Un saggio basato sulle proteine con fluorescenza verde potenziato per studiare la crescita neurite nei neuroni primari

Riepilogo

In questa relazione, descriviamo un semplice protocollo per studiare la escrescenza di neurite nei neuroni corticali embrionali del ratto co-traducendo con EGFP e la proteina di interesse.

Abstract

L'escrescenza di Neurite è un evento fondamentale nella formazione dei circuiti neurali durante lo sviluppo del sistema nervoso. Gravi danni ai neuriti e disfunzioni sinaptiche si verificano in varie malattie neurodegenerative e degenerazione legata all'età. Lo studio dei meccanismi che regolano l'escrescenza neurite non solo getterebbe luce preziosa sui processi di sviluppo cerebrale, ma anche su tali disturbi neurologici. A causa della bassa efficienza di trasfezione, è attualmente difficile studiare l'effetto di una proteina specifica sulla escrescenza di neurite nei neuroni dei mammiferi primari. Qui, descriviamo un metodo semplice per lo studio dell'escrescenza neurite dalla co-trasfezione dei neuroni corticali del ratto primario con EGFP e una proteina di interesse (POI). Questo metodo consente l'identificazione dei neuroni trafettati POI attraverso il segnale EGFP, e quindi l'effetto del POI sulla crescita di neurite può essere determinato con precisione. Questo saggio basato su EGFP fornisce un approccio conveniente per lo studio dei percorsi che regolano la crescita neurite.

Introduzione

Neuriti, compresi sia assoni che dendriti, sono le proiezioni dei neuroni coinvolti nella creazione delle reti neurali. La crescita dinamica dei neuriti è essenziale per il neurosviluppo. Tuttavia, i meccanismi normativi sottostanti rimangono poco chiari. In particolare, il danno neurite è spesso osservato in varie malattie neurodegenerative e dopo lesioni cerebrali¹. Pertanto, lo studio dei ruoli delle molecole putative in vari percorsi normativi di escrescenza neurite migliorerebbe la nostra comprensione del processo. Inoltre, può rivelare nuovi bersagli terapeutici per vari disturbi neurologici. Le linee cellulari neuronali sono modelli preziosi per studiare i processi neuronali tra cui l'escrescenza di neurite in quanto sono facili da manipolare e trasfect^2,3. Tuttavia, deriva genetica è stata segnalata per verificarsi in alcune linee cellulari comunemente utilizzate, che potrebbero portare a variazioni nelle loro risposte fisiologiche⁴. Inoltre, è stata mostrata un'espressione differenziale di proteina tra le linee cellulari neuronali e i neuroni primari. Per esempio, PC12, una linea cellulare neuronale derivata dalla ghiandola surrenale del ratto che è ampiamente utilizzata per studiare la crescita neurite^2,3, non esprime i recettori NMDA⁵. Inoltre, è stato proposto che la ridotta reattività della linea neuroblastoma del topo neuro-2a alle neurotossine rispetto ai neuroni primari è dovuta alla mancanza di espressione di alcuni recettori della membrana e canali ionici⁶. Pertanto, i neuroni primari sono un modello più desiderabile e rappresentativo per lo studio della escrescenza di neurite. Tuttavia, l'uso di neuroni primari è ostacolato dalla loro bassa efficienza di trasfezione⁷.

Qui, descriviamo un metodo che comporta la co-trasfezione della proteina di interesse (POI) e EGFP ai neuroni corticali del ratto primario. L'EGFP agisce come marcatore morfologico per l'identificazione di neuroni trasfettati con successo e permette la misurazione dei neuriti. Abbiamo convalidato questo metodo utilizzando composti/molecole che sono stati segnalati per modulare la crescita dei neurite. Inoltre, FE65, una proteina adattatrice neuronale che ha dimostrato di stimolare la crescita neurite, è stata utilizzata per illustrare questo approccio^8,9. Questo protocollo prevede (1) l'isolamento dei neuroni corticali primari dagli embrioni del giorno embrionale 18 (E18) sugli embrioni di ratto, (2) la co-trasfezione dei neuroni con EGFP e poi (FE65 in questo studio) e (3) l'imaging e l'analisi dei neuroni utilizzando l'elaborazione delle immagini software ImageJ con il plugin NeuronJ^10,11.

