Uso di dati magnetici e di biopsia per guidare le procedure di campionamento per il biobanking sul cancro alla prostata

Riepilogo

Questo metodo comporta l'utilizzo di dati diagnostici clinici per i pazienti affetti da cancro alla prostata al fine di guidare le procedure di campionamento, quando il tessuto biobancario a seguito della prostatectomia radicale. Questo supera i problemi con i metodi pubblicati in precedenza per quanto riguarda l'efficienza e la disponibilità di tessuti freschi per una più ampia gamma di applicazioni a valle.

Abstract

I metodi precedenti per il tessuto prostatico biobancario, a seguito della prostatectomia radicale, generalmente prevedevano il campionamento casuale. Al fine di aumentare l'efficienza e consentire una maggiore gamma di applicazioni a valle, è stato sviluppato un metodo più mirato di campionamento del tessuto prostatico. Qui utilizziamo sia la risonanza magnetica (RM) che i dati di biopsia per indirizzare aree specifiche dell'organo per il campionamento. Il metodo prevede l'uso di un dispositivo di affettare la prostata pubblicato in precedenza che rimuove una fetta trasversale di 5 mm da una regione predeterminata della prostata, seguita dalla rimozione di biopsie di punzone da 6 mm da aree predeterminate di questa fetta. Questi campioni possono essere conservati congelati o fissati per scopi di biobanking, o utilizzati immediatamente con 70% di fiducia del contenuto di tumore, rispetto al 10% di fiducia dall'approccio di campionamento casuale. Ciò consente l'uso di tutte le tecniche standard a valle come genomica, proteomica o lavoro istologico, ma anche lavoro che richiede tessuti freschi come l'imaging dei tessuti vivi o la coltura ex vivo.

Introduzione

L'accesso al tessuto del cancro della prostata umana di alta qualità è un requisito fondamentale per guidare una ricerca efficace nel settore. Ci sono una serie di metodi esistenti per campionare il tessuto della prostata a seguito della prostatectomia radicale per la ricerca. Tipicamente questi implicano l'uso di biopsie di punzone per prelevare campioni casuali da una fetta fresca, congelata o fissa di tessuto prostatico, e confermare retrospettivamente se il tumore è presente o meno in ogni campione da ematossia & eosina (H&E) come uropatologo^1,2,3,4,5. Una recente revisione ha compilato una panoramica di questi metodi esistenti⁶. Questi metodi sono utili per alcune applicazioni a valle, in cui i tessuti possono essere immagazzinati e valutati per il contenuto di tumore in un secondo momento, come analisi genomiche su larga scala come l'International Cancer Genome Consortium (ICGC) e The Cancer Genome Atlas (TCGA) ^4,7. Tuttavia, questi metodi potrebbero essere migliorati se utilizzassimo la risonanza magnetica (RMI) e/o i dati di biopsia per indirizzare aree specifiche della prostata per il campionamento. Ciò migliorerebbe la metodologia in due modi; in primo luogo, riducendo il numero di campioni di tessuto raccolti, aumentando l'efficienza e riducendo la pressione sui reparti di patologia e sui costi di conservazione, e in secondo luogo, consentendo l'uso immediato dei tessuti freschi senza la necessità di una conferma immediata contenuto tumorale, per nuove tecnologie a valle all'avanguardia come l'imaging dei tessuti vivi, la generazione di organoidi o la cultura ex vivo. Questa esigenza di ricerca ha portato allo sviluppo del metodo PEOPLE (PatiEnt prOstate samPLes for rEsearch) e i risultati dei primi 84 casi biobancari con PEOPLE sono stati recentemente pubblicati⁸. Una variazione di questo metodo è stata pubblicata anche con un apparato di taglio tridimensionale (3D) stampato e stampo specifico del paziente, al fine di facilitare la risonanza magnetica ex vivo sul tessuto pre e post-fissazione^9,10.

Protocollo

Il protocollo aderisce alle linee guida locali ed è approvato dal Comitato Etico della Ricerca Biobanca UCL/UCLC (riferimento 15/YH/0311).

NOT: Poiché questo metodo comporta il campionamento del tessuto umano, tutte le procedure locali relative all'etica e al consenso devono essere osservate prima dell'inizio del protocollo. I casi di prostatectomia radicale possono essere inclusi se sono disponibili sia dati di risonanza magnetica che biopsia prima dell'intervento chirurgico, con diametro del tumore di 5 mm. I casi dovrebbero essere esclusi se la lesione dell'indice non è ben definita, cioè solo i cambiamenti diffusi sono visibili dalla risonanza magnetica.

1. Apparato di affettazione della prostata

1. Acquistare l'apparato di affettatura della prostata (Tabella dei materiali). In alternativa, stampare una maniglia a lama utilizzando una stampante 3D come pubblicato in precedenza¹⁰.
   NOT: Il dispositivo e le lame usa e getta utilizzate qui sono stati acquistati in base a un accordo di trasferimento materiale dall'Institute of Cancer Research, Londra, Regno Unito.

