Imaging nanoscopico delle sezioni dei tessuti umani attraverso l'espansione fisica e isotropica

Riepilogo

L'imaging su nanoscala di campioni di tessuto clinico può migliorare la comprensione della patogenesi della malattia. La patologia di espansione (ExPath) è una versione di microscopia di espansione (ExM), modificata per la compatibilità con campioni di tessuto clinico standard, per esplorare la configurazione su nanoscala delle biomolecole utilizzando microscopi tradizionali a diffrazione limitata.

Abstract

Nella moderna patologia, la microscopia ottica svolge un ruolo importante nella diagnosi della malattia rivelando strutture microscopiche di campioni clinici. Tuttavia, il limite fondamentale di diffrazione fisica impedisce l'interrogatorio dell'anatomia su nanoscala e dei sottili cambiamenti patologici quando si utilizzano approcci di imaging ottico convenzionali. Qui, descriviamo un protocollo semplice ed economico, chiamato patologia di espansione (ExPath), per l'imaging ottico su nanoscala di tipi comuni di campioni di tessuto primario clinico, inclusi sia tessuto incorporato di paraffina fissa-congelato o formalina (FFPE) Sezioni. Questo metodo aggira il limite di diffrazione ottica trasformando chimicamente i campioni di tessuto in ibrido di idrogel tissutale e espandendoli fisicamente isoquinamente su più scale in acqua pura. A causa dell'espansione, le molecole precedentemente irrisolvibili sono separate e quindi possono essere osservate utilizzando un microscopio ottico convenzionale.

Introduzione

Lo studio dell'organizzazione molecolare dei tessuti in un contesto tridimensionale (3D) può fornire una nuova comprensione delle funzioni biologiche e dello sviluppo della malattia. Tuttavia, questi ambienti su nanoscala sono al di là delle capacità di risoluzione dei microscopi tradizionali a diffrazione limitata (200-300 nm), dove la distanza minima risolvibile, d è definita da d / /NA. Qui è la lunghezza d'onda della luce e NA è l'apertura numerica (NA) del sistema di imaging. Recentemente, la visualizzazione diretta delle molecole fluorescenti etichettate è stata resa possibile dalle tecniche di imaging a super-risoluzione di recente sviluppo^1,2,3, compreso l'esaurimento stimolato delle emissioni (STED), microscopia di localizzazione ad attivazione fotofoto (PALM), microscopia da ricostruzione ottica stocastica (STORM) e microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). Sebbene queste tecniche di imaging abbiano rivoluzionato la comprensione della funzione biologica su scala nanometrica, in pratica, spesso si basano su apparecchiature costose e/o specializzate e fasi di elaborazione delle immagini, possono avere tempi di acquisizione più lenti rispetto a l'imaging ottico convenzionale, richiedono fluorofori con caratteristiche specifiche (come la capacità di commutazione fotografica e/o l'elevata fotostabilità). Inoltre, rimane una sfida eseguire l'imaging 3D a super-risoluzione su campioni di tessuto.

La microscopia di espansione (ExM), introdotta per la prima volta nel 2015^4,fornisce un mezzo alternativo di imaging di funzionalità su nanoscala (<70 nm) espandendo fisicamente campioni conservati incorporati in un idrogel polielettrolitico gonfiabile. Qui, le biomolecole e/o le etichette chiave sono ancorate in situ a una rete polimerica che può essere espansa isotopicamente dopo l'elaborazione chimica. Poiché l'espansione fisica aumenta la risoluzione effettiva totale, le molecole di interesse possono essere risolte utilizzando sistemi di imaging convenzionali con diffrazione limitata. Dalla pubblicazione del protocollo originale, in cui le etichette fluorescenti sintetizzate personalizzate erano ancorate alla rete polimerica⁴, sono state utilizzate nuove strategie per ancorare direttamente le proteine (Protein retention ExM, o proExM)^{5, 6,7,8,9} e RNA^9,10,11,12 all'idrogel, e aumentare l'ingrandimento fisico attraverso iterativo espansione¹³ o adattando la chimica del gel^8,14,15.

