Una tecnica di lesione mini-invasiva per i muscoli intrinseca all'odontoia di Aplysia californica

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per la parte chirurgica minimamente invasiva dei muscoli intrinseci all'apparato alimentare del mollusco marino Aplysia californica per comprendere i ruoli di questi muscoli durante il comportamento di alimentazione.

Abstract

Aplysia californica è un sistema modello per studiare il controllo neurale dell'apprendimento e del comportamento. Questo animale ha un sistema circolatorio semi-aperto, che consente di accedere a molte delle sue strutture interne senza causare danni significativi. Molte manipolazioni possono essere facilmente eseguite sia in vivo che in vitro, rendendolo un modello altamente trattabile per l'analisi del comportamento e dei circuiti neurali. Per comprendere meglio le funzioni dei muscoli all'interno dell'alimentazione grasper, abbiamo sviluppato una tecnica per litigersenza di litigare senza aprire la cavità del corpo principale dell'animale o danneggiare gli strati esterni dell'organo di alimentazione (cioè la massa buccale). In questa tecnica, il grasper è parzialmente evitato, consentendo l'accesso diretto alla muscolatura. Questa procedura consente agli animali di recuperare rapidamente e in modo affidabile. Questo ha permesso di lesionare i muscoli I7 e le fibre sub-radulari, permettendoci di dimostrare che entrambi i muscoli contribuiscono in modo significativo all'apertura in vivo.

Introduzione

Il sistema di alimentazione di Aplysia californica ha una lungastoria di utilizzo come sistema modello per comprendere l'apprendimento e la memoria 1, comportamenti motivati^2,3, e l'interazione tra comportamento, biomeccanica e controllo neurale durante l'alimentazione⁴. Ha circuiti neurali altamente accessibili, con un numero relativamente piccolo di grandi neuroni identificabili. L'animale ha un sistema circolatorio semi-aperto, che consente di accedere a molte delle sue strutture interne senza causare danni significativi. È anche robusto per molte manipolazioni sia in vivo che in vitro, rendendolo un modello altamente trattabile per l'analisi del comportamento e dei circuiti neurali.

Per comprendere i modelli neurali che danno origine a comportamenti di alimentazione, è importante descrivere la meccanica sottostante della struttura morbida che costituisce l'organo di alimentazione, la massa buccale⁴. Mentre è stato fatto del lavoro per caratterizzare i muscoli esterni che compongono la massa buccale^5,6, i muscoli interni della struttura sottostante all'interno della massa buccale che controlla la superficie del grasper, l'odontofo, sono stati in gran parte inaccessibile alla sperimentazione in vivo. Anche se ci sono stati studi in vitro sulle funzioni di alcuni di questi muscoli^7,8, la mancanza di accesso diretto a questi muscoli ha reso difficile studiare il loro ruolo in animali intatti e comportarsi.

La maggior parte delle tecniche per l'impianto di elettrodi o lesioni in Aplysia o specie di molluscan simili richiedono che la parete del corpo sia aperta^9,10,11,12. L'apertura della parete del corpo provoca lesioni epiteliali e l'incisione deve essere sigillata in modo sicuro per evitare la fuga da emolinfa. Ancora più gravi difficoltà sono poste quando si tenta di raggiungere i muscoli interni della grasper di Aplysia (muscoli alla base della superficie ralalare o all'interno dell'odontoforo): dopo essere entrati attraverso la cavità del corpo principale, si deve poi passare attraverso alcuni parte della parete muscolare della massa buccale per ottenere l'accesso alle strutture interne (Figura 1A). Questa lesione accumulata e la difficoltà di accesso hanno reso problematico l'approccio attraverso i mezzi convenzionali perché gli animali non si riprendono bene da questi interventi chirurgici (di animali con eversioni complete, solo il 17% ha riacquistato alcuna capacità di alimentazione, N - 12. Circa l'85% degli animali non eversi ha riacquistato la capacità di nutrirsi, N - 84).

