Generazione di modifiche genomiche definite utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

Questo protocollo fornisce un metodo per facilitare la generazione di cambiamenti di nucleotidi eterozio o omozigo utilizzando CRISPR-CAS9 nelle cellule staminali pluripotenti umane.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane offrono un potente sistema per studiare la funzione genica e modellare mutazioni specifiche rilevanti per la malattia. La generazione di precise modifiche genetiche eterozigole è impegnativa a causa della formazione indel mediata da CRISPR-CAS9 nel secondo allele. Qui, dimostriamo un protocollo per aiutare a superare questa difficoltà utilizzando due modelli di riparazione in cui solo uno esprime il cambiamento di sequenza desiderato, mentre entrambi i modelli contengono mutazioni silenziose per prevenire il taglio e la formazione dell'indel. Questa metodologia è più vantaggiosa per la codifica genica delle regioni del DNA per generare il controllo isogenico e linee di cellule staminali umane mutanti per lo studio delle malattie umane e della biologia. Inoltre, sono state eseguite ottimizzazioni delle metodologie di trasfezione e screening per ridurre il lavoro e il costo di un esperimento di editing genico. Nel complesso, questo protocollo è ampiamente applicabile a molti progetti di editing del genoma che utilizzano il modello di cellule staminali pluripotenti umane.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali umane (HESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono strumenti preziosi per modellare le malattie umane a causa della loro capacità di rinnovamento, pur mantenendo la capacità di generare tipi di cellule di linee diverse^{1,2 ,3,4}. Questi modelli aprono la possibilità di interrogare la funzione genica e capiscono come mutazioni e fenotipi specifici siano correlati a varie malattie^5,6. Tuttavia, per capire come una specifica alterazione sia collegata a un particolare fenotipo, l'uso di un controllo isogenico accoppiato e di linee cellulari mutanti è importante controllare per la variabilità da linea a linea^7,8. Le nucleasi (TALEN) e le nucleasi di dita di zinco sono state utilizzate per generare mutazioni di inserimento o delezione (indels) in diversi modelli genetici, comprese le cellule primarie; ma queste nucleasi possono essere ingombranti da usare e costosi^9,10^,11,12,13,14. La scoperta della nuclea a breve ripetizione palindromica corta (CRISPR)-CAS9 del cluster regolarmente interspazio ha rivoluzionato il campo grazie all'efficienza nella formazione dell'indel in praticamente in qualsiasi regione del genoma, semplicità d'uso e riduzione dei costi^{15 , 16 , 17} mi lato ^{, 18} mi lato ^{, 19}.

Una sfida nell'utilizzo della tecnologia di editing genomico basata su CRISPR-CAS9 è stata la generazione o la correzione di mutazioni specifiche in un allele senza creare una mutazione indel nel secondo allele²⁰. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di superare questa sfida utilizzando due modelli di riparazione di oligonucleotidi a filamento singolo (ssODN) per ridurre la formazione dell'indel nel secondo allele. Entrambi gli ssODN sono progettati per contenere mutazioni silenziose per prevenire il re-taglio da parte della nucleacanda CAS9, ma solo uno contiene l'alterazione dell'interesse. Questo metodo aumenta l'efficienza di generare una specifica modifica genetica eterozigola senza indurre la formazione dell'indele nel secondo allele. Utilizzando questo protocollo, gli esperimenti di editing genico in sei luoghi genomici indipendenti dimostrano l'introduzione precisa del cambiamento genomico desiderato in un allele senza formazione dell'indele nel secondo allele e si verifica con un'efficienza complessiva del 10%. Il protocollo descritto è stato adattato da Maguire et al.²¹.

Protocollo

1. Progettazione e costruzione dell'RNA guida (gRNA)

NOTA: ogni gRNA è costituito da due oligonucleotidi della coppia di basi (bp) 60 che vengono anneali per generare un doppio filato (ds) oligonucleotide (Figura 1A-C). La tempistica per la progettazione, la generazione e l'efficienza di taglio dei gRNA è di circa 2 settimane (Figura 2).