Qui presentiamo una versione adattata di proExM, chiamata patologia di espansione (ExPath)¹⁶, che è stata ottimizzata per i formati di patologia clinica. Il protocollo converte campioni clinici, tra cui campioni di tessuto umano fissati in formalina (FFPE), ematossialina ed eosina (H&E) macchiati e campioni di tessuto umano appena congelati montati su vetrini di vetro, in uno stato compatibile con ExM. Le proteine sono poi ancorate all'idrogel e viene eseguita l'omogeneizzazione meccanica (Figura 1)¹⁶. Con un'espansione lineare di 4 volte dei campioni, le immagini a super-risoluzione multicolore (70 nm) possono essere ottenute utilizzando un microscopio confocale convenzionale con una risoluzione di soli 300 nm e possono anche essere combinate con altre tecniche di imaging a super-risoluzione.

Protocollo

1. Preparazione di reagenti e soluzioni di magazzino

1. Preparare i componenti della soluzione di gelling.
   NOTA: le concentrazioni di soluzione sono indicate in g/mL (percentuale w/v).
   1. Effettuare le seguenti soluzioni di stock: 38% (w/v) acrilato di sodio (SA), 50% (w/v) acrilammide (AA), 2% (w/v) N, N'-methylenebisacrylamide (Bis), e 29.2% (w/v) cloruro di sodio (NaCl). Sciogliere i composti in acqua doppiamente deionizzata (ddH₂O). Utilizzare gli importi della tabella 1 come riferimento; soluzioni preparate possono essere scalate verso l'alto o verso il basso in volume in base alle esigenze. Ad esempio, per creare 10 mL di una soluzione SA del 38% (w/v), aggiungere 1,9 g di SA a un cilindro graduato da 10 mL e aggiungere ddH₂O a un volume di 5 mL.
   2. Preparare 9,4 mL di soluzione monomera ad una concentrazione di 1,06x, come illustrato nella tabella 1.
      NOT: Questo si tradurrà in una concentrazione 1x dopo l'aggiunta dell'initiator, acceleratore, e inibitore. Lo stock di monomeri è conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi, o a -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
   3. Preparare le seguenti soluzioni azionarie separatamente in ddH₂O: 0.5% (w/v) dell'inibitore 4-idrossi-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (4HT), che inibisce la gelazione per consentire la diffusione della soluzione di gelling nei tessuti, il 10% (v/v) del tetrametileleneamina (TEMED), che accelera la generazione radicale di persulfato di ammonio (APS) e del 10% (w/v) Che avvia il processo di gelling.
      
2. Preparare il buffer di digestione (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] surfactant nonionic, 0.8 M NaCl) combinando 25 mL di 1 M Tris pH 8 (3,03 g di base Tris in 25 mL di ddH₂O), 25 mL di EDTA (0,5 MH) , 2,25 g di surfactant nonionico e 23,38 g di NaCl. Aggiungere ddH₂O per un volume totale di 500 mL.
   NOT: La soluzione può essere scalata verso l'alto o verso il basso in base alle esigenze ed essere immagazzinata a 4 gradi centigradi. Proteinase K (ProK) verrà aggiunto immediatamente prima della fase di digestione.
3. Preparare la soluzione di citrato di 20 mM di sodio combinando 2,941 g di citrato di sodio tribasic diidratare con 500 mL di ddH₂O e regolando il pH a 8,0 a temperatura ambiente (RT). Ridimensionare il volume delle scorte in base alle esigenze.
4. Preparare una soluzione stock di 6-((acriloil)amino)aminoano)acido exanoico, succinimidyl ester (acriloil-X, SE; AcX), il composto di ancoraggio. Sciogliere l'AcX in 500 o l di anidride anica solforo dimetilo (DMSO) per una concentrazione finale di 10 mg/mL.
   NOT: La soluzione può essere conservata in un ambiente desiccato a -20 gradi centigradi in 20 - aliquote.
5. Se non si utilizzano buffer disponibili in commercio per l'immunostaining, preparare il buffer di blocco. Utilizzare un buffer di blocco del 5% (v/v) siero animale normale e dello 0,1% (w/v) surfactant nonionico in 1x salina con buffer fosfato (PBS) e selezionare il siero in base all'animale ospite degli anticorpi secondari. Ad esempio, per preparare 500 mL di blocco buffer per gli anticorpi sollevati nella capra, combinare 25 mL di siero di capra, 0,45 g di surfactant nonionico e 1x PBS a un volume di 500 mL.