2. Targeting del tumore

1. Esaminare le note cliniche per identificare la lesione dell'indice come indicato dalla biopsia diagnostica, ad esempio, lasciata posteriore.
2. Rivedere le immagini DELLA risonanza magnetica per misurare la posizione del tumore di cui sopra.
   1. Trova la sequenza in cui il tumore è più visibile nel piano assiale, ad esempio, pesato in T2.
   2. Scorrere le immagini assiali per trovare l'immagine in cui il tumore è più grande e stampare l'immagine per riferimento.
   3. Nell'immagine coronale corrispondente, misurare la distanza dalla base della prostata alla posizione assiale selezionata e l'intera lunghezza della prostata da apice a base (mm), e stampare per riferimento.

3. Collezione di pProstate

1. Controllare le note del paziente per assicurarsi che sia stato ottenuto il consenso informato appropriato per questa procedura e per eventuali applicazioni di ricerca a valle.
2. Dopo la prostatectomia radicale, raccogliere la prostata in una pentola asciutta. Assicurarsi che nessuna formalina o altro fissativo sia stato aggiunto alla prostata.
3. Trasferire in un luogo sterile adatto per il campionamento, ad esempio una cappa di flusso laminare in un laboratorio di patologia.
4. Procedere al campionamento il prima possibile se è necessario un tessuto fresco.
   NOT: Per alcune applicazioni (ad esempio, la valutazione del DNA che non dovrebbe degradarsi con la stessa rapidità dell'RNA), può essere opportuno refrigerare il campione e prelevare campioni il giorno successivo.

4. Preparazione degli esemplari

1. Preparare la cappa a flusso laminare e l'apparato di affettatura della prostata secondo le procedure locali di decontaminazione, utilizzando una tecnica sterile. Qui, spruzzare 70% etanolo e pulire su tutte le superfici. Utilizzare aghi e bisturi sterili monouso. Utilizzare lame affettatrice fino a tre volte; lavare dopo ogni uso in acqua calda saponata, quindi spruzzare e pulire con 70% etanolo.
2. Pesare la prostata (g) utilizzando una scala standard.
3. Inchiostrate la prostata. Dipingi il lato sinistro con l'inchiostro blu e il lato destro con l'inchiostro nero. Coprire la capsula completa e le vesciche seminali con inchiostro per denotare successivamente i margini chirurgici.
   NOT: Le procedure di input penna possono variare localmente e possono essere modificate di conseguenza.

5. Affettare la prostata

1. Assemblare l'apparato di taglio inserendo le pareti perpendicolarmente nella base del supporto (Figura 1A).
2. Posizionare la prostata in modo che la base e l'apice siano rivolte alle pareti opposte, con il lato posteriore verso il basso e l'anteriore verso l'alto. Posizionare perni d'oro intorno alla prostata. Spingere la prostata verso l'interno leggermente se necessario per ottenere una vestibilità aderente, che sosterrà la prostata durante il taglio.
3. Misurare la lunghezza della prostata dalla base all'apice, utilizzando un righello, e confrontare con la lunghezza della prostata misurata dalla risonanza magnetica. Se la prostata si è rimpicciolita, applicare una correzione ad hoc alla distanza prevista dalla base alla sezione trasversale bersaglio. Ad esempio, se l'intera lunghezza della prostata nell'immagine MRI è 50 mm, ma se misurata con un righello a questo punto si è ridotto a 45 mm, ridurre la posizione di taglio prevista del 10%.
4. Misurare dalla base alla sezione trasversale desiderata. Scegliere il perno più vicino a questa misura da tagliare.
5. Indossando guanti a catena per prevenire lesioni, tenere il dispositivo di affettare (Figura 1B), posizionare le lame su entrambi i lati del perno identificato e utilizzare il distanziale per tenere le lame di distanza di 5 mm. Prendere fetta muovendo lentamente e saldamente le lame verso il basso, avanti e indietro con lunghi tratti (Figura 1C). Assicurarsi che una fetta completa sia stata separata prima di smontare l'apparato.
6. Rimuovere pareti e perni e portare con cura la fetta su un foglio sterile di cartone di sughero utilizzando guanti.