Il muscolo I7, che è stato caratterizzato come un'apertura radulare⁸, è profondo all'interno dell'odontoforo stesso, complicando ulteriormente l'accesso. Si estende tra la base del gambo ralalalare (Figura 1C) e la parte inferiore della superficie radulare, attraverso un lume nell'odontoforo (Figura 1C). Su tre lati dei muscoli I7 sono pareti del muscolo, e la quarta parete è costituita dal gambo ralalare. Ai fini di uno studio biomeccanico, una grave compromissione di una qualsiasi di queste strutture comprometterebbe la normale funzione dell'apparato alimentare. Abbiamo sviluppato un nuovo approccio di lavorare l'odontoforo attraverso le mascelle, e condurre l'intervento chirurgico attraverso un'incisione alla sottile superficie rapulcolare cartilaginea, che ha reso possibile lesione del muscolo I7, così come le fibre muscolari fini appena descritte che appena sotto la superficie radulare, che si riferisce come le fibre sub-radulari (Figura 1C).

Figura 1: Panoramica anatomica. (A) Posizione della massa buccale all'interno dell'Aplysia. (B) Anatomia esterna dell'odontoforo. La superficie della radula e del sacco ralaare sono gialle; i muscoli che compongono l'odontoforo sono mostrati in rosso, in base ai loro colori reali. (C) Sezione sagittale dell'odontotoiatorio, che mostra la posizione delle fibre sub-radulari (linea rosa curva) e del muscolo I7 (linea rosa dritta). La sezione trasversale del muscolo I6 è mostrata in rosso scuro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

Aplysia sono invertebrati e quindi non sottoposti all'approvazione IAUC. Per ridurre al minimo il disagio per gli animali, assicurarsi che siano completamente anestesizzati prima di applicare le tecniche chirurgiche descritte di seguito.

1. Selezione e anestesizzazione degli animali

1. Selezionare un animale attivo offrendogli alghe e confermando che gli intervalli di morso non sono maggiori di 3 e 5 s.
2. Anestetizzare l'animale con 0,333 cloruro di magnesio molare (vedi Tabella 1) iniettando vicino alla testa con un ago da 18 G su una siringa da 60 mL in modo che la più alta concentrazione di anestetico sia intorno alla massa buccale.
   1. Fare attenzione a penetrare sia l'epitelio esterno che lo strato di tessuto interno con l'ago. Assicurarsi che l'iniezione sia approssimativamente sotto il rinoforo, a metà strada tra il rinoforo e il piede, e l'ago deve entrare obliquamente, puntando nella direzione delle mascelle.
3. Dopo 10 min, tentare delicatamente di inserire un perno nella branchia e nel rinoforo, verificando che questi non si ritraggano, per garantire un'anestesizzazione sufficiente.
4. Assicurarsi che le labbra e la mascella della lumaca siano rilassate in modo che l'odontoforo possa essere esposto.
   NOT: L'affarmatite sulle labbra della Figura 2A indica che le labbra e la mascella dell'animale non sono sufficientemente rilassate da eseguire senza danni la procedura chirurgica. Le labbra lisce e rilassate della Figura 2B indicano che le ganasce sono completamente rilassate.

Figura 2: Tensione e relax nelle bocche di Aplysia anestesizzate. (A) Aplysia che mostra un alto grado di tensione muscolare intorno alle labbra. Questo correla con la tensione della mascella e controindica procedendo con l'intervento chirurgico. (B) Aplysia con labbra rilassate, mostrando l'interno delle mascelle (grigio chiaro). I colori corrispondono di nuovo a quelli osservati nell'animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Se le labbra di un animale non sono rilassate, iniettare altri 30 mL di cloruro di magnesio e attendere altri 5 min. Se questo non si traduce in rilassamento delle labbra, riportarli in un contenitore isolato con un buon flusso d'acqua per consentire loro di recuperare (vedi punto 4) e procedere con un animale diverso.