1. Selezionare la regione del DNA di interesse da modificare nel genoma e identificare 3-4 23 bp sequenze che si adattano al formato, 5'-G(N₁₉)NGG-3'. Queste sequenze devono trovarsi entro 20 bp dall'area di interesse.
   NOTA: il targeting può essere eseguito sul filo senso o anti-senso.
2. Valutare le sequenze di gRNA per la ridondanza genomica e la probabilità fuori bersaglio utilizzando una risorsa come CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
3. Incorporare la sequenza di destinazione di 20 bp (escluso il motivo adiacente protospaziale o PAM) in due oligonucleotidi da 60 mer come mostrato (le sequenze sono da 5' a 3' e rosso e verde sono complementi inversi come mostrato nella Figura 1C).
4. Ordinare i due oligonucleotidi da 60 bp dal fornitore di scelta. Una volta ricevuti gli oligonucleotidi, risospendere ciascuno a una concentrazione finale di 100 M in ddH₂O. Fare uno stock di lavoro di 10 M.
5. Anneal i due oligonucleotidi e generare un frammento di dsDNA di 100 bp utilizzando la polimerasi del DNA (Tabella dei materiali). Unire 5 luna di 10 M di oligonucleotide in avanti e 5 di 10 M di oligonucleotide inversa in un tubo a catena di polimerasi (PCR) e incubare a 95 gradi C per 5 min. Raffreddare la reazione per 10 min a temperatura ambiente (RT).
6. Impostare la PCR come descritto nella Tabella 1. Eseguire l'amplificazione PCR in un ciclore termico utilizzando i parametri descritti nella tabella 2.
7. Visualizzare i prodotti PCR su un bromuro di etico (EtBr) di agarose gel elettroforizzato a 80-100 V per 40 min. Eccita la banda da 100 bp (Figura 3A), visualizzata su una scatola luminosa a LED, dal gel utilizzando una lama di rasoio e purificare con un gel kit di estrazione (Tabella dei materiali).

2. Progettazione di prime rinportaCCa PCR per lo screening

1. Eseguire lo screening del DNA modificato utilizzando primer PCR in avanti e indietro progettati specificamente per amplificare una regione di 400-500 bp del gene di interesse (Tabella 2). Utilizzare il DNA isolato da qualsiasi linea iPSC di controllo per confermare un amplificatore pulito quando si esegue lo screening PCR.
2. Visualizza i prodotti PCR su un gel 1.5% (w/v) seguendo l'elettroforesi a 80-100 V per 1 h.
   NOTA: la sequenza dei cloni modificati viene eseguita utilizzando un primer nidificato progettato in seguito alla conferma del set di primer di screening. I campioni vengono inviati a una fonte commerciale per il sequenziamento.

3. Preparazione del plasmide vettoriale gRNA_clonazione

1. Per linearizzare il vettore di clonazione, prendete un tubo di centrifuga di 1,5 mL e aggiungete 1-5 g di DNA del vettore gRNA_cloning insieme a 4 -L del buffer enzimatico di restrizione AflII e 1,5 l di Enzima di restrizione AflII. Portare la reazione a 24 : L di ddH₂O. Mescolare la reazione pipetting su e giù. Incubare a 37 gradi durante la notte (O/N).
2. Elettroforesi su un gel di agarose dell'1% a 80-100 V per 1 h e bande di accise (la dimensione prevista della banda è di 3519 bp).
3. Estrarre e purificare come nel passaggio 1.6.

4. Assemblaggio del vettore gRNA

1. Impostare le reazioni e assemblare frammenti di DNA utilizzando il kit di assemblaggio (Tabella dei materiali) a rapporti 1:5 del vettore di clonazione gRNA digerito AflII a 100 bp gel inserto purificato, come descritto nella tabella 3.
2. Incubare la reazione a 50 gradi centigradi per 15 min. Diluire la reazione 1:3 in ddH₂O e utilizzare 3 -L per la trasformazione batterica, secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Piastre su piastre kanamycin LB/agar.
3. Scegli 3-5 colonie per gRNA. Inoculare ogni colonia in 4 mL di LB e crescere O/N a 37 gradi centigradi in un incubatore di agitazione orbitale.
4. Purificare il DNA plasmide utilizzando un kit di isolamento miniprep plasmid e sequenziare ogni gRNA utilizzando i seguenti primer per garantire la clonazione di successo: Avanti: Forward: GTACAAAAAGCAGGCTAAGG; Inverso: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.