6. Campionamento dei tessuti

1. Ispezionare visivamente la sezione trasversale e confrontarla con l'immagine di risonanza magnetica assale. In alcuni casi, l'area del tumore può apparire più pallida del tessuto circostante.
2. Palpate delicatamente la fetta trasversale. In alcuni casi, il tumore può sentirsi più solido del tessuto circostante.
3. Utilizzando l'immagine RM assiale come guida, selezionare una o più aree per il campionamento.
4. Prendere punzoni biopsia di area desiderata di tessuto.
   1. Utilizzando un punzone di 6 mm, spingere verso il basso l'area desiderata del tessuto.
   2. Ruotare il punzone tissutale sul punto e giù contro il tappo per garantire la piena separazione e utilizzare un bisturi affilato per separare se necessario.
   3. Rimuovere il punzone e metterlo in tubi / stampi come necessario espellendo utilizzando lo stantuffo.
   4. Ripetere per ulteriori campioni tumorali e benigni come richiesto, con punzoni di biopsia sterile separati. Inchiostrare i fori dove sono stati presi i punzoni in rosso.
   5. Si noti la posizione di ogni punzone insieme al peso della prostata e a eventuali osservazioni sul colore/società del tessuto.

7. Presentazione della prostata per la diagnostica locale

1. Pin la prostata a sughero con sterili aghi monouso prima della fissazione al fine di prevenire il restringimento e la deformazione del tessuto, che potrebbe alterare l'aspetto dei margini chirurgici.
2. Dopo aver aggiunto il tappo al sughero, sottoporre la prostata al reparto di istopatologia per la diagnostica clinica standard.

8. Decontaminazione dell'apparato

1. Eliminare tutte le attrezzature monouso nei flussi di rifiuti biomedici e/o nei contenitori taglienti come designati localmente.
2. Decontaminare il cofano del flusso laminare e l'apparato di affettatura della prostata in conformità con le valutazioni del rischio locali appropriate al tessuto umano (ad esempio, spruzzando con 70% EtOH e pulendo).

Risultati

Il tessuto della prostata fresco campionato utilizzando il metodo PEOPLE può essere utilizzato per una varietà di tecniche a valle, tra cui il sequenziamento genomico e la coltura ex vivo. I primi 59 casi campionati con questo metodo sono stati precedentemente pubblicati rispetto a una versione precedente del metodo, insieme ai dati iniziali a valle⁸. Il tempo che doveva affettare per la prima volta la prostata al congelamento/fissaggio delle biopsie di punzone qui era di circa 1 min, che è stato ridotto al minimo per evitare la degradazione dell'RNA. Anche il tempo dalla rimozione della prostata al taglio della prostata dovrebbe essere ridotto al minimo, anche se qui questo ha richiesto circa 20 min a causa del nostro teatro e dei laboratori di patologia che si trovain in luoghi diversi.

A seconda dell'applicazione a valle, in genere vengono prelevati almeno due campioni: uno da un'area del tessuto tumorale previsto e uno da un'area del tessuto benigno previsto. La misura chiave del successo per il metodo di campionamento stesso è quella di valutare il contenuto di tumore in un dato campione.

Per l'ingresso nel progetto 100.000 genomi, una sezione di tessuto colorato H&E deve essere valutata da un uropatoelogo e il campione deve contenere almeno il 40% di cellule tumorali. I campioni che contengono meno del 40% di tumore possono ancora essere inclusi nel progetto se sono macrodisseced con successo. Dei primi 92 casi campionati in questo modo, il 64% conteneva almeno il 40% di tumore e veniva sottoposto al Progetto 100.000 Genomes senza macrodisezione. Il DNA è stato estratto ed era di quantità e qualità sufficienti in tutti i casi(Tabella 1). Un sottoinsieme iniziale di 59 di questi campioni è stato precedentemente pubblicato rispetto a un metodo precedente⁸.

Per la coltura ex vivo, il tumore abbinato e il tessuto benigno devono essere di qualità sufficiente a resistere alla coltura di 72 h senza degradazione significativa. Più campioni di tessuto provenienti da un totale di tre pazienti sono stati coltivati con successo⁸.

Figura 1: Apparato di affettatura della prostata. Questo apparato è stato ottenuto in base a un accordo di trasferimento materiale dall'Istituto di ricerca sul cancro. (A) Le pareti vengono inserite perpendicolarmente alla base e i perni d'oro vengono inseriti nella base che circonda la prostata (prostata non raffigurata). (B) Le lame parallele sostituibili vengono inserite nella maniglia della lama. (C) Le lame passano tra i perni d'oro per tagliare una sezione di 5 mm della prostata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

	n (%)
Hit (>40% tumore)	59 (64%)
Colpo parziale (5-30% tumore)	6 (7%)
Manca (0% tumore)	27 (29%)
totale	92 (100%)

Tabella 1: tasso di battito del tumore. Il tasso di successo del tumore è stato determinato da un patologo consulente specializzato nel cancro alla prostata, dopo la revisione del tessuto macchiato H&E. Il contenuto di cellule tumorali di >40% è stato determinato per essere adatto per l'inclusione nel progetto 100,000 Genomes, secondo le linee guida di Genomica Inghilterra.