2. Esposizione della superficie radulare

1. Posizionare la lumaca in modo che la testa penda verso il basso, permettendo alla massa buccale di depositarsi contro le mascelle.
2. Applicare la pressione con il pollice e l'indice per spingere la massa buccale verso le mascelle, tenendo la massa buccale in posizione.
3. Ruotare le ganasce in modo che siano visibili. Allo stesso tempo, mantenere la pressione sulla massa buccale in modo che la prua della massa buccale sia visibile attraverso le mascelle. (Figura 3).

Figura 3: Sostenere la massa buccale contro l'interno dello squalo. Le dita sostengono la massa buccale che è stata spinta contro il bordo interno delle mascelle fino a quando non si vede la punta della prua. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Lavorare delicatamente le punte delle pinze smussate nella fessura dell'odontofolo e usarle per levigare la superficie radulare attraverso le mascelle. Se le mascelle non sono sufficientemente rilassate, utilizzare le pinze per afferrare delicatamente il bordo della fessura per assistere questo processo.
   ATTENZIONE: Questa pressione rischia di danneggiare maggiormente l'animale.
5. Una volta che la superficie è esposta, lavorare le mascelle fuori dalla parte anteriore della superficie ralalare tutto intorno al perimetro. Questo rende l'odontoforo meno probabilità di ritrarsi (Figura 4). Assicurarsi che non più della metà delle pareti dell'odontoforo sia esposta.

Figura 4: Eversione parziale dell'Odontoforo. La superficie radulare è completamente esposta, ma i lati dell'odontoforo non sono scoperti, rendendo questa solo un'eversione parziale. Un'ulteriore eversione probabilmente comporterà danni all'animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOT: Una completa eversione dell'odontofolo causerà gravi danni muscolari da cui gli animali sono molto lenti a recuperare.

3. Incisioni chirurgiche

1. Una volta che la superficie ralalalare è completamente esposta, disporre la lumaca sotto un margine di dissezione per l'intervento chirurgico.
   1. In alternativa, utilizzare un elastico largo e una terza mano per stabilizzare le mascelle e la superficie ralalare per l'intervento chirurgico, soprattutto durante l'apprendimento. Questo, tuttavia, aggiunge tempo e aumento dei danni ai tessuti alla procedura, il che lo rende meno ideale a lungo termine.
2. Posizionare la superficie radulare in modo che il lato fessura faccia l'investigatore.
3. Afferrare delicatamente la superficie radulare, vicino alla base radulare, in modo che si formi una piega orizzontale perpendicolare alla piega anatomica. Utilizzare le forbici fini per tagliare questa piega, facendo un'incisione lungo la piega anatomica (Figura 5).

Figura 5: Posizione dell'incisione nella superficie radulari. (A) Superficie radulare, con incisione. (B) Superficie radulare con cerchi che mostrano dove si attaccano i fili del muscolo bilaterale I7; Le linee tratteggiate mostrano la posizione dei muscoli discendenti sotto la superficie radolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Estendere questa incisione iniziale a 3-5 cm per consentire l'accesso all'interno della massa buccale.
5. Regolare la luce in modo che punti direttamente indietro attraverso questa incisione.
6. Parte i bordi dell'incisione in modo che la parte posteriore del lume dell'odontofolo e i sottili fili verticali del muscolo I7 sono visibili. (Figura 6)

Figura 6: Posizione di I7 attraverso l'incisione della superficie radulara. Guardando attraverso l'incisione, entrambi i fili di I7 possono essere visti tra le superfici interne di I4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Raggiungere attraverso l'incisione, afferrare entrambi i fili di I7, e tirarli verso l'alto attraverso l'incisione, dove per quanto il muscolo può essere tagliato via come è pratico (Figura 7).

Figura 7: Tirando il Filo muscolare I7 attraverso l'incisione. Il muscolo I7 è altamente elastico e può essere tirato verso l'alto attraverso l'incisione per la rimozione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NOT: Con la pratica, di solito è più efficace individuare I7 da sentire che a vista.

