Analisi per l'integrità della barriera del cervello edelico nella Drosophila melanogaster

Riepilogo

L'integrità della barriera emato-encefalica è fondamentale per la funzione del sistema nervoso. Nella Drosophila melanogaster, la barriera emato-encefalica è formata da cellule gliali durante l'embriogenesi tardiva. Questo protocollo descrive i metodi per la formazione e la manutenzione delle barriere emato-encefalice negli embrioni di D. melanogaster e delle larve instar terze.

Abstract

Un corretto sviluppo del sistema nervoso include la formazione della barriera emato-encefalica, la barriera di diffusione che regola strettamente l'accesso al sistema nervoso e protegge il tessuto neurale dalle tossine e dagli agenti patogeni. I difetti nella formazione di questa barriera sono stati correlati con le neuropatie, e la ripartizione di questa barriera è stata osservata in molte malattie neurodegenerative. Pertanto, è fondamentale identificare i geni che regolano la formazione e il mantenimento della barriera emato-encefalica per identificare potenziali bersagli terapeutici. Per comprendere i ruoli esatti che questi geni svolgono nello sviluppo neurale, è necessario testare gli effetti dell'espressione genica alterata sull'integrità della barriera emato-encefalica. Molte delle molecole che funzionano nella creazione della barriera emato-encefalica sono state trovate per essere conservate attraverso le specie eucariotiche, tra cui la mosca della frutta, Drosophila melanogaster. I moscerini della frutta hanno dimostrato di essere un ottimo sistema modello per esaminare i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso. Questo protocollo descrive una procedura passo-passo per testare l'integrità della barriera emato-encefalica durante le fasi embrionali e larve dello sviluppo di D. melanogaster.

Introduzione

Durante lo sviluppo, la comunicazione cellulare-cellula e le interazioni sono fondamentali per la creazione della struttura e della funzione dei tessuti e degli organi. In alcuni casi, queste interazioni cellula-cellula sigillano gli organi dall'ambiente circostante per garantire la corretta funzione dell'organo. Questo è il caso del sistema nervoso, che è isolato dalla barriera emato-encefalica (BBB). La disfunzione della BBB nell'uomo è stata collegata a disturbi neurologici tra cui l'epilessia, e la rottura della barriera è stata osservata nelle malattie neurodegenerative tra cui la sclerosi multipla e la sclerosi laterale amiotrofica¹. Nei mammiferi, la BBB è formata da strette giunzioni tra le cellule endoteliali^2,3. Altri animali, tra cui la mosca della frutta, Drosophila melanogaster, hanno un BBB composto da cellule gliali. Queste cellule gliali formano una barriera selettivamente permeabile per controllare il movimento di sostanze nutritive, prodotti di scarto, tossine e grandi molecole dentro e fuori il sistema nervoso⁴. Ciò consente la manutenzione del gradiente elettrochimico necessario per sparare potenziali di azione, consentendo la mobilità e la coordinazione⁴. In D. melanogaster, la glia proteggere il sistema nervoso dal potassio-ricco, emolymph sangue-come⁵.

Nel sistema nervoso centrale (CNS) e nel sistema nervoso periferico (PNS) di D. melanogaster, due strati gliali esterni, la glia subperineuriale e la glia perineuriale, così come una rete esterna di matrice extracellulare, la lamella neurale, formano barriera emolymph-brain e emolymph-nerve⁶, indicata come BBB in tutto questo articolo. Durante lo sviluppo glia subperineurial diventano poliploidi e ingrandiscono per circondare il sistema nervoso^{5,6,7,8,9,10,11} . La glia subperineuriale forma giunzioni di septate, che forniscono la barriera di diffusione principale tra l'emolina e il sistema nervoso^5,6,12. Queste giunzioni sono molecolarmente simili alle giunzioni simili a septate che si trovano nei paranodi della glia mielinata nei vertebrati, e svolgono la stessa funzione delle giunzioni strette nella BBB dei mammiferi^{13,14, 15} Mi lasa del sistema ^{, 16 , 17.}La glia perineuriale si divide, cresce e avvolge la glia subperineuriale per regolare la diffusione di metaboliti e grandi molecole^6,10,18,19. La formazione di BBB è completata da 18,5 h dopola deposizione delle uova (AEL) a 25 . Studi precedenti hanno identificato geni che sono regolatori critici della formazione di BBB^20,21,22. Per comprendere meglio i ruoli esatti di questi geni, è importante esaminare l'effetto della mutazione di questi potenziali regolatori sull'integrità BBB. Mentre studi precedenti hanno delineato approcci per affermare l'integrità della BBB negli embrioni e nelle larve, un protocollo completo per questo test deve ancora essere descritto^5,7. Questo protocollo passo-passo descrive i metodi per il test di integrità BBB durante gli stadi della larva embrionale e terza nella stella di D. melanogaster.