2. Preparazione di diapositive di tessuto clinico archiviate e appena preparate per ExPath

1. Convertire il tessuto in un formato compatibile con ExPath. Scegliere uno dei quattro passaggi seguenti (2.1.1.2.1.4) in base alla modalità di preparazione del campione: diapositive FFPE, vetrini FFPE macchiati o vetrini di tessuto congelati non fissi o fissi in soluzione ottimale per la temperatura di taglio (OCT).
   NOTA: questi sono basati su passaggi di ripristino standard per i campioni di patologia e non sono specifici del protocollo ExPath.
   1. Campioni clinici FFPE
      1. Preparare 30 mL di 95% etanolo, 70% etanolo e 50% di etanolo. Misurare 30 mL di xilene, 100% etanolo e ddH₂O.
      2. Posizionare la diapositiva con il campione in un conicale di 50 mL con forcep e aggiungere 15 mL di xilene. Far quadrare il tubo e posizionarlo orizzontalmente su uno shaker orbitale a circa 60 giri e incubare a RT per 3 min per ogni soluzione. Ripetere con gli altri 15 mL di xilene.
      3. Ripetere il passaggio 2.1.1.2 con 100% di etanolo, 95% etanolo, 70% etanolo, 50% etanolo e ddH₂O al posto dello xilene.
   2. Scivoli permanenti macchiati e montati
      1. Mettere il vetrino in un piatto Petri da 100 mm e coprire con lo xilene. Rimuovere con cura il coperchio con una lama da rasoio. Se il coperchio non è facilmente rimosso, riportare la diapositiva allo xilene fino a quando il coperchio si allenta.
      2. Elaborare utilizzando i passaggi per gli esempi FFPE (passaggi 2.1.1.1.1.1.1.3).
         NOT: Nel caso di vetrini macchiati H&E, le macchie vengono eliminate durante il processo di espansione.
   3. Diapositive di tessuto congelato non fissi nella soluzione OCT
      1. Fissare il tessuto in acetone a -20 gradi centigradi per 10 min.
      2. Lavare i campioni con la soluzione 1x PBS 3 volte per 10 min ciascuno a RT.
   4. Precedentemente fissati, vetrini di tessuto clinico congelati
      1. Incubare i vetrini per 2 min a RT per fondere la soluzione OCT.
      2. Lavare il campione con la soluzione 1x PBS 3 volte per 5 min ciascuno a RT.
2. Eseguire il trattamento termico per il recupero dell'antigene su tutti i campioni dopo la conversione del formato.
   1. Aggiungere una soluzione di citrato da 20 mM (pH 8 a RT) in un contenitore resistente al calore, ad esempio un barattolo di colorazione.
      NOT: Ci dovrebbe essere abbastanza soluzione per coprire il tessuto montato sul vetrino (50 mL per un barattolo di colorazione di scivolo standard).
   2. Riscaldare la soluzione del citrato a 100 gradi centigradi nel microonde e posizionare il vetrino nella soluzione. Trasferire immediatamente il contenitore in una camera di incubazione e incubare a 60 gradi centigradi per 30 min.
      NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I vetrini possono essere collocati in piatti Petri e coperti in 1x PBS e conservati a 4 gradi centigradi.
3. Macchiare il campione utilizzando protocolli standard di colorazione immunofluorescenza (IF)/immunohistochimica (IHC).