5. Testare l'efficienza di taglio del gRNA

1. Piastra hESC su fibroblasti embrionali murini irradiati (MEF) in una piastra a 6 piani, come descritto in precedenza²¹. Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, preparate il mix master di trasfezione descritto nella tabella 4.
2. Mescolare pipettando e incubare a RT per 15 min.
3. Raccogliere le cellule per la selezione dopo 48 h.
   1. Rimuovere i MEF in modo ezymatico (Tabella dei materiali) con un'incubazione di 3 min RT.
   2. Risciacquare le celle 1x con mezzo hESC (Tabella 5) e raschiare in hESC medio - 10 - 10 - M Y-27632 dihydrochlride ( Tabelladei materiali).
   3. Cellule di pellet a 300 x g per 3 min e risospendono in 0,5 mL di hESC medio - 10 -M Y-27632 dihydrochlor.
   4. Filtrare in un tubo da 5 mL attraverso un tappo di 35 m.
4. Utilizzando lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS), cancello su cellule vive e ordinare le cellule positive di proteina fluorescente verde (GFP).
5. Trasferire un massimo di 1,5 x 10⁴ celle ordinate direttamente in un piatto di 10 cm² rivestito con matrice di membrana del seminterrato 1:3 (Tabella dei materiali) e MEF irradiati in mezzo hESC ( Tabella5) contenenti Y-27632 dihydrochlor.
6. Cambiare medio giornaliero utilizzando il mezzo hESC (Tabella 5) senza dihydrochlor Y-27632 e raccogliere manualmente i cloni dopo 10-15 giorni, quando le colonie hanno un diametro di 1 mm.
   1. Utilizzando una pipetta P200 e un microscopio, raschiare con cura un singolo clone e disegnare le cellule nella pipetta.
   2. Disperdere le cellule pipettando delicatamente 3-4x in una piastra di 96 pozzetti nel mezzo redatto con la colonia.
   3. Distribuisci in tubi a striscia PCR per lo screening e pellet le cellule per centrifugazione a 10.000 x g per 5 min.

6. Screening dei cloni

1. Isolare il DNA incubando pellet cellulari in 20 gradi di tamponi di proteine K (Tabella 5) (1 h a 55 e 10 min a 95 gradi centigradi) e vortice vigorosamente. Centrifuga a 10.000 x g per 5 min e raccogliere il supernatante.
2. Eseguire lo screening PCR (sezione 2) in un volume totale di 20 l usando un master mix che include primer progettati per amplificare la regione di interesse e 5 l del digest della proteinasi K. Usa il DNA genomico isolato dalla linea cellulare che è stata modificata come controllo.
3. Valutare i cambiamenti di dimensione dei prodotti PCR in base all'elettroforesi di 1 h a 70-90 V su un gel di agarose del 2,5% (w/v) (Figura 3B,C). Qualsiasi differenza di dimensioni è indicativa di scissione.

7. Editing del genoma preciso nelle cellule staminali pluripotenti utilizzando il DNA oligo a singolo filamento (ssODN)

1. Progetta ssODN da 100 bp incentrati sulla sequenza di gRNA più efficiente determinata ad avere la migliore efficienza di taglio.
2. Prevenire la riscissione dell'ODN ricombinato introducendo mutazioni silenziose nella sequenza gRNA. Una singola mutazione silenziosa nella sequenza PAM è sufficiente, ma se non è possibile, 3-4 mutazioni silenziose funzioneranno.
   NOTA: Per facilitare lo screening di cloni mirati, l'introduzione di un sito di restrizione entro 20 bp dalla sequenza di gRNA è ideale.
3. Progettare un ODN con le modifiche di base desiderate per creare la mutazione di interesse e uno ODN senza le modifiche di base.
   NOTA: Questi cambiamenti non devono essere superiori a 20 pb dal sito di taglio CRISPR/CAS9 previsto, poiché la ricombinazione scende considerevolmente a distanze maggiori.
4. Ordinare i due ssODN dal fornitore di scelta e resuspend in acqua per fare 1 g / l stock. Conservare le scorte a -20 gradi centigradi.