Protocollo

1. Raccolta di campioni

1. Raccolta di embrioni
   1. In ogni gabbia di raccolta embrionale, usa un minimo di 50 femmine vergini con 20-25 maschi per le collezioni. Incubare queste mosche in una bottiglia con cibo di farina di mais-agar (Tabella dei Materiali) per 1/2 giorni prima di iniziare le collezioni²³.
      NOT: È possibile utilizzare più mosche, ma il rapporto femminile-maschio deve essere mantenuto a 2:1.
   2. Piatti preriscaldati di succo di mela (Tabella 1) a 25 gradi durante la notte.
      NOT: Ciò è necessario per una corretta messa in scena degli embrioni. Se le piastre si stanno asciugando rapidamente, aggiungere una ciotola con acqua all'incubatrice per aumentare l'umidità della camera.
   3. Anestesizza le mosche dal passo 1.1.1 con CO₂ e trasferizza in una gabbia di raccolta. Mettere un piatto di agar di succo di mela preriscaldato con un piccolo striscio di pasta di lievito all'estremità aperta e fissarlo alla gabbia con la manica rossa (Tabella dei Materiali). Per eliminare gli embrioni più vecchi, consentire alle mosche di deporre embrioni/uova su un piatto di agar di succo di mela per 1 h a 25 gradi centigradi.
   4. Togliere la gabbia di raccolta dall'incubatrice. Invertire il lato della rete della gabbia verso il basso e toccare vola verso il basso fino alla parte inferiore della gabbia. Sostituire l'agar di succo di mela con un nuovo piatto di agar preriscaldato con un piccolo svasatura di pasta di lievito. Scartare il primo piatto.
   5. Lasciare che le mosche depongano gli embrioni/uova sul nuovo piatto di agar di succo di mela per 1 h a 25 gradi centigradi. Scartare questa piastra dopo la raccolta di 1 h e procedere alla fase successiva per raccogliere gli embrioni per l'iniezione.
   6. Per raccogliere i 17 embrioni della fase tardiva (20-21 h AEL), permettete alle mosche del genotipo desiderato dai passi 1.1.1.1.5 di posare su un nuovo piatto di agar preriscaldato con un piccolo striscio di pasta di lievito a 25 gradi centigradi per 1 h. Piastra di età per 19 h in un incubatore di 25 gradi centigradi , quindi gli embrioni avranno 20/21 h di età al momento dell'imaging.
      NOT: Questo passaggio può essere ripetuto come desiderato per più cicli di raccolta del campione, iniezione e imaging.
   7. Raccogliere gli embrioni dalle piastre in un colino cellulare con una rete di nylon di 70 m aggiungendo una salina tamponata di fosfati (PBS) con 0,1% di surfactant nonionico (PBTx; Tabella 1) per coprire la superficie della piastra e allentare gli embrioni dalla superficie utilizzando un pennello.
   8. Embrioni dechorionati raccolti nel colino cellulare in una soluzione di candeggina al 50% (Tabella 1) in una piastra Petri da 100 mm per 5 min con agitazione occasionale a temperatura ambiente. Risciacquare gli embrioni 3x ruotando il colino cellulare in PBTx in un piatto Petri, utilizzando ogni volta un piatto fresco di PBTx.
   9. Se tutti gli embrioni sono del genotipo corretto, procedere direttamente al passaggio 1.1.10. Se la generazione di embrioni del genotipo corretto richiede una croce con mosche eterozigole, selezionare gli embrioni del genotipo corretto utilizzando la presenza o l'assenza di cromosomi bilanciatori marcati fluorescente. Utilizzare uno stereoscopio con capacità fluorescenti per la selezione del genotipo.
      NOT: Cromosomi bilanciatori contrassegnati con proteina fluorescente deformata-gialla; Kruppel-Gal4, proteina fluorescente verde UAS (GFP); e torsione-Gal4, UAS-GFP funzionano bene per la selezione del genotipo nella tarda embriogenesi (Tabella 2)^24,25,26.
   10. Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire gli embrioni in PBTx a una lastra di gel di agarose del 2%(Tabella 1). Rimuovere il liquido in eccesso con carta da filtro. Allineare gli embrioni di 6-8 dollari sulla lastra di gel di agarose del 2% con il posteriore a destra e il lato dorsale rivolto verso l'alto (Figura 1B).
       NOT: La micropirle, il piccolo foro attraverso il quale gli spermatozoi entrano nell'uovo, si trova all'estremità anteriore dell'embrione. L'estremità posteriore è più arrotondata. La trachea appare bianca e si trova dorsalmente nell'embrione, consentendo la distinzione dei lati dorsale e ventrale dell'embrione (Figura 1B).
   11. Preparare uno scivolo con un pezzo di nastro adesivo. Premere saldamente il vetrino sulla parte superiore degli embrioni per trasferirli sul nastro a due lati.
   12. Desiccate gli embrioni per incubazione a temperatura ambiente per 25 min (non viene utilizzato alcun disint). Dopo la disidratazione, coprire gli embrioni con olio di alocarbonio.
       NOT: I periodi di desciccazione possono variare a seconda della temperatura, dell'umidità e della ventilazione nella stanza. Il periodo di incubazione deve essere utilizzato per impostare l'apparecchio per l'iniezione e il microscopio confocale per l'imaging, come descritto nelle sezioni 2 e 3 di questo protocollo.
2. Raccolta larva
   1. Impostare una croce con 5-10 mosche femmine vergini del genotipo desiderato e la metà di altrettanti maschi del genotipo desiderato in una fiala con cibo di farina di mais-agar e incubare a 25 c²³.
   2. Dopo 5/7 giorni, a seconda del genotipo, raccogli le larve erranti della terza stella dalla fiala delicatamente con le pinze. Risciacquare le larve in 1x PBS per rimuovere il cibo attaccato alle larve. Trasferire le larve a un piatto di agar succo di mela per genotipine come descritto al punto 1.1.9 se necessario.
   3. Rotolare le larve su un tessuto utilizzando un pennello per asciugarli. Trasferisci le larve di 6-8 su uno scivolo preparato con nastro adesivo fronte/retro usando pinze.