   NOTA: le concentrazioni specifiche di anticorpi primari e secondari e le durate delle macchie dipendono dalle concentrazioni suggerite dal produttore o dall'ottimizzazione per l'esperimento specifico.
   1. Utilizzare una penna idrofobica per disegnare un contorno intorno alle sezioni di tessuto sulla diapositiva per ridurre al minimo il volume della soluzione necessaria per coprire il tessuto. Posizionare il vetrino in un piatto abbastanza grande da adattarlo. Per uno scivolo standard da 3 pollici, utilizzare un piatto Petri da 100 mm.
      NOT: La penna idrofobica non interferisce con la polimerizzazione del campione né con il processo di digestione.
   2. Incubare il tessuto con un buffer di bloccaggio per 1 h a 37 , 2 h a RT o 4 gradi durante la notte per ridurre il legame non specifico.
   3. Diluire gli anticorpi primari alla concentrazione desiderata nella quantità appropriata di tampone di blocco preparato (o altro buffer di colorazione preferito). Incubare i tessuti con la soluzione anticorpale primaria per almeno 3 h a RT o 37 gradi centigradi, o peruna durante la notte a 4 gradi centigradi.
      NOT: I campioni devono essere collocati in un contenitore umidificato (come un piatto Petri con una salvietta umida) per evitare che il tessuto si secchi. Tipicamente, gli anticorpi sono stati diluiti a 1:100-1:500 in 200'500 - L di tampone, a seconda delle dimensioni del tessuto e dell'anticorpo utilizzato.
   4. Lavare il tessuto con tampone di bloccaggio preparato (o altro buffer di lavaggio preferito) 3 volte per 10 min a RT.
   5. Diluire gli anticorpi secondari (e 300 nM 4,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] se lo si desidera), in buffer di blocco preparato (o altro buffer di colorazione preferito) ad una concentrazione di circa 10g/mL. Incubare il tessuto nella soluzione anticorpale secondaria per almeno 1 h a RT o 37 gradi centigradi.
      NOT: La tempistica può essere regolata a seconda degli anticorpi utilizzati e dello spessore del tessuto. Gli anticorpi secondari contenenti coloranti cianini (Cy3, Cy5, Alexa 647) non sono compatibili con il protocollo ExM quando applicati pre-polimerizzazione. I coloranti suggeriti includono Alexa 488 (verde), Alexa 546 (arancione/rosso) e Atto 647N o CF633 (in rosso). DAPI deve essere riapplicato dopo l'espansione, in quanto viene lavato via durante il processo di espansione.
   6. Lavare il tessuto con tampone di bloccaggio preparato (o altro buffer di lavaggio preferito) 3 volte per 10 min ciascuno a RT.
      NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I vetrini possono essere collocati in piatti Petri e coperti in 1x PBS e conservati a 4 gradi centigradi.
   7. Eseguire l'imaging fluorescente utilizzando un microscopio a campo largo convenzionale, un microscopio confocale o un altro sistema di imaging di scelta.
      NOT: Questo passaggio è necessario per determinare la lunghezza biologica utilizzando il fattore di espansione confrontando le immagini pre e post-espansione. Per facilitare l'imaging post-espansione, è necessario selezionare le regioni di interesse facilmente identificabili e raccogliere immagini con ingrandimento basso e alto.

