tessuto alla temperatura ambiente per mantenere la vitalità e migliorare le possibilità di innesto.
2. Scongelare tubo crioconservato in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
3. Eseguire i passaggi 2.2–2.4.
4. Impiantare il tumore scongelato nei topi come descritto nei passi da 3.1–3.24.

Risultati

L'impianto ortotopico chirurgico con il metodo della tasca del fegato può trapiantare il tumore al melanoma uveama metastatico umano nel fegato di topo con un alto tasso di successo dell'80% entro sei mesi. Il tumore xenotrapianto innesta nel fegato come un tumore solitario senza noduli figlia (Figura 1 e Figura 3A). La tecnica di iniezione ortotopica chirurgica nel fegato utilizzando microaghi con successo engrafted coltivato c...

Discussione

Gli attuali modelli di xenotrapianto ortotopico sono laboriosi, dispendiosi in termini di tempo e costosi da creare. Modelli di topoxenotrapianto tumore ortotopico per il cancro del fegato sono stati stabiliti più di due decenni fa^19,20,21. Tuttavia, questa tecnica è complicata e richiede l'uso di attrezzature speciali, come un supporto micro-aghi e da 6-0 a 8-0 suture fini al microscopio. Il tumore e il tessuto epatico normal...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent)	Miltenyl Biotec	130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium	Corning	21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver			All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane	Purdue Products	67618-150-17
Isopropanol	Fisher scientific	A416-1	Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC	BD	354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Jackson Lab	5557	4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium	Corning	21-031-CM
RPMI 1640	Corning	10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)	Nice-Pak products	B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution	Wako	163-20145
70% Ethyl alcohol solution	Fisher Scientific	04-355-122
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Absorbable hemostat	Johnson and Johnson	63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery	Bovie Medical	MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container	NALGENE	5100-0001
Cryotube	SARSTEDT	72.379
Curved scissors	World Precision Instruments	503247
Curved ultrafine forceps	World Precision Instruments	501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister	Harvard Apparatus	600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer	Artisan Scientific	66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar	Thermo Fisher Scientific	2123
Micro-CT scan	Siemens
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Petri dishes	Fisher Scientific	FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood			Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel	AD Surgical	A300-11-0
Straight forceps	World Precision Instruments	14226
Surgical drape
Tail vein restrainer	Braintree Scientific	TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle	BD	309623
1.7 mL tube	Bioexpress	C-3260-1
5-0 PDO Suture	AD Surgical	S-D518R13
15 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9152N
27 G needle	BD	780301
27 G needle	Hamilton	7803-01
50 mL conical tubes	AZER SCIENTIFIC	ES-9502N
50 µL micro syringe	BD	80630
50 µL micro syringe	Hamilton	7655-01
100 mL container	Fisher Scientific	12594997
200μL tip