2. Preparazione di aghi e iniezione di campioni

1. Estrarre gli aghi su un estotraine a micropipette prima dell'avvio di questo protocollo. Fissare i tubi capillari nell'aghieretto e tirare secondo la forma dell'ago standard e i parametri per le iniezioni di D. melanogaster (Tabella 3)²⁷. Conservare gli aghi in un piatto Petri ancorando in argilla fino all'uso per l'iniezione.
2. Caricare un ago con 5 10 kDa dextran coniugato al sulforhodamina 101 cloruro acido (Tabella dei materiali) utilizzando una punta di pipetta da 20 litri a carica gel durante il periodo di disidratazione di 25 minuti per gli embrioni (passaggio 1.1.12), o immediatamente dopo il trasferimento di larve alla diapositiva (passaggio 1.2.3).
3. Caricare l'ago in un porta ago e la posizione in un micromanipolatore fissato a una base in acciaio (Tabella dei materiali).
   NOT: L'ago deve essere quasi parallelo allo stadio del microscopio per l'iniezione di embrioni e inclinato leggermente verso il basso per le iniezioni larvali.
4. Impostare l'apparato di iniezione (Tabella dei materiali) a 50 psi, 5,10 ms con un intervallo di 10.
   NOT: Potrebbe essere necessario modificare queste impostazioni per il particolare apparato di iniezione utilizzato.
5. Posizionare la diapositiva sul palco e il bordo del pennello dell'ago sul bordo del nastro a due lati ad un angolo di 45 gradi per creare una punta angolata e rotta.
   NOT: Per gli embrioni è solo necessario rompere la punta abbastanza per consentire il flusso del 10 kDa dextran. Un ago perfetto ha una punta leggermente angolata e solo una piccola goccia di tinenza uscirà ad ogni iniezione. Per le larve, è necessario rompere la punta più, ma con una punta angolata per penetrare la parete del corpo larvale. Una goccia più grande di tine verrà fuori.
6. Pompare il pedale del piede fino a quando il tinri è sulla punta dell'ago.
7. Allineare l'ago in modo che sia parallelo con l'embrione o inclinato leggermente verso il basso verso la larva.
8. Spostare l'ago per forare l'estremità posteriore del campione e iniettare il campione pompando il pedale del piede. Iniettare 2 nL di tintura negli embrioni e 220 nL di tinture nelle larve.
   NOT: L'embrione o la larva deve inondare di tinrio se l'iniezione ha successo.
9. Si noti il tempo di iniezione per scopi di incubazione. Incubare gli embrioni per 10 min a temperatura ambiente. Incubare le larve per 30 min a temperatura ambiente.
10. Continuare lungo il vetrino per iniettare campioni aggiuntivi, notando il tempo di iniezione per ogni campione.
    NOT: A seconda della velocità con cui è possibile eseguire i passaggi di dissezione e di imaging successivi, è possibile iniettare alla volta campioni di 4,8 esemplari.