3. In Situ polimerizzazione degli esemplari

1. Incubare il campione nella soluzione di ancoraggio.
   1. Preparare la soluzione di ancoraggio (in genere 250 l è sufficiente a coprire la sezione del tessuto) diluindo la soluzione stock AcX in 1x PBS a una concentrazione di 0,03 mg/mL per campioni fissati con fissati non all'aldeide o 0,1 mg/mL per i campioni fissati con fissati all'aldeide , che hanno meno ammine libere disponibili per reagire con AcX.
   2. Collocare il vetrino in un piatto Petri da 100 mm e pipettare la soluzione di ancoraggio sul tessuto. Incubare per almeno 3 h a RT o peruna pernottamento a 4 gradi centigradi.
2. Incubare i campioni in soluzione di gelling.
   1. Preparare almeno 100 volte il volume in eccesso di soluzione di gelling. In base al valore di 200, combinare le seguenti opzioni, nell'ordine: 188 l di soluzione monomera, 4 unità di stock 4HT dello 0,5% (1:50 di diluizione, concentrazione finale: 0,01%), 4 L del 10% di soluzione stock TEMED (1:50 di diluizione, concentrazione finale 0,2%) e 4 unità di diluizione, concentrazione finale 0,2%).
      NOT: Soluzione gelling deve essere fatta immediatamente prima dell'uso. La soluzione deve essere mantenuta a 4 gradi centigradi e la soluzione APS deve essere aggiunta per ultima, per evitare gelling prematuro.
   2. Rimuovere la soluzione in eccesso dalla sezione del tessuto e posizionare il vetrino in una piastra di Petri da 100 mm. Aggiungere una soluzione gellona fresca e fredda al campione e incubare la miscela sul tessuto per 30 min a 4 gradi centigradi, per consentire la diffusione della soluzione nel tessuto.
3. Costruire una camera sulla diapositiva intorno al campione (Figura 2A) senza disturbare la soluzione gelling.
   1. Crea distanziali per la camera gelling tagliando sottilmente pezzi di vetro di copertura con un coltello di a diamante.
      NOT: Per facilitare l'imaging dopo l'espansione, i distanziali devono essere vicini allo spessore del campione di tessuto per ridurre la quantità di gel bianco sopra il tessuto. Il vetro numero 1,5 può essere utilizzato per campioni clinici standard (5-10 m). I pezzi di vetro di copertura possono essere impilati per campioni più spessi.
   2. Fissare i distanziali su entrambi i lati del tessuto utilizzando goccioline d'acqua (10 dollari l).
   3. Posizionare con cura un coperchio di vetro di copertura sopra il vetrino, assicurandosi di evitare di intrappolare bolle d'aria sul tessuto (Figura 2B).
4. Incubare il campione a 37 gradi centigradi in un ambiente umidificato (come un piatto Petri chiuso con una salvietta umida) per 2 h.
   NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. La camera di scorrimento può essere conservata all'interno di una piastra Petri sigillata a 4 gradi centigradi.

4. Digestione del campione

1. Rimuovere il coperchio della camera gelling facendo scorrere delicatamente una lama di rasoio sotto il coperchio e sollevando lentamente il coperchio dalla superficie del gel. Tagliare il gel bianco intorno al tessuto per ridurre al minimo il volume. Tagliare il gel in modo asimmetrico per monitorare l'orientamento del gel dopo l'omogeneizzazione, poiché il campione diventerà trasparente.
   1. Diluire ProK di 1:200 nel buffer di digestione (concentrazione finale 4 U/mL) prima dell'uso. Preparare abbastanza soluzione per sommergere completamente il gel; un singolo pozzo di una piastra di coltura di cellule plastiche a quattro pozzetti richiede almeno 3 mL per pozzo.
   2. Incubare il campione in un contenitore chiuso contenente il buffer di digestione per 3 h a 60 gradi centigradi. Se il campione non si stacca dal vetrino durante la digestione, utilizzare una lama di rasoio per rimuovere delicatamente il campione.
      NOT: Il campione deve essere completamente immerso nel tampone di digestione per evitare che il campione si secchi e posto in un contenitore coperto (piccola scatola di scorrimento, pozzo di plastica, piatto Petri, ecc.) che può essere sigillato con pellicola.