Discussione

I passaggi critici all'interno di questo protocollo includono l'identificazione della regione tumorale per il campionamento, la misurazione della prostata e il campionamento dei tessuti. In primo luogo, la misurazione della risonanza magnetica per identificare l'area corretta del campionamento è fondamentale. Dimostriamo questo metodo nel video di accompagnamento; tuttavia, consigliamo anche di confermare le misurazioni con un radiologo in primo luogo. Note cliniche chiare che puntano il ricercatore verso l'area delle immagini DI risonanza magnetica che contiene la lesione dell'indice sono l'ideale. In secondo luogo, la misurazione della prostata deve essere effettuata con cura, assicurando che il righello sia tenuto ad angolo per misurare l'intera lunghezza dalla base all'apice, parallelamente all'anteriore della prostata. In terzo luogo, le aree tumorali devono essere confermate prima del campionamento ispezionando visivamente la fetta di tessuto in relazione all'immagine RM originale, palpando il tessuto (in alcuni casi l'area tumorale può sentire più densa), e valutando visivamente il colore del tessuto (in alcuni casi il tumore apparirà più pallido del tessuto benigno circostante).

Questo protocollo è stato effettuato per intero presso l'UCL/UCLH da ricercatori post-dottorati non clinici, un borsista di patologia, consulenti di patologia e tecnici di ricerca. Nella nostra esperienza tutte le fasi del protocollo possono essere apprese in meno di dieci casi indipendentemente dal background tecnico. Tuttavia, consigliamo la formazione di un radiologo per quanto riguarda la misurazione della risonanza magnetica e la formazione da un patologo per quanto riguarda il taglio in primo luogo. Il protocollo può essere modificato utilizzando un quadratino di ridimensionamento stampato in 3D, come pubblicato in precedenza¹⁰.

Le potenziali limitazioni della tecnica includono il rischio di ostacolare la diagnosi. Affettare la prostata è un passo fondamentale, che potrebbe ostacolare la classificazione o i tassi di margine positivi se fatto in modo non corretto. Ci sono due potenziali problemi qui. In primo luogo, se tutta la lesione dell'indice viene rimossa e utilizzata immediatamente per la sperimentazione dei tessuti freschi, la diagnostica clinica di routine non verrà eseguita per questa lesione e il paziente potrebbe essere erroneamente diagnosticato come aventi un cancro di grado inferiore. Per evitare questo, il ricercatore dovrebbe discutere il piano di campionamento con il patologo consulente che esaminerà regolarmente il caso, prima del campionamento, e concordare il numero e la posizione dei campioni da prelevare. Piccoli tumori possono essere esclusi localmente per questo motivo. In secondo luogo, se la capsula prostatica non è appuntata correttamente alla scheda di sughero prima della fissazione, questo potrebbe consentire al tessuto interno di rigonfiarsi verso l'esterno durante la fissazione, alterando i margini chirurgici. Questo potrebbe portare a un margine falso positivo, dove il tumore rimanente sembra risiedere nella capsula esclusivamente a causa della deformazione del tessuto.

L'importanza di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti risiede principalmente nel targeting per tumori. Fino ad oggi è stata pubblicata una serie di metodi per il campionamento di campioni di prostatectomia radicale; tuttavia, tutti questi si basano su un approccio di campionamento completamente o parzialmente casuale^{1,2,3,4,5,6,7}. L'uso della biopsia e in particolare dei dati di risonanza magnetica qui ha migliorato l'efficienza, consentendo un campionamento ridotto con maggiore fiducia nell'ottenere il tessuto tumorale⁸.

Le future applicazioni di questo metodo consentono l'adozione di una gamma più ampia di tecniche a valle rispetto ai metodi di campionamento precedenti. Ad esempio, la disponibilità di tessuto fresco che ha un'alta probabilità di essere tumore significa che possono essere utilizzate tecniche di tessuto fresco più costose e/o ad alta intensità di lavoro, poiché molti campioni non sono necessari per garantire la presenza di tumore. Questo può includere e non è limitato a, cultura ex vivo, ex vivo MRI, imaging avanzato e trascrittomica.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 mm biopsy punch	Fisher Scientific	13404607	Disposable biopsy punches for removing 6 mm tissue samples
Black Ink	Leica Biosystems	3801753	Tissue marking & margin dye
Blue Ink	Leica Biosystems	3801751	Tissue marking & margin dye
Chainmail hand glove	Arco	1456803	Chainmail gloves to protect hand during slicing
Cork board	Fisher Scientific	12396447	Cork board for pinning prostate to following sampling procedure
Needles	SLS (Scientific Laboratory supplies)	SYR6112	Sterile needles to use to pin tissue to cork board following sampling
Prostate slicing aparatus	Insitute of Cancer Research, London	NA - must be obtained under MTA	A kit containing the slicer handle, blades, spacer, base, walls and pins