8. Impostazione della trasfezione

1. Per tradurre la ssODN e la plasmidica CRISPR-CAS9, placcare la linea cellulare bersaglio in un piatto a 6 pozzetti su MEF irradiati per raggiungere il 70-80% di confluenza dopo un'incubazione O/N.
2. Impostare la reazione di trasfezione come descritto nella tabella 6. Mescolare la reazione pipettando e incubare per 15 min a RT. Aggiungere la miscela di reazione di trasfezione dropwise alle cellule.
3. Dopo 48 h, preparare le celle per l'ordinamento delle celle come descritto nella sezione 5.3.
4. Raccogliere colonie 10 giorni dopo la placcatura di singole cellule utilizzando una pipetta 200 .L. Trasferire 100 l di celle in un pozzo di un 24 o 48 pozzo precedentemente rivestito con gelatina e MEF irradiati nel mezzo hESC con Y-27632 dihydrochlride. Utilizzare i restanti 100 L per l'isolamento del DNA come descritto nella sezione 6.

9. Controllo delle mutazioni in colonie singole

1. Per verificare la corretta integrazione della ssODN, prendere 5 L L di DNA isolato da ogni colonia per eseguire la PCR utilizzando i primer di screening progettati nella sezione 2. Depurare i prodotti PCR (Tabella dei materiali) e preparare la digestione degli enzimi di restrizione utilizzando il sito enzimatico unico creato nella ssODN.
   NOTA: Questa digestione include anche il buffer enzimatico di restrizione e la concentrazione raccomandata dal produttore di enzimi di restrizione in un volume di 40 l.
2. Mescolare la reazione pipettando e incubare alla temperatura raccomandata dal produttore per 1-3 h.
3. Visualizza i prodotti PCR digeriti su un gel di agarose EtBr dell'1,5% (w/v) elettroforizzato a 80-100 V per 40 min. Se si è verificata un'integrazione corretta di ssODN, sequenza specifiche mutazioni utilizzando un primer annidato.

Risultati

Generazione di gRNA e screening per indele

Ogni gRNA sarà clonato in un vettore plasmide ed espresso usando il promotore U6. L'enzima di restrizione AflII viene utilizzato per linearizzare il plasmide (addgene #41824) e si trova dopo il promotore U6. La banda di 100 bp generata dopo l'annealing delle due oligos da 60 bp viene clonata nel vettore di espressione gRNA utilizzando l'assieme DNA. Una volta generati, i plasmidi gRNA vengono trasfettati in hESC o iPSC insie...

Discussione

In questo protocollo, l'uso di CRISPR-CAS9 insieme a due modelli di riparazione ssODN per generare specifici cambiamenti del genoma eterozigoo o omozigo è dimostrato nelle cellule staminali pluripotenti umane. Questo metodo ha portato alla generazione di successo di linee cellulari isogeniche che esprimono cambiamenti genomici eterozie con un'efficienza vicina al 10%. Questo protocollo è stato ottimizzato sia per le ESC umane che per gli iPSC cresciuti su MEF irradiati che supportano la crescita e la sopravvivenza dell...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap	Corning	352235
6-well polystyrene tissue culture dishes	Corning	353046
AflII restriction endonuclease	New England Biolabs	R0520
Agarose	VWR	N605
DMEM/F12 medium	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus
Gel extraction kit	Macherey-Nagel	740609
Gibson Assembly Kit	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin
Lipofectamine Stem Reagent	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR)	Corning	354230
Murine embryonic fibroblasts (MEFs)
Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609
Orbital shaking incubator
pCas9_GFP vector	Addgene	44719
PCR strip tubes	USA Scientific	1402-2900
Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit	Invitrogen	K210011
Proteinase K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells	Takara	636763
SOC medium	New England Biolabs	B9020S
TrypLE Express Enzyme	ThermoFisher	12605036
Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi)	Tocris	1254