Protocollo

Tutte le procedure seguite erano conformi agli standard etici del comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università Cinese di Hong Kong.

1. Preparazione di Coverslips

1. Collocare uno scivolo circolare sterile da 18 mm in ogni pozzetto di una piastra di coltura dei tessuti a 12 pozze.
2. In un'incubatrice umidizzata da 37 gradi centigradi per almeno 1 h, rivestire la coverslip con una soluzione poli-D-lisina a 5 g/mL/mL.
3. Aspirare la soluzione poli-D-lysina dalla piastra di coltura dei tessuti e risciacquare i copricapi rivestiti una volta con acqua sterile.

2. Dissezione del neurone embrionale del ratto

1. Sacrificare un ratto Sprague-Dawley a tempo all'età gestazionale di 18 giorni (E18) per lussazione cervicale o asfissia di CO_2.
   NOT: Si prega di controllare le norme locali per il sacrificio di ratti incinte.
2. Aprire la cavità addominale del ratto incinta con forbici dissetanti e trasferire l'utero in un piatto Petri di 10 cm.
3. Aprire con cura l'utero e il sacco amniotico con piccole forbici dissettive e rimuovere la placenta dall'embrione di ratto utilizzando piccole forbici dissettive. Trasferire l'intero embrione in una parabola Petri di 10 cm con salina tamponata pre-raffreddata con supplemento di glucosio (PBS-glucosio, 10 mM fosfati di sodio, 2,68 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio e 3 g/L di glucosio) utilizzando un paio di piccole pinze.
4. Tagliare lungo la sutura sagittale del cranio e aprirlo con attenzione con un paio di piccole forbici dissetanti. Trasferire il cervello embrionale con una piccola spatola piatta in un piatto Petri di 10 cm con PBS-glucosio ghiacciato.
5. Separare i due emisferi cerebrali dal cervelletto e dal tronco encefalico utilizzando due pinzette #5 al microscopio di dissezione.
   NOT: Si prega di vedere il riferimento¹² per la struttura del cervello del ratto.
6. Rimuovere le meningi utilizzando le #5 pinzette.
7. Isolare la corteccia dagli emisferi cerebrali con due pinzette di #5 dritte.
8. Trasferire la corteccia isolata in PBS-glucosio ghiacciato in un tubo di centrifuga di 15 mL.

3. Cultura primaria dei neuroni corticali

NOT: Tutte le procedure nei passaggi 3 e 4 vengono eseguite all'interno di un armadietto di biosicurezza di classe II.

1. Apposta la corteccia isolata per gravità a 4 gradi centigradi per 5 min e aspira il PBS-glucosio.
2. Aggiungere 1 mL di 0,05% Trypsin-EDTA alla corteccia isolata e mescolare delicatamente toccando e incubare il tessuto in un bagno d'acqua di 37 gradi per 10 min per consentire la digestione enzimatica. Toccare delicatamente il tubo per mescolare ogni 2 min.
3. Aggiungere 4 mL di mezzo di manutenzione (ad esempio, Mezzo Neurobasal) alla miscela di tessuto/trypsin.
   NOT: Tutto il mezzo di manutenzione utilizzato in questo protocollo è integrato con Penicillina-Streptomycin e B-27 supplemento¹³.
4. Dissociare delicatamente il tessuto mediante triturazione utilizzando una pipetta da 1 mL.
5. Pellet le cellule dissociate per centrifugazione a 200 x g per 5 min. Aspirate il sovratalante.
6. Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,7 due volte.
7. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo di manutenzione.
8. Aggiungete 10 L dello 0,4% di soluzione Trypan Blue a 10 litri di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule vitali con un emocitometro.
9. Piastra i neuroni ad una densità di 65,000 /cm² (cellule vitali) in 1 mL di mezzo di manutenzione per bene in una piastra di 12 pozzetti.