5. Esempio di espansione e imaging

1. Utilizzare un pennello morbido per trasferire il campione in 1x PBS in un contenitore compatibile con il sistema di imaging desiderato e abbastanza grande da ospitare il gel completamente espanso. Assicurarsi che il tessuto sia posizionato con il campione verso il basso se l'imaging su un sistema invertito o verso l'alto se l'imaging su un sistema verticale per ridurre al minimo la distanza dall'obiettivo di imaging al campione. Capovolgere il gel con un pennello morbido, se necessario.
   NOT: L'illuminazione laterale da un LED può essere utilizzata per renderli visibili in liquido. Una piastra standard a 6 pozzetto può ospitare campioni con un diametro pre-espanso inferiore a 0,6 cm. Una piastra inferiore in vetro deve essere utilizzata per l'imaging su un sistema invertito.
2. Lavare i campioni in 1x PBS a RT per 10 min. Se lo si desidera, macchiare nuovamente il campione con 300 nM DAPI come il processo di digestione lava via la macchia DAPI. Rimuovere PBS e colorazione con 300 nM DAPI diluito in 1x PBS per 20 min a RT, seguito da un lavaggio di 10 min con 1x PBS a RT.
   NOT: I campioni possono essere coperti con 1x PBS e conservati a 4 gradi centigradi prima di procedere alla fase successiva.
3. Per espandere i campioni, sostituire il PBS e lavare con un volume in eccesso di ddH₂O (almeno 10 volte il volume finale del gel) 3-5 volte per 10 min ciascuno, a RT.
   NOT: Dopo il^lavaggio 3 rd o 4^th, l'espansione del campione dovrebbe iniziare ad plateau. Per lo stoccaggio, per prevenire la crescita batterica, il ddH₂O può essere integrato con 0.002% azide di sodio (NaN₃). In questo caso, il fattore di espansione finale viene ridotto reversibilmente del 10%.
4. Eseguire l'imaging a fluorescenza utilizzando un microscopio a campo largo convenzionale, un microscopio confocale o un altro sistema di imaging di scelta.
   NOT: Per evitare che i gel si allassino, il liquido in eccesso può essere rimosso dal pozzo. I gel possono anche essere immobilizzati con agarose a bassa fusione dell'1,5%. Preparare in acqua l'agarose a bassa fusione in acqua in un contenitore di 2 x 4 volte il volume della soluzione. Scaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 40 gradi centigradi o in un forno a microonde per 10/20 s per sciogliere la soluzione. Pipette l'agarose fuso intorno ai bordi del gel. Dopo aver lasciato che l'agarose si indurisse a RT o 4 gradi centigradi, aggiungere acqua al campione per prevenire la disidratazione.

Risultati

Se il protocollo è stato eseguito con successo (Figura 1), i campioni appariranno come gel piatto e trasparente dopo l'omogeneizzazione meccanica (Figura 3A) e potranno espandersi di un fattore di 3-4,5x in acqua (Figura 3B), fornendo una risoluzione efficace di 70 nm a seconda del fattore di espansione finale e del sistema di imaging utilizzato^5,

Discussione

Qui, presentiamo il protocollo ExPath¹⁶, una variante di proExM⁵ che può essere applicata ai tipi più comuni di campioni di biopsia clinica utilizzati in patologia, tra cui FFPE, H&E macchiati, e campioni freschi congelati su vetrini di vetro. La conversione del formato, il recupero dell'antigene e l'immunostaining dei campioni seguono protocolli di uso comune che non sono specifici di ExPath. A differenza del protocollo proExM originale⁹, ExPath s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acetone	Fischer Scientifc	A18-500
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887
Acryloyl-X, SE (AcX)	Invitrogen	A20770
Agarose	Fischer Scientifc	BP160-100
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	HPA001873
Anti-Collagen IV antibody produced in mouse	Santa Cruz Biotech	sc-59814
Anti-Vimentin antibody produced in chicken	Abcam	ab24525
Aqua Hold II hydrophobic pen	Scientific Device	980402
Breast Common Disease Tissue Array	Abcam	ab178113
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	Nuclear stain
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Forceps
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A	Biotium	20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633	Biotium	20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind Staining Medium	Active Motif	15253	Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.
MAXblock Blocking Medium	Active Motif	15252	Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.
MAXwash Washing Medium	Active Motif	15254	Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.
Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma Aldrich	M7279
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121	For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063	Multi-well plastic culture dish
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientifc	BP399-1
Plastic Petri Dish (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate	Sigma Aldrich	408220
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris Base	Fischer Scientifc	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Wheat germ agglutinin labeled with CF640R	Biotium	29026
Xylenes	Sigma Aldrich	214736