3. Preparazione di campioni per l'imaging

1. Imaging di embrioni
   1. Dopo l'iniezione, preparare gli embrioni per l'imaging. Applicare la gelatina di petrolio con un applicatore con punta di cotone sui lati destro e sinistro dei campioni sul vetrino come distanziale per evitare danni agli embrioni al momento del posizionamento del coperchio.
   2. Esempi di immagini che utilizzano un microscopio confocale per tutta la profondità dell'embrione con un obiettivo 20x. Calcolare la percentuale di campioni totali con tintura osservata nel cordone nervoso ventrale (VNC) utilizzando la seguente equazione: % di campioni con BBB compromessa - Numero di campioni con accumulo di tinture nel VNC/numero totale di campioni analizzati.
2. Dissezione e imaging delle larve
   1. Preparare i vetrini per i campioni larvali in anticipo. Montare due coprilabbra distanziate di circa 0,5 cm l'una dall'altra fino allo scivolo con smalto.
      NOT: I copricoperture funzionano come distanziali per il cervello, quindi non è danneggiato durante il processo di montaggio.
   2. Dopo l'incubazione di 30 min, sezionare le larve in 1x PBS direttamente sul vetrino che verrà utilizzato nell'imaging. In primo luogo, utilizzare una coppia di pinze per afferrare la larva a metà del corpo larvale e utilizzare una seconda coppia di pinze per separare le metà anteriori e posteriori della larva.
   3. Successivamente, utilizzare una coppia di pinze per afferrare la regione anteriore ai ganci della bocca e utilizzare una seconda coppia di pinze per invertire la parete del corpo sopra la punta delle pinze che afferrano i ganci della bocca. Il cervello e il VNC saranno esposti.
   4. Separare il cervello e il VNC dalla parete del corpo recidendo i nervi e rimuovere la parete del corpo dal vetrino (Figura 1C,D). Se lo si desidera, rimuovere i dischi immaginari.
   5. Coprire il campione con 10 luna dell'80% di glicerolo e posizionare un coperchio sopra il campione per l'imaging.
   6. Immagine attraverso la profondità del tessuto del sistema nervoso utilizzando un obiettivo 20x. Calcolare la percentuale di campioni totali con il tinrito osservato nel VNC.

Risultati

I metodi qui descritti consentono la visualizzazione dell'integrità della BBB in tutto il CNS in embrioni e larve di D. melanogaster (Figura 1). Al termine della formazione di BBB nella tarda embriogenesi, il BBB funziona per escludere grandi molecole dal cervello e VNC⁵. Questo protocollo sfrutta questa funzione per affermare la formazione di BBB. Quando furono iniettati embrioni di tipo selvaggio (Oregon R) in fase avanzata 17 (20-21 h- ) con 10 kDa dextra...

Discussione

Questo protocollo fornisce una descrizione completa dei passi necessari per testare l'integrità di BBB durante gli stadi larvali tardoembrionici e terzi instar dello sviluppo di D. melanogaster. Approcci simili sono stati descritti altrove per testare l'integrità della BBB durante lo sviluppo, così come nelle fasi adulte^5,7,29,30. Tuttavia, le descrizioni delle procedure nelle sezio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran	ThermoFisher Scientific	D1863	Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips	Eppendorf	22351656
100% Ethanol (200 proof)	Pharmco-Aaper	11000200
Active Dry Yeast	Red Star
Agar	Fisher Scientific	BP1423
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Air Compressor	DeWalt	D55140
Apple Juice	Mott's Natural Apple Juice
Bleach	Household Bleach		1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Bottle Plugs	Fisher Scientific	AS-277
Cell Strainers	BD Falcon	352350
Confocal Microscope	Olympus	FV1000	Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator	Puritan	19-062614
Double-Sided Tape 1/2"	Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip	Roboz	RS-5015
Fly Food Bottles	Fisher Scientific	AS-355
Fly Food Vials	Fisher Scientific	AS-515
Foot Pedal	Treadlite II	T-91-S
Gel Caster	Bio-Rad	1704422
Gel Tray	Bio-Rad	1704436
Glass Pipette	VWR	14673-010
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-1
Granulated sugar			Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil	Lab Scientific, Inc.	FLY-7000
Light Source	Schott	Ace I
Manipulator Stand	World Precision Instruments	M10
Micromanipulator	World Precision Instruments	KITE-R
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Needle Holder	World Precision Instruments	MPH310
Nightsea Filter Sets	Electron Microscopy Science	SFA-LFS-CY	For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head	Electron Microscopy Science	SFA-RB	For visualization of GFP
Paintbrush	Simply Simmons	Chisel Blender #6
Pipetter	Fisher Scientific	13-683C
Pneumatic Pump	World Precision Instruments	PV830	This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride	Fisher Scientific	BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Small Embryo Collection Cages	Genesee Scientific	59-100
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Steel Base Plate	World Precision Instruments	5052
Stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi 2000	Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source	Baytronix		Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester)	Genesee Scientific	20-258
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500	Nonionic surfactant
Vial Plugs	Fisher Scientific	AS-273