4. Trasfezione e fissaggio delle celle

1. A 2 giorni in vitro (DIV2), transfect 0,5 g di costrutto EGFP (pEGFP-C1) ai neuroni insieme con o senza 0,5 g di POI utilizzando 1 :L di reagente di trasfezione (ad esempio, Lipofectamine 2000). Utilizzare le istruzioni del produttore.
   NOT: I costrutti di espressione dei mammiferi sono stati preparati utilizzando un kit di preparazione del plasmide endotossina. Il trattamento con sostanze chimiche/molecole (in questo manoscritto sono stati utilizzati cytochalasin D (Cyto D) e fattore di crescita del nervo (NGF) può essere fatto a 6 h dopo la trasfezione.
2. Aspirare il mezzo di coltura 24 h post-trasfezione e lavare le cellule traste una volta con 37 pbS (10 mM fosfati di sodio, 2,68 mM di cloruro di potassio, 140 mM di cloruro di sodio).
3. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide in PBS per 10 min al buio a temperatura ambiente.
4. Lavare le celle fisse tre volte con PBS.
5. Aggiungere una quantità minima di supporto di montaggio a fluorescenza su un vetrino di vetro al microscopio. Trasferire con attenzione il coperchio dalla piastra a 12 piani sul supporto di montaggio con il campione rivolto verso il vetrino.
   NOT: Sigillare il bordo della coverslip con smalto se viene utilizzato un mezzo di montaggio acquoso.

5. Misurazione di Neurite Outgrowth

1. Utilizzare un obiettivo 40x per catturare immagini utilizzando un microscopio epi-fluorescente.
2. Cattura immagini da almeno 40 neuroni intatti con il segnale EGFP per trasfezione.
3. Aprire l'immagine catturata nel software ImageJ con il plugin NeuronJ¹¹ per misurare la lunghezza della neurite più lunga, dal corpo cellulare alla punta del cono di crescita, di ogni neurone immagine.
4. Analizzare i dati ottenuti con il software per determinare l'effetto delle proteine mirate nella escrescenza di neurite.

Risultati

Per testare questa metodologia, abbiamo usato Cyto D e il fattore di crescita del nervo NGF, che hanno dimostrato di inibire e stimolare rispettivamente la crescita di neurite^14,15,16. La lunghezza neurite dei neuroni trasincati con EGFP è stata misurata dopo il trattamento con Cyto D o NGF. L'efficienza di trasfezione di EGFP ai neuroni è stata del 2,7% (1.068 neuroni contati). Come mostrato n...

Discussione

Come detto prima, PC12 e i suoi subclone sono ampiamente impiegati per studiare l'estensione neurite perché hanno un'eccellente efficienza di trasfezione^2,3. Al contrario, i neuroni primari hanno un basso tasso di trasfezione, che è un grande ostacolo per studiare i regolatori di escrescenza neurite per trasfezione⁷. Qui, descriviamo un protocollo conveniente per quantificare la crescita dei neuriti nei neuroni primari. Nonostante la bas...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 tweezers	Regine	5-COB
18 mm Circle Cover Slips	Thermo Scientific	CB00180RA	Sterilize before use
B27 Supplement	Gibco	17504044
Cytochalasin D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolved in DMSO
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Dissecting Scissors, 10 cm	World Precision Instruments	14393
Dissecting Scissors, 12.5 cm	World Precision Instruments	15922
EndoFree Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12362
Fluorescence Mounting Medium	Dako	S302380
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668019
Neurobasal Medium	Gibco	21103049
NGF 2.5S Native Mouse Protein	Gibco	13257019
Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip	World Precision Instruments	504489
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Please see references 8 and 15
PBS Tablets	Gibco	18912014
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7280
Spatula	Sigma-Aldrich	S4147
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061