4. Assistenza post-operatoria

1. Dopo che le lesioni sono state eseguite, afferrare i tentacoli anteriori e spingere verso il basso sulla superficie radulare per riportare la lumaca alla sua configurazione originale.
2. Posizionare gli animali post-chirurgici in un ambiente protetto con un buon flusso d'acqua. L'aumento dell'ossigenazione accelera il recupero. Assicurarsi che gli animali siano attenti e reattivi il giorno dopo l'intervento chirurgico. In caso contrario, si può presumere che non verranno ripristinati.
   NOT: Gli animali di solito iniziano a nutrirsi il primo o il secondo giorno dopo l'intervento chirurgico. Anche gli animali che hanno difficoltà a mordere dovrebbero essere offerti alghe, come è nostra osservazione aneddotica che il recupero di un animale è migliorata dai suoi tentativi di mangiare.

5. Per lesione in fibra sub-ralalalalalari

1. Seguire i passaggi da 1.1 a 3.5
2. Inserire la punta di una piccola lama del bisturi dritta (#11 o simile) attraverso l'incisione con il bordo tagliente inclinato verso l'alto. Raschiare delicatamente le fibre muscolari fini dalla parte inferiore della superficie radulare. (Figura 8).

Figura 8: Lesioning le fibre subradulari. Il bordo della lama del bisturi è inclinato verso l'alto attraverso l'incisione fino alla parte inferiore della superficie radulare in modo che possa raschiare delicatamente via le fibre sub-radulari. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Tornare al passaggio 4.1.

Risultati

Il lavoro precedente aveva suggerito che il muscolo I7 ha contribuito all'apertura del grasper⁸. I nostri studi anatomici hanno suggerito che le fibre sub-radulari potrebbero anche contribuire all'apertura di grasper. Per testare queste ipotesi, gli animali sono stati indotti a generare morsi sia prima che dopo aver ricevuto una procedura chirurgica. Gli animali di finzione sono stati sottoposti a tutti i passaggi chirurgici, compresa l'incisione nella superficie radulare, ma non sono stati rimossi i muscoli interni. Gli animali sottoposti a una lesione I7 hanno avuto entrambi i muscoli I7 rimossi. Gli animali sottoposti a una lesione sub-radulare in fibra hanno fatto rimuovere immediatamente sotto l'incisione il 25% delle fibre sub-radulari. Le lesioni sham non hanno avuto alcun effetto significativo sulla larghezza dell'apertura al picco di mordere, mentre entrambe le lesioni fibre I7 e sub-ralalari hanno ridotto significativamente la larghezza del morso (Figura 9).

Figura 9: Risultati delle lesioni sulla larghezza di apertura durante la mora di picco. I dati mostrati sono le differenze tra la larghezza media di apertura normalizzata della radula prima e dopo la procedura chirurgica per 5 animali in ciascuno dei 3 gruppi (sham, lesione I7 o lesione SRF), con ogni animale che funge da proprio controllo. Le medie sono state prese di 5 morsi prima, e 5 morsi dopo la procedura chirurgica per determinare la differenza media normalizzata. La larghezza di apertura era la distanza dal centro della radula al bordo ralalare alla protrazione del picco, normalizzata dalla distanza dalla superficie interna della base radulare ai bordi del lato fessura della superficie radulare. Le differenze sono indicate come mezzi più o meno la deviazione standard. Dopo aver stabilito che i dati di differenza sono stati normalmente distribuiti, è stata determinata la probabilità che la lesione non abbia avuto alcun effetto (cioè è stata testata l'ipotesi nulla che gli effetti delle procedure chirurgiche sarebbero pari a zero, in media) applicando un t-test per ogni gruppo indipendente. I dati dimostrano che la lesione fittizia non ha avuto alcun effetto significativo, mentre una lesione dei muscoli I7 o una lesione delle fibre sub-radulari hanno avuto un effetto significativo sull'apertura radulare (p < 0.031 per il gruppo di lesione I7, indicata con un singolo asterisco, indicata con un singolo asterisco, indicata con un singolo asterisco, indicata con un singolo asterisco o p < 0.002 per il gruppo di lesioni SRF, indicato da un doppio asterisco). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Peso corporeo	Dose di Cloruro di Magnesio
<200 g	1/2 peso corporeo
200-350 g	1/3 peso corporeo
350-450 g	1/4 peso corporeo

Tabella 1: Dosaggio di cloruro di magnesio per peso corporeo.

Discussione

I passaggi più critici all'interno del protocollo sono la necessità di garantire che l'animale sia completamente anetizzato e che l'eversione della massa buccale sia sufficiente per accedere ai muscoli sottostanti. Può richiedere una certa pratica per perfezionare questi passaggi, ma una volta che sono padroneggiati, il rendimento da interventi chirurgici è probabile che sia superiore all'85% di tutti gli esperimenti fatti. Il modo più importante per modificare e risolvere correttamente il protocollo è quello di trascorrere del tempo facendo dissezioni della massa buccale in modo che le posizioni dei muscoli interni siano completamente chiare per lo sperimentatore. Poiché l'incisione suggerita attraverso la superficie ralalare provoca inevitabilmente alcuni danni alle fibre sub-ralalari sottostanti, può essere opportuno modificare l'esatta posizione dell'incisione per evitare specifiche regioni di queste fibre.

Una limitazione della tecnica chirurgica è che può avere effetti non specifici sulle risposte di alimentazione, come la forza della protrazione. Un modo per superare questa limitazione è far servire gli animali come propri controlli. Inoltre, è fondamentale avere un gruppo di lesioni fittizie che è sottoposto all'intero protocollo chirurgico ad eccezione della rimozione del muscolo specifico (cioè I7 o SRF). Seguendo questi suggerimenti, uno sperimentatore ridurrà gli effetti della variabilità tra gli animali e avrà una misura intrinseca degli effetti non specifici della chirurgia.

Il lavoro precedente ha utilizzato approcci attraverso la parete del corpo per lesione o registrare da nervi^13,14, o muscoli^15,16,17. Nel nostro laboratorio, abbiamo osservato aneddoticamente che le incisioni delle pareti del corpo sono spesso accompagnate da una significativa perdita di emolina e quindi del volume corporeo. Gli animali spesso richiedono diversi giorni per recuperare da questo, e se la lesione della parete del corpo non è accuratamente suturata, gli animali non possono recuperare. Inoltre, l'esame post-mortem degli animali rivela notevoli cicatrici intorno all'incisione e una forte risposta immunitaria (osservazioni aneddotiche). Al contrario, gli animali non mostrano alcuna perdita di emolina o variazione del volume corporeo dopo il recupero dal protocollo qui descritto (sulla base di osservazioni in 96 animali).

Le future applicazioni della tecnica possono estenderlo ad altri muscoli all'interno dell'apparato alimentare dell'Aplysia e ad altri animali. Ci siamo concentrati sulla rimozione del muscolo I7 e delle fibre sub-radulari. Queste stesse tecniche chirurgiche generali consentono anche l'accesso alla maggior parte degli altri muscoli dell'odontoforo. Alcuni di questi, come la parte interna del muscolo I5, sono meglio accessibili attraverso la superficie raularele. Altri, come i volantini interni di I4, possono essere meglio raggiunti attraverso l'epitelio esterno dell'odontoforo. Abbiamo fatto prove preliminari in cui un'incisione sotto la fessura radulare dell'odontoforo parzialmente eversato ha permesso l'accesso per un gancio affilato da inserire che potrebbe poi essere utilizzato per lesione di un altro muscolo all'interno dell'odontoforo, muscolo I8⁸. Poiché il protocollo chirurgico qui descritto non apre la cavità del corpo principale, non è necessaria alcuna sutura.

Il protocollo che abbiamo descritto può essere di interesse generale per altri ricercatori che lavorano su strutture di tessuti molli che altrimenti sarebbero difficili da manipolare, ad esempio l'apparato alimentare di altri molluschi. Più in generale, questo protocollo potrebbe suggerire altri nuovi approcci chirurgici all'analisi di strutture morbide come lingue, tronchi o tentacoli¹⁸.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data